Bouw en evaluatie van een lymfkliertest Calvarial osteolyse Model door blootstelling aan CoCrMo deeltjes in aseptische losraken
Summary
Dit manuscript beschrijft een model lymfkliertest calvarial osteolyse door blootstelling aan CoCrMo deeltjes, die een ideale diermodel vormt voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes van slijtage en verschillende cellen in aseptische losraken.
Abstract
Slijtage deeltje-geïnduceerde osteolyse is een belangrijke oorzaak van aseptische losraken artroplastiek mislukking, maar het onderliggende mechanisme is onduidelijk. Als gevolg van lange follow-up nodig voor de detectie en sporadisch voorkomen, is het uitdagend om te beoordelen van de pathogenese ofparticle-geïnduceerde osteolyse in klinische gevallen. Vandaar, optimale dierlijke modellen zijn vereist voor verdere studies. De lymfkliertest model van calvarial osteolyse opgericht door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een effectieve en geldig instrument voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes en verschillende cellen in aseptische losraken. In dit model, werden CoCrMo deeltjes eerst verkregen door hoog-vacuüm drie-elektrode gelijkstroom en geresuspendeerde in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing met een concentratie van 50 mg/mL. Vervolgens werd 50 µL van de resulterende schorsing toegepast op het midden van de lymfkliertest snuituil na scheiding van de craniale beenvlies door scherpe dissectie. Na twee weken, de muizen werden opgeofferd en snuituil exemplaren zijn geoogst; kwalitatieve en kwantitatieve evaluaties werden uitgevoerd door de haematoxyline en eosine-kleuring en micro computertomografie. De sterke punten van dit model zijn eenvoud van de procedure, kwantitatieve evaluatie van botverlies, snelheid van osteolyse ontwikkeling, potentiële gebruik transgene of knock-out modellen, en een relatief lage prijs. Dit model kan echter niet worden gebruikt om te beoordelen van de mechanische kracht en chronische effecten van deeltjes in de aseptische losraken. Lymfkliertest calvarial osteolyse model gegenereerd door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een ideaal hulpmiddel voor de beoordeling van de interacties tussen slijtage deeltjes en verschillende cellen, bijvoorbeeld, macrofagen, fibroblasten, botcellen en osteoclasten, in aseptische losraken.
Introduction
Aseptische losmaken is de meest voorkomende oorzaak van totale heup artroplastiek (THA) en totale knie-artroplastiek (TKA) falen, waarvoor herziening chirurgie1. Het onderliggende mechanisme blijft echter onduidelijk2. Een lange follow-up is nodig voor de detectie van deeltje-geïnduceerde osteolyse, wiens optreden zeldzaam is; dus is het uitdagend om te verkennen zijn pathogenese in klinische gevallen. Vandaar, verdere studies gericht op complexe cellulaire en weefsel mechanismen vereisen dat zowel in vivo experimenten in deeltje-geïnduceerde osteolyse modellen en in vitro tests in cellen gerelateerde tot bone homeostase3dragen. Een geldige diermodel is belangrijk in de gevolgen van slijtage deeltjes voor botverlies, bewijze voor het verder cellulaire assays onthullen.
Een lymfkliertest calvarial osteolyse model gebouwd door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een doeltreffende en geldige methode voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes en verschillende cellen in aseptische losraken. In dit model veroorzaken CoCrMo deeltjes calvarial osteolyse door inducerende ontsteking cytokinen in macrofagen, activeren osteoclasten osteoblast proliferatie remmen en bevordering van osteoblast apoptosis.
Het duurt slechts twee weken om dit model. Osteolyse kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd door de haematoxyline en eosine (H & E) kleuring en micro berekend tomografie (micro-CT)2. Bovendien, heeft dit model een relatief lage kosten, en transgene en knockoutstadia muis modellen kunnen worden gebruikt om een groot aantal verbindingen op verschillende doses3scherm.
De procedure voor het vaststellen en evalueren van dit model is eenvoudig. Eerst werden CoCrMo deeltjes verkregen door hoog-vacuüm drie-elektrode gelijkstroom en geresuspendeerde in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een concentratie van 50 mg/mL. Vervolgens werd 50 µL van de resulterende schorsing toegepast op het midden van de lymfkliertest snuituil na scheiding van de craniale beenvlies door scherpe dissectie. De muizen werden opgeofferd na twee weken, en snuituil monsters zijn geoogst; kwalitatieve en kwantitatieve analyses werden uitgevoerd door H & E kleuring van andmicro-CT.
Een lymfkliertest calvarial osteolyse model gebouwd door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een ideaal hulpmiddel voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes CoCrMo en verschillende cellen, zoals macrofagen, fibroblasten en botcellen osteoclasten, in aseptische losraken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn twee belangrijkste methoden voor slijtage deeltje-geïnduceerde osteolyse in muizen: de lucht-etui-model en het model van calvarial osteolyse. Het model van de lucht-zakje, is een subcutaan gegenereerde lucht-etui eerst gevestigd, gevolgd door slijtage deeltje invoering en implantatie in het bot weefsel8. De muur zakje bootst het beenvlies in aseptische losraken. Bot-implantatie is echter nonvascular met geen biologische activiteit, waardoor het moeilijk te beoordelen van directe interacti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de nationale Natural Science Foundation van China (81572111), de Clinical Science en technologie Project Stichting van de oostelijke provincie Jiangsu (BL2012002), de wetenschappelijke onderzoek Project van Nanjing (201402007), de natuurwetenschappen Stichting van de provincie Jiangsu (BK20161385), en de speciale stichting van Chinese medische arts Association (2015COS0810).
Materials
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
References
- Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
- Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
- Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
- Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
- Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
- Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
- Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
- Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
- Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
- Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
- Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
- Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
- Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
- Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
