在这里,我们提出一个框架,以宽范围饮食限制涉及基因表达和使用寿命。我们描述协议为宽范围限制饮食和定量成像的这个范式下的基因表达。我们进一步列出了计算分析,以揭示潜在的信息处理功能的基因电路参与食品遥感。
感官系统允许动物进行检测,处理,及对他们的环境作出反应。食物丰富度是环境的提示,有深远的影响,对动物生理和行为。最近,我们表明,长寿的秀丽隐杆线虫线虫的食物丰富度调制比以前认为的更复杂。寿命到食物水平变化的响应能力是由作用是通过控制信息处理内神经电路的特定基因决定的。我们的框架结合遗传分析、 高通量定量成像和信息理论。在这里,我们描述如何使用这些技术来描述任何具有宽范围限制饮食的生理相关性的基因。具体来说,此工作流被为了揭示如何感兴趣的基因调节寿命下宽范围限制饮食;然后建立基因的表达是如何随食物水平;和最后,提供的信息量客观的量化传达的关于食物丰富度环境中的基因表达。当几个基因同时神经电路的语境下,检查此工作流可以发现电路所采用的编码战略。
所有的有机体需要能够感知和响应变化的环境,以确保他们的生存。在动物中,中枢神经系统原发性探测器和换能器的有关环境的信息和协调对任何可能会影响生物的生存1的变化的生理反应。食物丰富度是环境的提示,在多个上下文中具有很好的研究,不仅调节食品相关的行为,如觅食2,而且也会影响长寿的动物。寿命的食物丰富度变化的调制是一种现象称为饮食限制 (DR) 和具有广泛的进化环境保育3。
秀丽隐杆线虫线虫是一个强大的模型系统为解决基本的生物学问题。大量的技术已经发展到了允许蠕虫病毒基因组,如编辑技巧的 RNAi 和体内基因操纵。小的物理尺寸的蠕虫和光学透明度也把自己借给体内成像的两个转录和翻译荧光记者和实用的高通量技术如微流体4。在一起,可以利用这些工具来检查如何神经电路直接动物行为。
线虫是 bacterivore 和几个已发表的方法,允许食物丰富度的精确控制,操纵8,细菌浓度5,,67.线虫研究社群,博士研究了在两个不同的上下文中。第一次可称之为 ‘古典博士’,它反映了在降低食品中其他生物的响应中看到的变化。在这方面,减少食物丰富度从随意水平导致了越来越多的使用寿命,直到达到最佳之后这点长寿随进一步减少食品6,7, 9。第二个背景下的线虫研究了博士是膳食剥夺蠕虫的寿命增加任何细菌的食物源10,11完全去除。在 Entchev 等人 (2015 年)12,我们表明博士因这两种不同范式的复杂性可以被审查同时语境下我们称之为 ‘宽范围博士’。通过使用协议概述如下,我们确定了一类新的基因参与博士那双向调节对食物丰富的寿命响应并参与感觉食物12 (图 1) 的神经回路。
动物对环境变化的响应集成链接到复杂的监管交互环境信息传达给生理感官系统的生物学过程的序列。虽然这种”信息流”的机械细节往往是未知的遗传的工具可以用于获得深入了解这个复杂的计算如何组织之间不同的生物成分。在我们最近的工作中,我们展示了daf 7和tph 1参与有关通过调节线虫12寿命食物传感神经电路的食物丰富的环境信息的传输,13.通过应用信息理论14的数学框架,我们就能够量化的环境信息,在位,由在daf 7和基因表达的变化表示 tph 1在跨不同食品级别的特定神经元。从这一点,我们当时无法揭示编码策略受雇于该神经回路和基因控制的方式 (图 2)。
在以下协议中,我们概述了解什么是基因的兴趣在特定神经元中表达的影响以及如何他们参与食品信息流向从环境到生命周期所需的步骤。广义地说,我们的框架分为两个实验和计算的工作流。实验方面,它是关键有突变的基因的兴趣,可以在宽范围下审查博士忠实转录记者也是必要的不同食品级基因的表达水平进行量化。能够进行了计算分析,讨论在我们的方法,数据集需要足够的尺寸,以便提供有意义的表达分布的估计。尽管我们为分析提供模板源代码,用户需要熟悉信息理论,广泛应用在我们计算框架的语言。源代码是 R 和 c + + 写的。因此,有一定的编程能力也是需要在有意义的方式加以应用的。
在这里,我们提出新方法封装广泛得多的食物浓度比以前发布协议的饮食限制。此方法链接两个以前单独现象见于线虫博士文学、 细菌剥夺和古典的饮食限制,允许两个饮食的影响,要研究下一个协议。我们使用新的宽范围博士范式,目前检查单个细胞基因表达在特定的环境提示响应和确定此单元格如何对信息进行编码的一般框架。我们的框架包括说明如何执行寿命和定量成像,分别的两个实验协议下宽范围, 从这些实验协议博士数据然后可以检查与中提供的计算分析这一框架进行量化编码的基因的表达水平或寿命的变化跨不同的食物条件的信息。
使用宽范围博士范式的寿命实验涉及六个独特的食物水平 (表 1)。这就需要比检查较少的食物水平,如膳食剥夺10,11下长寿或使用吃 2遗传背景35更劳动密集型的解决办法。然而,审查在单一条件下的寿命可以限制博士的基因作用的解释。例如,我们最近表明, daf 7突变体食物浓度相比野生型动物12 (图 1A) 响应双向衰减。在没有食物的情况下, daf 7突变体显示野生型动物相比其寿命的缩短。如果我们只考虑膳食剥夺,我们将解释, daf 7基因作为必要只寿命延长,时事实上daf 7作用是更复杂。因此,关键的结果议定书 》 的这一部分是寿命的去确定是否感兴趣的基因参与调制在食物丰富整体响应的变化。
本议定书与其他方法相比的一大优点是,它使用一种新的方法来消除后代生产在经历寿命分析的动物。大多数研究使用药物 FuDR 成人呈现他们不育系的增殖抑制作用。然而,最近的研究表明 FuDR 治疗可以有条件和基因特异性影响寿命17,,1819,20,21,调用到质疑其普遍适用性。在本议定书,消除后代的生产通过 24 小时实现治疗的动物与 rna 干扰靶向的鸡蛋 5基因,抑制几丁质蛋壳的形成受精线虫卵母细胞导致他们死亡22,23。此方法的优点是寿命的它是寿命的非常晚代理,所以不会干扰的胚,是寿命的一个主要调节器,线虫。
一个潜在的警告,宽范围博士议定书 》 是对使用的抗生素来控制细菌的增殖,从而确保严格控制空气细菌浓度的依赖。蠕虫在肠道内的细菌扩散是已知事件中线虫16的主要死因。因此,抑菌抗生素,如羧苄青霉素 NGM 琼脂中的使用可以防止细菌扩散,增加寿命的蠕虫相比,非抗生素控制16。某些类型的抗生素,如利福平36和四环素家庭37,38,成员已被证明延长寿命中的线虫独立及其对细菌的影响扩散。然而,尚无证据在文献中羧苄青霉素或链霉素可增加长寿独立及其对细菌增殖的影响。
使用寿命可以看作一个复杂的计算的输出地方环境信息,通过基因表达中的神经网络,路由转交生理学。我们的协议提供了一种方法来理解特定基因如何影响这流动的环境信息。为了解决这个问题,我们需要可靠的图像处理,以确定在单个细胞水平基因表达响应的分布。能够估计不仅对基因表达的平均响应更改在食物丰富,也从大量人口的全面统计分布表示适用方法的一项重要要求。食物丰富基因表达回应此准确描述允许应用程序信息理论的量化编码的特定神经元的信息,以及神经电路所采用的编码战略。
在本议定书中概述的方法的成像和计算方面都适用于生物背景一大套。我们的工作,我们重点放在小的神经网络所涉及的食物传感,然而,信息处理功能的分析并不限于特定的单元格类型或具体环境线索。在将来,这些方法可能给予的输入变量,影响任何生理的输出更大的品种。这些方法将有助于更好地理解基因调控网络是如何编码的过程和传输信息。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢巴格曼和霍维茨的实验室试剂。毛细管气相色谱法,这由美国国立卫生研究院办公室的研究基础设施项目 (P40 OD010440) 提供了一些毒株。我们还感谢 M.Lipovsek 对手稿 》 的评论。这项研究受维康信托基金会 (项目赠款 087146 向王室法律顾问)、 BBSRC (BB/H020500/1 和 BB/M00757X/1 对王室法律顾问)、 欧洲研究理事会 (NeuroAge 242666 向王室法律顾问)、 美国国立卫生研究院 (R01AG035317 和 R01GM088333 到 H.L.) 和美国国家自然科学基金 (0954578 到 H.L.,分别被称为 M.Z 到 0946809 GRFP)。
Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |