Summary

Bouw en evaluatie van een lymfkliertest Calvarial osteolyse Model door blootstelling aan CoCrMo deeltjes in aseptische losraken

Published: February 17, 2018
doi:

Summary

Dit manuscript beschrijft een model lymfkliertest calvarial osteolyse door blootstelling aan CoCrMo deeltjes, die een ideale diermodel vormt voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes van slijtage en verschillende cellen in aseptische losraken.

Abstract

Slijtage deeltje-geïnduceerde osteolyse is een belangrijke oorzaak van aseptische losraken artroplastiek mislukking, maar het onderliggende mechanisme is onduidelijk. Als gevolg van lange follow-up nodig voor de detectie en sporadisch voorkomen, is het uitdagend om te beoordelen van de pathogenese ofparticle-geïnduceerde osteolyse in klinische gevallen. Vandaar, optimale dierlijke modellen zijn vereist voor verdere studies. De lymfkliertest model van calvarial osteolyse opgericht door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een effectieve en geldig instrument voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes en verschillende cellen in aseptische losraken. In dit model, werden CoCrMo deeltjes eerst verkregen door hoog-vacuüm drie-elektrode gelijkstroom en geresuspendeerde in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing met een concentratie van 50 mg/mL. Vervolgens werd 50 µL van de resulterende schorsing toegepast op het midden van de lymfkliertest snuituil na scheiding van de craniale beenvlies door scherpe dissectie. Na twee weken, de muizen werden opgeofferd en snuituil exemplaren zijn geoogst; kwalitatieve en kwantitatieve evaluaties werden uitgevoerd door de haematoxyline en eosine-kleuring en micro computertomografie. De sterke punten van dit model zijn eenvoud van de procedure, kwantitatieve evaluatie van botverlies, snelheid van osteolyse ontwikkeling, potentiële gebruik transgene of knock-out modellen, en een relatief lage prijs. Dit model kan echter niet worden gebruikt om te beoordelen van de mechanische kracht en chronische effecten van deeltjes in de aseptische losraken. Lymfkliertest calvarial osteolyse model gegenereerd door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een ideaal hulpmiddel voor de beoordeling van de interacties tussen slijtage deeltjes en verschillende cellen, bijvoorbeeld, macrofagen, fibroblasten, botcellen en osteoclasten, in aseptische losraken.

Introduction

Aseptische losmaken is de meest voorkomende oorzaak van totale heup artroplastiek (THA) en totale knie-artroplastiek (TKA) falen, waarvoor herziening chirurgie1. Het onderliggende mechanisme blijft echter onduidelijk2. Een lange follow-up is nodig voor de detectie van deeltje-geïnduceerde osteolyse, wiens optreden zeldzaam is; dus is het uitdagend om te verkennen zijn pathogenese in klinische gevallen. Vandaar, verdere studies gericht op complexe cellulaire en weefsel mechanismen vereisen dat zowel in vivo experimenten in deeltje-geïnduceerde osteolyse modellen en in vitro tests in cellen gerelateerde tot bone homeostase3dragen. Een geldige diermodel is belangrijk in de gevolgen van slijtage deeltjes voor botverlies, bewijze voor het verder cellulaire assays onthullen.

Een lymfkliertest calvarial osteolyse model gebouwd door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een doeltreffende en geldige methode voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes en verschillende cellen in aseptische losraken. In dit model veroorzaken CoCrMo deeltjes calvarial osteolyse door inducerende ontsteking cytokinen in macrofagen, activeren osteoclasten osteoblast proliferatie remmen en bevordering van osteoblast apoptosis.

Het duurt slechts twee weken om dit model. Osteolyse kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd door de haematoxyline en eosine (H & E) kleuring en micro berekend tomografie (micro-CT)2. Bovendien, heeft dit model een relatief lage kosten, en transgene en knockoutstadia muis modellen kunnen worden gebruikt om een groot aantal verbindingen op verschillende doses3scherm.

De procedure voor het vaststellen en evalueren van dit model is eenvoudig. Eerst werden CoCrMo deeltjes verkregen door hoog-vacuüm drie-elektrode gelijkstroom en geresuspendeerde in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een concentratie van 50 mg/mL. Vervolgens werd 50 µL van de resulterende schorsing toegepast op het midden van de lymfkliertest snuituil na scheiding van de craniale beenvlies door scherpe dissectie. De muizen werden opgeofferd na twee weken, en snuituil monsters zijn geoogst; kwalitatieve en kwantitatieve analyses werden uitgevoerd door H & E kleuring van andmicro-CT.

Een lymfkliertest calvarial osteolyse model gebouwd door blootstelling aan CoCrMo deeltjes is een ideaal hulpmiddel voor de beoordeling van de interacties tussen deeltjes CoCrMo en verschillende cellen, zoals macrofagen, fibroblasten en botcellen osteoclasten, in aseptische losraken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Nanjing universiteit. 1. CoCrMo Particle voorbereiding Opvragen CoCrMo deeltjes met behulp van een kunstmatig hoog-vacuüm drie-elektrode gelijkstroom-4. Plaats CoCrMo legering in het instrument onder 10-3 Pa vacuüm, 0,04 MPa argon en waterstof 3:2 (v/v), en 650 A kathode huidige. Meet de diameter van de CoCrMo deelt…

Representative Results

De in-house geproduceerde nanoschaal CoCrMo deeltjes werden ongeveer 50 nm (3.56 standaardfout) in diameter, zoals gekwantificeerd door TEM (Figuur 2). Na Gasbedwelming met behulp van de muis calvarias CoCrMo deeltjes, de dieren (n = 6 per groep) twee weken voor een ander werden gehandhaafd. Binnen de twee weken, de calvarial incisie volledig genezen was, en de hechtdraad kan vallen. Een lokale infectie of nonunion mei bot verlies beoordeling beïnvloeden. Na…

Discussion

Er zijn twee belangrijkste methoden voor slijtage deeltje-geïnduceerde osteolyse in muizen: de lucht-etui-model en het model van calvarial osteolyse. Het model van de lucht-zakje, is een subcutaan gegenereerde lucht-etui eerst gevestigd, gevolgd door slijtage deeltje invoering en implantatie in het bot weefsel8. De muur zakje bootst het beenvlies in aseptische losraken. Bot-implantatie is echter nonvascular met geen biologische activiteit, waardoor het moeilijk te beoordelen van directe interacti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door de nationale Natural Science Foundation van China (81572111), de Clinical Science en technologie Project Stichting van de oostelijke provincie Jiangsu (BL2012002), de wetenschappelijke onderzoek Project van Nanjing (201402007), de natuurwetenschappen Stichting van de provincie Jiangsu (BK20161385), en de speciale stichting van Chinese medische arts Association (2015COS0810).

Materials

CoCrMo alloy from prosthesis Waldemar Link GmbH & Co GEMINI MK II Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice Model animal research center of Nanjing University N000013
100% Ethanol Nanjing Reagent C0691514023 Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD W603
Microanalytical balance Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD EX125DZH
Ultrasonic shaker Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD YH-200DH To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai G20
SimplePCI software Compix Inc. 6.6 version To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan QIULONGYIQI KYQL-100DS To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay Charles River R13025 To detect endotoxin 
15 ml Microcentrifuge tubes Taizhou Suyi Medical B122
Phosphate-buffered saline Boster Biological Technology AR0030 Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium Sigma P3761 To anesthetize mice
Normal saline SACKLER SR8572EP-15 To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol Nanjing Reagent C0691560275 Disinfection
Medical cotton ball Shuitao 1278298933 Disinfection
Shaver Kemei KM-3018 To shave the fur
Scissor RWD LIFE SCIENCE S12005-10 To incise skin
Suture RWD LIFE SCIENCE F34001-01 To suture skin
Needle holder RWD LIFE SCIENCE F33001-01 To suture skin
Needle RWD LIFE SCIENCE R14003-12 To suture skin
Vessel forceps RWD LIFE SCIENCE F22003-09 To suture skin
Scalpel RWD LIFE SCIENCE S31010-01 To harvest calvaria
Tweezers RWD LIFE SCIENCE F12006-10 To harvest calvaria
100 µL pipettes Eppendorf 3120000240 To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips AXYGEN T-200-Y To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD W621
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101 Fixation
Micro Computed Tomography  SkyScan SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Servicebio G1105 Decalcification
Paraffin Servicebio #0001
Paraffin slicing machine Leica RM2125RTS
Glass slide Servicebio G6004
Cover glass Servicebio 200
HE staining kit Servicebio #1-5 HE staining
Light microscope Nikon E200

References

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

Play Video

Cite This Article
Jiang, H., Wang, Y., Deng, Z., Jin, J., Meng, J., Chen, S., Wang, J., Qiu, Y., Guo, T., Zhao, J. Construction and Evaluation of a Murine Calvarial Osteolysis Model by Exposure to CoCrMo Particles in Aseptic Loosening. J. Vis. Exp. (132), e56276, doi:10.3791/56276 (2018).

View Video