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Genetics

Quantifizierung der Information kodiert durch Gene Expression Ebenen während der Lebensdauer Modulation unter breiter Palette diätetische Einschränkung in C. elegans

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56292
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3,4, 2,3,4, 1
1Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, 2Interdisciplinary Bioengineering Graduate Program, Georgia Institute of Technology, 3Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 4School of Chemical & Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen einen Rahmen für die breite Palette diätetische Einschränkung auf Genexpression und Lebensdauer zu beziehen. Wir beschreiben Protokolle für die breite Palette diätetische Einschränkung und quantitative Bildgebung der Genexpression unter diesem Paradigma. Wir skizzieren weitere numerische Analysen zu offenbaren zugrunde liegenden Informationen Bearbeitungsfunktionen der genetischen Schaltungen in Essen-sensing beteiligt.

Abstract

Sensorische Systeme erlauben Tiere zu erkennen, zu verarbeiten und auf ihre Umgebung reagieren. Essen Fülle ist eine ökologische Stichwort, das tief greifende Auswirkungen auf tierische Physiologie und Verhalten hat. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass Modulation der Langlebigkeit in der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans durch Essen Fülle komplexer als früher erkannt. Die Reaktionsfähigkeit der Lebensdauer zu Veränderungen im Gastro-Level richtet sich nach bestimmten Genen, die durch die Kontrolle der Informationsverarbeitung innerhalb einer neuronalen Schaltung fungieren. Unser Framework verbindet Genanalyse, Hochdurchsatz-quantitative Bildgebung und Informationstheorie. Hier beschreiben wir, wie diese Techniken verwendet werden können, um jedes Gen zu charakterisieren, die eine physiologische Bedeutung in breiter Palette diätetische Einschränkung hat. Speziell ist dieses Workflows zeigen, wie ein Gen des Interesses Lebensdauer unter breiter Palette diätetische Einschränkung regelt; dann, wie die Expression des Gens mit Gastro-Level variiert zu etablieren; und zu guter Letzt eine unvoreingenommene quantifiziert die Menge an Informationen übermittelt durch Genexpression über Lebensmittel Fülle in der Umgebung. Wenn man mehrere Gene gleichzeitig im Kontext einer neuronalen Schaltung betrachtet, kann diesen Workflow die Codierung Strategie durch die Schaltung aufdecken.

Introduction

Alle Organismen müssen in der Lage zu spüren und reagieren auf Änderungen der Umgebung um ihr Überleben zu sichern. Bei Tieren das Nervensystem ist die primäre Detektor und Wandler von Informationen über die Umgebung und koordiniert die physiologische Reaktion auf Änderungen, die den Organismus überleben1beeinflussen könnten. Essen Fülle ist eine ökologische Cue, die gut in mehreren Kontexten untersucht wird, die nicht nur lebensmittelbezogene Verhaltensweisen wie Nahrungssuche2 regelt, sondern auch Auswirkungen auf die Lebensdauer des Tieres. Die Modulation der Lebensdauer durch Veränderungen in Hülle und Fülle der Lebensmittel ist ein Phänomen bekannt als diätetische Einschränkung (DR) und hat breite evolutionären Erhaltung3.

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans ist ein leistungsfähiges Modell für grundlegende biologische Fragen. Eine Vielzahl von Techniken entwickelt worden, die Manipulation des Genoms Wurm, wie RNAi und in-Vivo -gen Bearbeitung Techniken zu ermöglichen. Die geringe Größe der Schnecke und seine optische Transparenz eignen sich auch für in-Vivo Bildgebung sowohl transkriptionelle und translationale fluoreszierende Reporter und den Nutzen von Hochdurchsatz-Technologien wie Mikrofluidik4. Zusammen, können diese Tools genutzt werden, um wie neuronale Schaltkreise direkt das Verhalten der Tiere zu untersuchen.

C. Elegans ist ein Bacterivore und mehrere Methoden veröffentlicht worden, die für die präzise Kontrolle der Lebensmittel Fülle zu ermöglichen, durch Manipulation der Bakterienkonzentration5,6,7,8 . Innerhalb der Forschungsgemeinschaft C. Elegans wurde DR in zwei unterschiedlichen Kontexten untersucht. Das erste könnte man "klassische DR", bezeichnen, wie es die Veränderungen als Reaktion spiegelt auf die Verminderung der Zahl der Essen in anderen Organismen. In diesem Zusammenhang führt abnehmender Lebensmittel Fülle von Ad Libitum Ebenen eine steigende Lebenserwartung, bis ein Optimum erreicht ist, nachdem dieser Punkt Langlebigkeit mit weiteren Reduzierung der Nahrung6,7abnimmt, 9. Der zweite Kontext unter dem DR in C. Elegans untersucht worden ist diätetische Entbehrung, in dem die Langlebigkeit der Würmer durch die vollständige Entfernung des bakterielle Nahrung Quelle10,11erhöht ist. In Entchev Et Al. (2015)12, zeigten wir, dass die Komplexität in DR aus diesen beiden unterschiedlichen Paradigmen untersucht werden kann gleichzeitig in einem Kontext bezeichnen wir 'breit-Spektrum DR'. Mithilfe des Protokolls, die unten beschriebenen haben wir eine neue Klasse von Genen identifiziert DR beteiligt, dass bidirektional modulieren die Lebensdauer Reaktion auf Lebensmittel Fülle und neuronale Schaltkreise, die Lebensmittel12 (Abbildung 1) Sinn beteiligt sind.

Die Reaktion des Tieres auf Veränderungen im Umfeld integriert eine Reihe von biologischen Prozessen, die das sensorische System mit komplexen regulatorischen Interaktionen vermitteln Umweltinformationen zur Physiologie zu verknüpfen. Obwohl die mechanistischen Details solcher "Informationsfluss" oft unbekannt sind, können genetische Werkzeuge verwendet werden, erwerben Sie einen Einblick, wie diese komplexe Berechnung unter verschiedenen biologischen Komponenten aufgebaut ist. In unserer neuesten Arbeiten haben wir gezeigt, dass Daf-7 und Tph-1 bei der Übertragung von Umweltinformationen über Lebensmittel Fülle durch einen Lebensmittel-sensing neuronale Schaltkreis beteiligt sind, die Lebensdauer in C. Elegans12 moduliert , 13. durch die Anwendung der mathematischen Rahmens der Informationstheorie14, konnten wir den Betrag von Umweltinformationen in Bezug auf Bits, zu quantifizieren, die durch die Veränderungen der Genexpression in Daf-7 und dargestellt ist Tph-1 in spezifischen Neuronen über verschiedene Lebensmittel Ebenen. Aus diesem Grund konnten wir dann entdecken Sie die Codierung Strategie von dieser neuronale Schaltkreis und wie es genetisch gesteuert wird (Abbildung 2).

In das folgende Protokoll beschreiben wir die Schritte zu verstehen, was die Auswirkungen von Genen von Interesse an spezifische Neuronen sind und wie sie um den Fluss der Informationen über Lebensmittel aus der Umgebung, um Lebensdauer teilnehmen. Im großen und ganzen ist unser Framework aufgeteilt in zwei experimentelle Protokolle und eine rechnerische Workflow. Für die experimentelle Aspekte, es ist wichtig, durch Mutation entstehende Variationen der Gene von Interesse, die unter breit-Bereich geprüft werden kann DR. Faithful transkriptionelle Reporter sind auch notwendig, um die Expression der Gene auf verschiedene Lebensmittel Ebenen zu quantifizieren. Um die rechnerische Analyse diskutiert in unserer Methode durchführen zu können, muss das Dataset von ausreichender Größe, sinnvolle Schätzungen der Ausdruck Distributionen abzugeben. Obwohl wir die Analysen Vorlage Quellcodes vorsehen, muss der Benutzer mit der Sprache der Informationstheorie vertraut sein, ausgiebig in unserem computational Framework verwendet wird. Die Quelltexte sind in R und C++ geschrieben. Daher ist ein gewisses Maß an Programmierung Kenntnisse auch in einer sinnvollen Weise anzuwenden.

Protocol

1. Vorbereitung der Bakterienkulturen und Platten für allgemeine Worm Kultur

  1. Lysogeny Brühe (LB) Medien in der 250 mL Glasflasche 100 mL vorbereiten und sterilisieren durch Autoklavieren.
  2. Impfen die Flasche mit einer einzigen Kolonie von Escherichia coli-Stamm OP50 und über Nacht bei 37 ° C inkubieren und dann speichern Kultur bei 4 ° C bis benötigt.
  3. Bereiten 5 L des sterilen Nematoden Wachstum Mittel-(NGM) Agar 15 und aliquoten 12 mL Volumen in sterilen 6 cm Kunststoff Petrischalen.
  4. Erlauben das Agar, über Nacht und dann bei 4 ° C bis benötigt speichern.
  5. Platten Samen NGM mindestens 3 Tage vor der mit 225 μL der gekühlten OP50 Kultur verwenden. Speichern Sie die Platten bei 20 ° C bis benötigt.

2. Vorbereitung von Bakterienkulturen und Verdünnungen für Experimente

  1. bereiten zwei Lose von 500 mL LB Medien in einem 2 L-Erlenmeyer-Kolben und sterilisieren durch Autoklavieren.
  2. Jede Flasche mit einer einzigen Kolonie von OP50 impfen und wachsen bei 37 ° C Schütteln bei 200 u/min für ca. 14 h.
  3. Ergänzen die Kulturen mit dem Antibiotikum Streptomycin, eine Endkonzentration von 50 μg/mL. Weiter Zittern, für 30 min bei 37 ° C für 15 min auf Eis legen Sie die Kolben
  4. Transfer 450 mL einer jeden Kultur in separaten sterilen Zentrifuge Flaschen (im Idealfall 500 mL Kapazität zu vermeiden, Spaltung der Kulturen). Die übrig gebliebenen Kultur auf dem Eis zu behalten, wie es verwendet wird, um die Konzentration der Bakterien bestimmen.
  5. Spin-down die Flaschen bei 4500 X g in einem gekühlten Zentrifuge bei 4 ° C für 25 min. überstand verwerfen und lagern die Flaschen auf Eis.
  6. 100 μL der übrig gebliebenen Kultur aus jedem Kolben in 900 μl von sterilen lb Verwendung 1 mL sterile LB Spektralphotometer auf Null zu verdünnen, und ermitteln Sie die OD 600 der 10-divisibel Verdünnung der jeweiligen Kultur. Wenn beispielsweise die OD 600 der 10-divisibel Verdünnung der Nacht Kultur 0,28 dann die Kultur eine tatsächliche OD 600 von 2,8 hatte.
  7. Verwenden eine arbeiten-Stammlösung von Bakterien von 1,12 x 10 10 OP50 Zellen/mL, das entspricht einem OD-600 56. Daher verwenden die Beispiel-OD-600 von 2,8 von oben, Aufschwemmen Sie Pellet aus der 450-mL-Kultur in einem 20 th des ursprünglichen Volumens, die in diesem Fall 22,50 mL ist. Aufschwemmen Bakterien mit einer sterilen S basale Lösung ergänzt mit Streptomycin, 50 μg/mL (SB + Strep).
  8. Das Pellet in das entsprechende Volumen der sterilen SB + Strep Aufschwemmen.
  9. Machen alle nachfolgenden Konzentrationen verwendet in Experimenten von Verdünnungsreihen von der Arbeit bestand im SB + in Tabelle 1 aufgeführten strep mit der Verdünnungsfaktoren.

3. Einstellung auf Lebensdauer Experimente

Hinweis: Lebensdauer-Assays sind auf 6 cm behandelt Gewebekultur gefüllt mit 12 mL NGM Agar ergänzt mit Streptomycin und Carbenicillin (NSC), jeweils eine Endkonzentration von 50 μg/mL durchgeführt. Diese Gewebekultur-Platten eignen sich gut für Lebensdauer Assays ohne oder sehr Bakterienkonzentration geringe, wie die Würmer deutlich weniger anfällig sind für das Festhalten an der Wand der Platte und Dörren. Die Verwendung von zwei verschiedenen Antibiotika verhindert, dass die OP50 Belastung entwickeln Resistenzen, die kritisch bei der Kontrolle der Bakterienkonzentration auf der Platte ist. Darüber hinaus minimieren wir durch Inaktivierung von Bakterien mit Antibiotika, die Auswirkungen auf die Lebensdauer der Wurm durch pathogene Infektion 16. Dies ermöglicht uns, nur die ernährungsbedingten Komponenten der Bakterienkonzentration in diesen Experimenten zu berücksichtigen. Viele C. Elegans Alterung Studien ergänzen NGM Platten mit dem chemischen Fluoro-2 ′-Deoxyuridine (FUdR), die Erwachsenen steril zu rendern. Die Verwendung von FUdR kann jedoch problematisch sein, da seine Verwendung mit Langlebigkeit Assays 17 , 18 , 19 , einige verwirrende Probleme verursachen können 20 , 21. Entchev Et Al. (2015) 12 umgehen dieses Problem durch die Einwirkung von L4-Larven von RNAi Ei-5 22 , 23, hemmt die Eizelle-Embryo Übergang durch die Blockierung der Bildung der Eierschale des befruchtet C. Elegans Eizellen ihrer Todesfolge.

  1. Kultur C. Elegans Stämme, die auf untersucht werden ausgesät NGM Platten bei 20 ° c erlauben die Platten heraus zu verhungern, um sicherzustellen, dass alle Tiere in einer einheitlich und potenziell entfallen Nebenwirkungen transgenerationalen von angebaut Entwicklungsbedingungen.
  2. Transfer verhungert L1-Larven neue gesetzte NGM-Platten durch das Ausschneiden ein kleines Stück des Nährbodens (5 x 5 mm) von der ausgehungerten Platte mit einem sterilen Skalpell und stellen Sie es auf eine neue Platte, ein Prozess, genannt ' chunking ' von C. Elegans Forschung Comm Einheit 15. Wachsen Sie die Würmer, bis sie die L4-Stadium zu erreichen. Fünf L4-Larven pro Stamm werden dann an einzelnen ausgesät NGM-Platten übertragen und bei 20 ° c gehalten Diese Tiere stellen die P0-Generation.
  3. Einsatz L4 Nachkommen der P0-Generation zum Einrichten der F1-Generation. Individuell platzieren F1 L4-Larven der Wildtyp N2 Belastung auf 30 gesetzte NGM Platten.
    Hinweis: Für mutierte Stämme hängt die Anzahl der Platten erforderlich ihre Wachstumsrate. Zum Beispiel unterziehen daf-7(ok3125) Tiere eine vorübergehende Dauer Verhaftung bei 20 ° C. Diese Sorte produziert somit weniger L4-Larven als ein Teller mit N2 Wildtyp Würmer.
  4. Um diese Differenz auszugleichen, Einrichten von daf-7(ok3125) Platten, einen Tag früher als N2 Platten und bei einer größeren Anzahl ist ein gutes Arbeiten Verhältnis 3:1.
  5. Transfer synchronisiert L4-Stadium Nachkommen der F1 Eltern NGM-Platten mit 1 mM IPTG und 50 µg/mL Carbenicillin (RNAi-Platten), die mit 225 µL HT115 Bakterien auszudrücken DsRNA Ausrichtung auf das Ei-5 gen ausgesät und gehalten wurden ergänzt 20 ° C für 24 h. Mindestens 360 Würmer pro Stamm, gehalten in einer Dichte von 15 Tiere pro Platte, sind pro Experiment benötigt.
  6. Nach der Ei-5 RNAi Behandlung, übertragen die Würmer auf NSC Platten ausgesät mit 225 µL Streptomycin behandelt OP50 in einer Konzentration von 2 x 10 9 Zellen/mL (Tabelle 1) für weitere 24 Stunden bei 20 ° C. Zur Vermeidung von Sachschäden an die Würmer während dieser und alle nachfolgenden Überweisungen sanft schöpfe Tiere aus unter den Wurm mit ein sehr dünner geschwungene Wurm holen. Schwimmer, die die Tiere aus der Wurm holen durch Eintauchen in ein 10 µL Tröpfchen SB + Strep platziert auf der Oberfläche der neuen Platte.
  7. Am nächsten Tag verteilen die Würmer auf NSC-Platten, die jeweils die Nahrung Ebenen lIE in Tabelle 1 sowie eine Reihe von NSC-Platten, die keine Bakterien enthalten. Seed alle NSC-Platten mit 225 µL der entsprechenden Konzentration von Bakterien, und Samen die keimfreie NSC-Platten mit 225 µL SB + Strep. Pflegen Sie die Würmer in einer Dichte von 15 Tiere pro Platte, wodurch mindestens vier Platten pro Essen Zustand pro Stamm. Verschieben Sie die Platten auf die gewünschte Temperatur experimentelle.
  8. Transfer Würmer zu frischen NSC-Platten mit geeignetem Futter Konzentration nach dem Zeitplan in Tabelle 2 aufgeführten ausgesät.
  9. Score Tiere für die Bewegung von sanft drängen mit einem Draht wählen. Fehlende Reaktion wird als Tod bewertet. Spielstand Tiere für Tod bei jeder Übertragung Punkt und dann täglich nach der letzten Übergabepunkt.

4. Einstellung auf Imaging Experimente

Hinweis: die Schritte in diesem Abschnitt sind ausreichend, um genügend Würmer pro Stamm für imaging-eine experimentelle Essen Bedingung bei einer gegebenen Temperatur zu erzeugen. Dieses Protokoll kann skaliert werden, um die Anzahl der Bedingungen anzupassen, die an einem bestimmten Tag abgebildet wird. Allerdings sollte darauf geachtet werden, in den Versuchsplan um sicherzustellen, dass der Zeitrahmen angemessen ist und dass Tiere über verschiedene Stämme nicht mehr als 12 Stunden am Tag der Bildgebung ein Altersunterschied haben. Empfehlenswert sind die transkriptionelle Reporter wird abgebildet Single Copy gentechnisch veränderten Pflanzen, wie dies die native Regulation der Gene stärker ähneln wird. Das Protokoll unten beschriebenen und in Tabelle 3 zusammengefasst sieht auch eine vereinfachte Methode für den Erhalt der großen synchrone Alter abgestimmt Populationen von Stämmen, die für andere experimentelle Workflows verwendet werden können.

  1. Kultur Tiere Imaging-Experimente auf 10 cm behandelt Gewebekultur Platten ermöglicht eine größere Dichte der Würmer (∼ 100 Tiere pro Platte) als Lebensdauer Assays.
  2. 30 mL von NGM Agarplatten und Saatgut mit fünf 225 µL Aliquots der gekühlten OP50 Kultur in a Cross-wie Anordnung der Platten 10 cm einfüllen.

5. Anfängliche Kultur von Reporter Stämme

  1. Kultur C. Elegans Stämme, die auf untersucht werden ausgesät NGM Platten bei 20 ° c erlauben die Platten heraus zu verhungern, um sicherzustellen, dass alle Tiere in einer einheitlich und potenziell entfallen alle angebaut transgenerationalen Auswirkungen der Entwicklungsbedingungen.
  2. Chunk ausgehungert L1 Larven ausgesät NGM Platten und wachsen, bis sie die L4-Stadium zu erreichen. Übertragen Sie drei L4-Larven pro Stamm auf zwei gesetzte NGM-Platten bei 20 ° C. Diese Tiere stellen die P0-Generation.
  3. Verwenden die L4-Nachkommen der P0-Generation, um die F1-Generation einzurichten. Legen Sie F1-L4-Larven der Wildtyp Reporter Belastung an 4 gesetzte NGM-Platten. Für mutierte Stämme hängt die Anzahl der Platten erforderlich ihre Wachstumsrate. Mit dem vorherigen Beispiel von daf-7(ok3125), Reporter-Stämme in diesem Hintergrund erfordern dreimal die Nummernschilder und braucht zwei Tage zuvor die Wildtyp Reporter Stämme, um Unterschiede in der Wachstumsrate berücksichtigen eingestellt werden.

6. Ei-Kollektion und Synchronisation der Reporter Stämme

Hinweis: einige Gene des Interesses an der Forschungsgemeinschaft C. Elegans Alterung führen zu Wachstum und Eiablage Mängel wenn mutiert, wodurch es schwieriger zu große synchrone Populationen von Tieren der verschiedenen Genotypen zu generieren. Beispielsweise führt die daf-7(ok3125) Mutation ein schweren eierlegende Mangels gegenüber dem Wildtyp N2-Stamm. Synchrone L4-Larven von verschiedenen Stämmen für quantitative Bildgebung Experimente erfordert daher, um ausreichend zu erhalten eine robustere Methodik als Würmer manuell zu pflücken. Aus diesem Grund wurden eine Natriumhypochlorit (NaClO) transkriptionelle Reporter Stämme unterworfen / Natriumhydroxid (NaOH) Lösung Behandlung von trächtigen Erwachsene zu brechen die Tiere öffnen und befreien ihren Eiern, ein Prozess, der gemeinhin als ' bleichen ' von C. Elegans Forschung Gemeinschaft 15.

  1. Konto für Unterschiede im Wachstum Preise zwischen Stämmen und berechnen wenn Platten von jedem Stamm geerntet und gebleicht werden. Ein Beispiel für als Wildtyp und daf-7(ok3125) Reporter Stämme gebleicht werden siehe Tabelle 3.
  2. Seriell waschen die Würmer eines bestimmten Stammes von den Tellern auf dem entsprechenden Tag mit 15 mL SB und sammeln sich in einer sterilen 15 mL-Tube. Ermöglichen die Tieren natürlich Sediment und passen Sie dann das Volumen der Flüssigkeit bis 7 mL.
  3. Add 2 mL 5 % NaClO und 1 mL 5 M NaOH auf das Rohr mit der trächtigen Erwachsene. Schütteln Sie die Mischung bei Raumtemperatur nicht mehr als 3 Minuten lang. Die NaClO tötet die Bakterien und Würmer, während die NaOH bewirkt, die Würmer dass zu zerbrechen, dass Freigabe alle befruchteten Eizellen, die sie in die Flüssigkeit enthalten. Das Chitin Eierschale um die Embryonen schützt sie vor den Folgen der Behandlung, solange die Belichtungszeit relativ kurz ist. Nach 3 min Inkubation, Wirbel der Röhre für ~ 30 s zum Auseinanderbrechen der Wurm Kadaver weiter zu erleichtern.
  4. Nach der 3-min Inkubation Spin-down das Gemisch bei 1.000 X g für 1 min zu die Eiern Pellets. Entfernt die meisten der Überstand mit einer sterilen Glaspipette verbunden mit einer Thermoskanne, verlassen ~0.5 mL in jedem Röhrchen, um nicht zu stören, die Eiern Aspirieren.
  5. Pellet mit 9,5 mL SB Aufschwemmen und wiederholen Sie dann die Zentrifugationsschritt Wiederfreisetzung Schritte und eine zusätzliche zwei Mal, dass die Eizellen mit SB insgesamt drei Mal gewaschen wurden.
  6. , Nachdem das Finale zu waschen, pellet-Eiern durch Zentrifugation und verwerfen alle außer 0,5 mL des Überstands. Die Eizellen in die restlichen 0,5 mL SB und dann aliquoten 100 µL auf drei 10 cm ausgesät NGM Platten aufzuwirbeln. Verteilen Sie die 100 µL gleichermaßen auf alle fünf bakteriellen Rasen auf jeder Platte. Für Wildtyp-Sorten, Eiern sollte nicht bei dichten größer als 200 pro Platte hinterlegt werden.
    1. Platten halten bei 20 ° C für 48 h und eine sehr homogene Bevölkerung von L4-Larven zu erhalten. Für Stämme mit verzögertes Wachstum Phänotypen empfiehlt es sich, wie viele Eizellen als verfügbar einzuzahlen und die Inkubationszeit zu erhöhen. Zum Beispiel halten daf-7(ok3125)-mit Reporter-Stämme bei 20 ° C ~ 64 h erlauben die Eiern schlüpfen und die L4-Stadium erreichen.

7. Behandlung von Reporter Stämme mit Ei-5 RNAi

  1. seriell waschen die Würmer aus den drei Platten mit 15 mL SB und sammeln Sie die Flüssigkeit in einer sterilen 15 ml Tube. Ermöglichen Sie die L4-Larven zu natürlich sedimentieren und dann alle außer ~0.5 mL der Flüssigkeit abzusaugen. In der wilden type-Reporter-Stämme, entfernt dieser Schritt Larven jünger als L4. Mutierte Hintergründe dieser Schritt unterstützt den Abtransport von jedem Verhafteten Larven wie Dauers bei daf-7(ok3125).
  2. Aufschwemmen der Würmer mit 9 mL SB. Wieder überwachen Sie die Sedimentation Rate der L4-Larven zu und dann alle außer ~0.5 mL des Überstands aspirieren Sie, nachdem die meisten die L4-Larven pelleted haben. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal. Dann alle außer ~0.5 mL der Flüssigkeit abzusaugen, wenn die Mehrheit der L4-Larven niedergelassen haben.
  3. Fügen Sie 10 µL der basalen sterilen S ergänzt mit 0,1 % Pluronic F-127 (SB + Plu), um die Flüssigkeit, die die L4-Larven enthalten. Dies fungiert als ein Tensid und verhindert, dass die Larven an die innere Oberfläche der Kunststoff Pipettenspitzen.
    1. Sanft die Larven mit einer Pipettenspitze P200 niedriger Retention und dann aliquoten 150 µL auf drei 10 cm RNAi-Platten, die ausgesät werden mit 5 x 225 µL Ei-5 RNAi Bakterien aufzuwirbeln. Sicherzustellen, dass die Würmer gleichmäßig über alle fünf bakteriellen Rasen verteilt sind.
  4. Einmal die Flüssigkeit in den Agar aufgenommen hat, entfernen Sie nicht-L4-Larven von den Platten, die nicht durch den Waschvorgang entfernt wurden, indem Sie sie manuell aus auswählen. Speichern Sie die Platten bei 20 ° C für 24 h

8. Einleitung der breiten Palette DR

Hinweis: nach dem 24 h Ei-5 RNAi-Behandlung werden die L4-Larven, die ursprünglich auf den Platten hinterlegt wurden 1 Tag alt Erwachsene.

  1. Wählen Sie aus jedem jungen Larven, die den vorherige manuelle Entfernung Schritt zu diesem Zeitpunkt verlassen nur die 1 Tag alten Erwachsenen auf den Tellern aus entgangen.
  2. Für jede Belastung, waschen die 1 Tag alten Erwachsenen aus den drei Platten mit 15 mL sterile SB + Strep in einem 15 mL-Tube. Ermöglichen Sie die Würmer natürlich Sediment, und dann alle, aber 0,5 mL des Überstands Aspirieren. Die Würmer mit 9,5 mL SB + Strep Aufschwemmen und wiederholen Sie die Schritte der Sedimentation und waschen.
  3. , Nachdem das Finale zu waschen, erlauben die Würmer zu sedimentieren und dann alle, aber 0,5 mL des Überstandes Aspirieren. Fügen Sie 10 µL SB + Plu und sanft Aufschwemmen der Larven mit einer Pipettenspitze P200 und dann aliquoten 100 µL auf ein NSC Teller ausgesät mit 5 x 225 µL Bakterien bei einer Konzentration 2 x 10 9 Zellen/mL.
    1. Verteilen die 100 µL gleichmäßig über alle fünf bakteriellen Rasen. Unter dem Mikroskop schätzen die Zahl der Tiere auf dem Teller: Ziel ist es, zwischen 100-150 Würmer auf dem Teller haben.
    2. Bestimmen das Volumen der Flüssigkeit benötigt, um einen Wurm Dichte innerhalb dieses Bereichs und dann Aliquoten auf zwei weitere Platten zu erreichen. Passen Sie die Anzahl der Würmer auf der ersten Platte, auch in diesen Bereich fallen und dann speichern Sie die Platten bei 20 ° C für 24 h
  4. Am nächsten Tag, die 2 Tage alten Erwachsenen sammeln und verteilen an neuen NSC Platten ausgesät mit der gewünschten experimentelle Konzentration von Lebensmitteln (Tabelle 1), Wiederverwendung von den in den Schritten 2 und 3 beschriebenen Methoden. Sobald die Flüssigkeit in den Agar aufgesogen ist, verlagern die Platten auf die gewünschte experimentelle Temperatur für 24 h.
  5. Am nächsten Tag, die 3 Tage alten Erwachsenen sammeln und verteilen, frische NSC-Platten mit der gleichen experimentellen Konzentration von Lebensmitteln, Wiederverwendung von den beschriebenen Schritten 8.3 und 8.4 Methoden ausgesät. Sobald die Flüssigkeit in den Agar aufgesogen ist, zurück die Platten auf die experimentelle Temperatur für 48 h
  6. Die 5 Tage alten Erwachsenen zu sammeln und verteilen an frische NSC-Platten mit der gleichen experimentellen Konzentration von Lebensmitteln, Wiederverwendung von den beschriebenen Schritten 8.3 und 8.4 Methoden ausgesät. Sobald die Flüssigkeit in den Agar aufgesogen ist, zurück die Platten auf die experimentelle Temperatur für 24 h

9. Mikrofluidische Imaging der Reporter Stämme

  1. am 6. Tag des Erwachsenenalters, Bild mithilfe einer benutzerdefinierten mikrofluidischen Plattform 24 , 25 Tiere. Physisch wählen Sie Tiere aus den drei Platten und hängen Sie in eine 5 mL Kryo Röhrchen mit 4,5 mL SB + Strep.
    1. Einmal die Würmer Sediment aspirieren Sie alle, aber ~0.5 mL des Überstands und die Tiere in 4 mL SB + Strep aufzuwirbeln. Diese Waschen entfernt überschüssige Bakterien, die sonst mit Bildgebung stören könnten. Die Würmer werden in eine benutzerdefinierte mikrofluidischen Gerät über Druck angetrieben fließen 24 , 25 eingeführt. Innerhalb des Gerätes sind einzelne Würmer in geleitet und gefangen in einer bildgebenden Kanal gated Druck angetrieben auf dem Chip Ventile 26 unter der Kontrolle von Individualsoftware.
  2. Einmal ein Wurm kopfüber in den bildgebenden Kanal gefangen ist, sammeln ein fluoreszierendes Z-Stack, mit 50 Abschnitten in 2 µm Schritten, mit einem standard Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem 40 X Öl Ziel (1,3 NA) und eine Kamera. Sammeln Sie rote und grüne fluoreszierende Bilder aller transkriptionelle Reporter gleichzeitig mit einer Emission Splitter und zur Auswertung gespeichert. Bildaufnahme ist automatisiert mit Individualsoftware.
  3. Prozess das Bild automatisch mit benutzerdefinierten MATLAB Skripts 27 (abrufbar unter https://github.com/meizhan/SVMelegans). Die Z-Stapel werden in MATLAB geladen und analysiert, Ermittlung der Neuron-Paare und ihre Standorte innerhalb der Abbildungsebene. Die maximale Projektionen werden dann berechnet, und ein Schnittstellenüberwachung Algorithmus wird verwendet, um fluoreszierende Einzelzellen zu finden. Zelle Identifikation wird berechnet anhand der relativen Abstände und Positionen innerhalb der Wurm ' Kopf s.
  4. , Reporter-Fluoreszenz, quantifizieren extrahieren die dreidimensionale Volumen um jede zelluläre Standort aus dem Z-Stapel. Integrieren Sie die Intensität über eine konsistente Anzahl der hellsten Pixel, die die gesamte Zelle in allen Fällen vollständig Kapseln.
  5. Störungen von experimentellen Zustand-spezifischen oder Stamm-spezifische Änderungen in den Darm Auto-Fluoreszenz jedes Tieres zu beseitigen berechnen die Hintergrundintensität für die Zelle Paare am nächsten den Darm (ADF und ASI) über Schätzung des Betriebsmodus des Intensitätsverteilung in einem Volumen um das Neuron. Subtrahieren Sie diese Intensität Hintergrundwert von der integrierten Fluoreszenz, die endgültige Ausgabe zu erhalten.

10. Assembly Daten

Hinweis: die Fluoreszenz-Intensitäten aller Neuronen von Bildverarbeitungs-Software analysiert werden kombiniert in den gefilterten Ausdruck Datendatei (FED) die verwendet wird, um die Verteilung Profile des Gens zu schätzen Ausdruck (Vorlage R und C++-Skripte sind erhältlich bei https://github.com/giovannidiana/templates).

  1. Manuell überprüfen jedes verarbeitet Bild, korrekte Identifizierung für alle Zellen zu bestätigen. Bilder mit fehlerhaften Zelle Identifikation müssen in einer Ausgrenzung-Datei aufgezeichnet werden. In Diana Et Al. (2017) 13 die Ausschlussdatei besteht aus einer binären Tabelle mit ' 0 ' für die korrekte und ' 1 ' für falsche Zelle Identifikation. Die Anzahl der Zeilen in der Tabelle ist gleich der Anzahl der Würmer, abgebildet mit einer Spalte für jede Zelle abgebildet (dh ASI, ADF und NSM).
  2. Die FED-Datei zu generieren:
    1. Run die Bash-Skript " Gen_data + Zeit " mit die Ausschlussdatei gefiltert, zellspezifische Dateien kombinieren den Ausdruckswerte aus jeder Wurm abgebildet zu generieren. Für jeden Ordner durch die Bildverarbeitungs-Software erzeugt, das Bash-Skript liest die Anmerkungsdatei < Folderprefix > _EXP.txt, die experimentellen Bedingungen und die Ausgrenzung-Datei zu extrahieren < Folderprefix > _X.csv nur richtig auswählen Neuronen identifiziert. Ausdruckswerte werden aus den Dateien gelesen < Folderprefix > _data_ < Neuron > CSV.
    2. Verketten alle Dateien in " FED_split.dat " und die Experiment-Batch-Code sortiert, Label und Zelle Identität Wurm.
    3. Laufen " Art " (C++-Programm, Nutzung:. / FED_split.dat FED_merged.dat sort) Einträge mit Null-Fluoreszenz für jede Zelle auswählen und kombinieren Sie diese in einzelne Zeilen in FED_merged.dat.

11. Schätzung der Information kodiert

Hinweis: das folgende Verfahren beschreibt, wie die Informationen über spezifische Umweltbedingungen kodiert, indem der Satz von gen ausdrücken zu quantifizieren. In Diana Et al. (2017) 13, die Informationen verschlüsselt über Lebensmittel Fülle in der Umgebung wurde untersucht, die Methode selbst ist jedoch auf diskrete beliebig vieler Umwelt Staaten anwendbar. Der wesentliche Bestandteil, theoretischen Variablen Informationen wie Informationen Enteroviren oder Redundanz zu quantifizieren ist die gemeinsame Wahrscheinlichkeitsverteilung der neuronalen Antworten unter die eingestellte Reize aus der Umwelt betrachtet. Um solche Schätzung durchführen, ist es wichtig, eine ausreichende Auswahl der Reaktion in der Bevölkerung von Würmern zu haben. Gaußsche Verteilungen können aus relativ kleinen Proben geschätzt werden; Allerdings ist es wichtig, eine Vorstellung von der erwarteten Form der Ausdruck Verteilung, die geeignete Stichprobengröße für eine zuverlässige Dichte Schätzung zu quantifizieren. Aufgrund der unvermeidlichen Variabilität in verschiedenen Studien, es ist wichtig zu überprüfen, dass die zentralen Werte der verschiedenen Wiederholungen des gleichen Experiments gewonnenen Verteilungen nicht systematisch verschoben werden oder, dass jede der statistischen Eigenschaften der Ausdruck der Verteilung sind nicht wesentlich verändert, über Studien. Für den Fall, dass die Testversion-Testversion-Variabilität mit der Variabilität innerhalb jeder Studie kompatibel ist, ist es entscheidend, die Anzahl der Versuche im Vergleich zur Anzahl der Würmer innerhalb von Studien, die ökologische/biologische Faktoren, die Studie zu Studie betreffen auf durchschnittlich zu balancieren Variabilität. Undersampling diese Faktoren könnte die Information-theoretische Analyse stark bias.

  1. Als R-Skript " code3D.R " stellt eine Vorlage für die Erzeugung von dreidimensionalen dichten anhand der Datei " FED_merged.dat ", diese Vorlage entsprechend dem spezifischen FED-Header-Format zu ändern. Die Liste " HeaderNames " stellt die Namen der einzelnen Felder in der FED-Datei während der " RONames " ist die Liste der anzeigen. Das Skript verwendet das R-Paket ' ks ' 28 , 29, multivariate Verteilungen in einem Hypercubic-Raster mit GS zu schätzen-Behälter in jeder Dimension Unterteilung zwischen Minimum und Maximum Werte im Dataset für jede Anzeige. Wenn die interne Variable " Gruppe " 0 alle Daten zur Abschätzung der Dichte verwendet werden soll. Wenn die " Gruppe " Label ist zwischen 1 bis 5 des Datasets sich in 5 getrennten Sätze gliedert, und die Ausdruck-dichten sind von 80 % der Daten aus den Ausschluss eines der fünf Sets geschätzt. Diese Funktion wird später verwendet, um Unsicherheiten zu schätzen.
    Hinweis: Verwendung von code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < Essen > < GS > < Outfolder > < Label > < Gruppe > < Frac > wo GT den Genotyp darstellt, Essen ist der Umweltbedingungen, Outfolder ist die bereits vorhandene Ordner, wo die Verteilungen werden gespeichert, Label ist ein Dateiname Präfix und Frac ist der Anteil des Datasets verwendet.
  2. Für jeden ökologischen Zustand erzeugen die multivariaten Verteilungen mit verschiedenen Raster Größen GS (z.B. 20,30,40 Kästen). Um rechnerische Belastung zu verringern, sind kleinere Werte des GS vorzuziehen, wenn feinere Auflösungen die Informationen Schätzung nicht wesentlich ändern. Genexpression Verteilung in den Ordner geschrieben werden < Outfolder > bei code3D.R als einzelne Spalte Text-Dateien mit Dateinamen Struktur ausgeführt angegeben < Label > _ < GT > _ < Essen > _GS < GS > _group < Gruppe >. dat.
    Hinweis: die vorherigen Schritte bieten die Schätzung der bedingten Wahrscheinlichkeitsverteilungen Equation 1 wo g steht für den Vektor der alle auslesen und f ist der Umweltbedingungen. Allerdings berechnen die gegenseitige Information zwischen Genexpression und die Umwelt 30 , 31.
    Equation 2
    wir brauchen die Verteilung der Eingabe Equation 3 die (Eingabe-) bestimmt auch gemittelt Genexpression < IMG Alt = "Gleichung 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. Wenn die Eingabe Verteilung nicht direkt verfügbar ist, ist eine sinnvolle Menge zu kodierenden Merkmale kennzeichnen die Kanalkapazität, die erreicht werden kann, durch die Maximierung der gegenseitigen Information über alle möglichen Eingabeverteilungen.
  3. Bei der Genexpression Verteilung anwenden Arimoto Blahut 32 Algorithmus zu schätzen die Kanalkapazität des Systems und die Verteilung des ökologischen Inputs, die Informationen maximiert. Ein Beispiel für die Implementierung des Algorithmus finden Sie in der C++-Programm " Ccap3D.cpp " für die dreidimensionale Genexpression Code analysiert in Diana Et Al. (2017) 13. Beispiel: Wenn Ausschüttungen aus der Genotyp GT123 entnommen sind 80 % der Daten (Gruppe 3) mit Rastergröße gleich 30 und gespeichert im Ordner ". /pdf/ " mit einem Präfix-Label = " PDF ". Der Befehl, die Informationen in den GT123 Hintergrund kodiert zu berechnen ist. / Ccap3D GT123 Pdf PDF 30 3
    Hinweis: die Schätzung der Informationen, die durch das System codiert richtet sich nach mehreren Quellen der Unsicherheit, einschließlich der Auswahl der Dichte Schätzung Algorithmus und Probe Größe Voreingenommenheit. 11.1 11.2 Schritte wiederholt werden sollte, mit unterschiedlicher Dichte Schätzmethoden, um die Größe der systematischen Verzerrungen von jeder Algorithmus eingeführt zu bewerten.
  4. Zur Schätzung der Unsicherheit aufgrund des Stichprobenumfangs, Neuberechnung Informationen aus Schritte 11.1 11.2 mit Gruppen zwischen 1 bis 5. Die Variabilität über diese fünf unabhängigen Verkostungen der 80 % der Daten spiegeln die Auswirkungen der Stichprobenumfang auf Informationen Schätzung.
  5. Informationen mit Schritten berechnen 11.1 11.2 über zunehmende Bruchteil der Daten (wie in Schritt 5), für Stichprobenumfang Bias zu korrigieren (einknicken Methode) 33.

12. Berechnung der Redundanz, Lärm und Signal Korrelation

Eingabeverteilungen
  1. die optimale Nutzung von der Schätzung der maximalen Informationen zur Berechnung der gegenseitigen Information erhalten Equation 5 zwischen Input und gen Ausdruck Reaktion jedes Neuron N. Die C++-Quelldatei " GetMI1D.c " ist ein Beispielprogramm von Joint Wahrscheinlichkeitsverteilungen marginale gegenseitige Informationen zu erhalten.
  2. Redundanz zu berechnen, indem man die Summe der gegenseitigen Information für jedes Neuron oben erhaltenen und subtrahiert dann die Kanalkapazität.
  3. Berechnen die " Shuffle " Informationen Begriff Equation 6 13 , 34. Eine Vorlage C++-Quelldatei kann in gefunden werden " GetShuffle.c ".
  4. Verwendung der " Shuffle " Begriff, Signal und Rauschen Korrelation zu berechnen. Für die signal Korrelation wir haben Equation 7 und für die Lärm-Korrelation wir haben Equation 8.
  5. Unsicherheiten auf Redundanz, erhalten Lärm und signalisieren Korrelation wie bei der gesamten Informationen (Schritt 11.3 des vorherigen Abschnitts) aus mehreren Verkostungen der 80 % der Daten und die Standardabweichung nehmen.

Representative Results

Durch Experimente Lebensdauer auf die Mutanten der Gene von Interesse neben dem Wildtyp N2-Stamm, kann man feststellen, ob dieser Gene eine Rolle in der Nahrung auf breite Palette DR haben. Die Wildtyp-Antwort sollte vergleichbar mit der in Abbildung 1Adargestellt werden. Jede Modulation dieser Reaktion durch die Mutanten, reflektiert durch eine ungleichmäßige Wirkung über Lebensmittel Bedingungen zeigt, dass diese Gene die Fähigkeit des Wurms beeinflussen, Veränderungen in Lebensmitteln Fülle, auf welchen Punkt weitere Untersuchung der korrekt reagieren die Ausdruck und Beantwortung dieser Gene breite Palette DR gerechtfertigt ist. Wenn jedoch die Langlebigkeit der Mutanten nicht signifikant verschieden von dem Wildtyp reagiert haben die Gene keine Rolle bei der transducing der Auswirkungen der breiten Palette DR, zumindest auf der Ebene der mittleren Lebensdauer. Wenn die Mutationen eine gleichmäßige Verschiebung der gesamte Lebensspanne Antwort bewirken haben die Gene eine Lebensmittel-unabhängige Wirkung auf Langlebigkeit. Dies schließt nicht die Möglichkeit, die die Expression der Gene von Interesse ist Essen mehr reagiert, in welchem Fall die Informationen von diesen Genen getragen nicht auf Lebensdauer übertragen wird.

Die nächste Stufe des Protokolls ist es festzustellen, wie Ausdruck Niveaus unter DR breit-Spektrum für die Gene von Interesse zu ändern. Abbildung 1Bzeigen wir dies durch die Levels Ausdruck eines transkriptionelle Reporter von Daf-7, die eine Reaktion auf Änderungen im Gastro-Level in der ASI sensorischen Neuronen zeigt. In eine daf-7(-) Mutante ist die Ausdruck Antwort des transkriptionellen Reporters verändert. Wenn die Gene von Interesse wirklich Essen-auf der Ebene der Lebensdauer reagieren kann man erwarten, dass ihren Ausdruck auch mit Lebensmitteln ändert. Entsprechend sollte ein transcriptional Reporter im mutierten Hintergrund eine veränderte Expressionsprofil als Reaktion auf breite Palette DR haben. Es ist jedoch auch möglich, dass die transkriptionelle Reporter das gen des Interesses an einem Wildtyp-Hintergrund nicht essen eine geschlechtergerechte Änderungen im Ausdruck angezeigt wird. In diesem Fall kann dies eine posttranskriptionale regulierende Wirkung hinweisen, die außerhalb des Anwendungsbereichs dieses Protokolls liegt.

In Diana Et Al. (2017)13, extrahiert wir Ausdruckswerte für Daf-7 in ASI und Tph-1 im ADF und NSM. In Abbildung 2Azeigen wir die Schätzung der Ausdruck Verteilung in ASI und ADF für ein bestimmtes Lebensmittel-Niveau. Mehrere Anzeigen von einzelnen Wurm Bilder ermöglicht es uns, nicht nur die Menge an Informationen, die unabhängig von jedem Neuron, sondern auch die kombinatorischen Informationen der gesamten neuronalen Schaltung (Abbildung 2B-2 C) kodiert zu analysieren. Kombination dieser beiden Informationen-theoretic Maßnahmen ermöglicht es uns, das System in Bezug auf die Codierung Strategie durch die Neuronen Informationsvermittlung über Lebensmittel zu charakterisieren. Der Redundanz in der Schaltung erhalten Sie durch die Summe der gegenseitigen Informationen für jedes Neuron und Subtraktion die gemeinsame gegenseitige Informationen (Kanalkapazität) unter Berücksichtigung der kombinatorischen Auslesen der Schaltung. Ein positiver Wert für diesen Unterschied bezeichnet eine redundante Charakters der Codierung Strategie, weil die kumulative Informationen zwischen den Teilen größer als die eigentliche Information kodiert, indem die gesamte Schaltung ist. Umgekehrt spiegelt ein negativer Wert eine synergistische Strategie, weil die wahre Informationen codiert größer als die Summe seiner Bestandteile (Abbildung 2B ist). Information und Redundanz können über verschiedene Genotypen zu möglichen höheren Ordnung Rollen der Genregulation, zum Beispiel in Diana Et Al. verglichen werden (2017) 13 die Wirkung von Daf-7 Mutation schaltet die Codierung Strategie von redundanten synergistische (Abbildung 2C-2D).

Figure 1
Abbildung 1 : Reaktion der Lebensdauer und gen Ausdruck unter breiter Palette DR. (A) die mittlere Lebensdauer der Wildtyp N2 Belastung (schwarze Linie) zeigt eine komplexe Reaktion auf breite Palette DR. Das Ausmaß dieser Reaktion ist in einer null-Mutante von Daf-7 -gen (rote Linie) abgeschwächt. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts, gepoolte Daten aus Entchev Et al. (2015) 12. (B) die mittlere Ausdruck eines transkriptionelle Reporter für das Daf-7 -gen in Wildtyp-Hintergrund (schwarze Linie) auch anzeigen eine komplexe nicht monoton Antwort auf breite Palette DR. Im daf-7(-) genetischen Hintergrund der Ausdruck dieser transkriptionelle Reporter ist sehr gedämpft und zeigt wenig Reaktion auf Änderungen in Gastro-Level. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts, Daten aus einer einzigen Studie in Entchev Et al. (2015) 12. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Computational Methodik. (A) Abbildung der zweidimensionalen Dichte Schätzung der Tph-1 Expression in ADF und Daf-7 Ausdruck in ASI wie aus dem "ks" R-Paket mit einem Rastermaß 30 x 30 zu erhalten. (B) Visualisierung der Informationen kodiert, indem der gemeinsame Ausdruck der Tph-1 und Daf-7 (ganz) und individuell (Summe der Teile) für ADF, ASI und NSM Neuronen. Redundante und synergistische Zeichen der Codierung werden durch die Differenz zwischen der Höhe der gestapelten Balken auf der rechten Seite und die Informationen, die durch die gesamte Leitung verschlüsselt dargestellt. (C) Vergleich zwischen Lebensmittelinformationen kodiert, indem Wildtyp Tiere und daf-7(-) Mutanten. (D) die Reduzierung der Transinformation beobachtet in den Mutanten wird durch einen Schalter in Richtung synergistische Codierung begleitet. Platten B-D sind adaptiert von Diana Et al. (2017) 13. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Bakterienkonzentration (Zellen/ml) Optische Dichte (600nm) Verdünnungsfaktor (früherer)
1.12E + 10 56.000 0.00
2.00E + 09 10.000 5.60
6.32E + 08 3.160 3.16
6.32E + 07 0.316 10.00 Uhr
2.00E + 07 0,100 3.16
0 (S basal) 0.000 NA

Tabelle 1: Essen Ebenen und Verdünnungsfaktoren verwendet in breiter Palette DR. Bakterienl (Zellen/mL) verwendete Konzentrationen im breiten Sortiment DR Protokoll, zusammen mit ihren jeweiligen OD600 Messungen und den Verdünnungsfaktor verpflichtet jede Konzentration von der vorherigen zu erreichen.

Experimentelle Temperatur Lebensdauer
Tag 12,5 ° C 15° C 17,5 ° C 20° C 22,5 ° C 25° C 27,5 ° C
-12 Alle Stämme zu frischen NGM Platten aufteilen und pflegen bei 20° C
-11
-10 P0-Generation von daf-7(-) Stämmen einrichten und verwalten bei 20° C (1 L4 pro Platte, 5 Platten)
-9 P0-Generation von Wildtyp-Stämme einrichten und verwalten bei 20° C (1 L4 pro Platte, 5 Platten)
-8
-7
-6
-5 F1-Generation von daf-7(-) Stämmen einrichten und verwalten bei 20° C (1 L4 pro Platte, 90 Platten)
-4 F1-Generation von Wildtyp-Stämmen einrichten und verwalten bei 20° C (1 L4 pro Platte, 30 Platten)
-3
-2
-1
0 Wählen Sie F2 L4-Larven, > Ei-5 RNAi-Platten und pflegen bei 20° C (15 L4 pro Platte, 24 Platten)
1 NSC-Platten ausgesät mit 2.0E + 9 Zellen/ml-Gastro-Level 1 Tag alt Erwachsene nach und pflegen bei 20 ° C
2 Bewegen Sie 2 - Tage alten Erwachsene, NSC-Platten mit experimentellen Speisen Bedingungen ausgesät und experimentelle Temperatur
3 Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer
4
5 Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer
6
7 Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer
8
9 Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer
10
11 Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer Transfer
12
13
14 Transfer Transfer Transfer Transfer
15
16
17
18 Transfer Transfer
19
20
21
22 Transfer

Tabelle 2: Zeitplan für die Lebensdauer bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Schematische Übersicht über die Schritte breit-Spektrum DR Lebensdauer Experimente bei unterschiedlichen Temperaturen mit daf-7(-) und Wildtyp-Stämme als Beispiele einrichten musste. Die Anzahl der Übertragungen auf frische Platten des Levels experimentelle Essen sinkt mit steigender Temperatur. Dies ist für die Tatsache, dass Tiere bei höheren Temperaturen schneller altern und so eine mehr anfällig für körperliche Schäden pro Transfer.

Tagen IMA
Ging Pipeline -14 Chunk-Reporter-Stämme in daf(-) Hintergrund. Halten Sie bei 20 ° C. -13 Chunk Reporter Stämme in Wildtyp-Hintergrund. Halten Sie bei 20 ° C. -12 P0-Generation von daf-7(-) Reporter Stämme eingerichtet. Verwenden Sie 3 L4-Larven pro 10cm NGM Platte. 2 Platten Bedienung und Wartung bei 20 ° C. -11 -10 P0-Generation von Wildtyp-Reporter-Stämme eingerichtet. Verwenden Sie 3 L4-Larven pro 10cm NGM Platte. 2 Platten Bedienung und Wartung bei 20 ° C. -9 -8 F1-Generation daf-7(-) Reporter Stämme eingerichtet. Verwenden Sie 3 L4-Larven pro 10cm NGM Platte. 12 Platten Verwendung und Wartung bei 20 ° C. -7 -6 Richten Sie die F1-Generation von Wildtyp-Reporter-Stämmen. Verwenden Sie 3 L4-Larven pro 10cm NGM Platte. 4 Platten Verwendung und Wartung bei 20 ° C. -5 -4 -3 Bleichen daf-7(-) Reporter Stämme Nachmittag (~ 5 Uhr) und Eiern auf 3 10cm NGM Platten zu hinterlegen und pflegen bei 20 ° C. -2 Bleichmittel Wildtyp Reporter Stämme in Morgen (~ 10 bin) und Kaution Eiern auf 3 10 cm NGM Platten und pflegen bei 20 ° C. -1 0 Waschen Sie L4 auf 10 cm Ei-5 RNAi Teller. 3 Platten pro Stamm Bedienung und Wartung bei 20 ° C. 1 Waschen Sie 1 Tag Erwachsene NSC Platten ausgesät mit 2.0E + 9 Zellen / ml. 3 Platten pro Stamm Bedienung und Wartung bei 20 ° C. 2 Wash 2 Tag Erwachsene NSC Platten ausgesät mit experimentellen Speisen. Verwenden Sie 3 Platten pro Sorte und Verlagerung auf experimentelle Temperatur. 3 Transfer zum frischen NSC-Platten. 3 Platten pro Stamm zu verwenden und auf experimentelle Temperatur zu halten. 4 5 Transfer zum frischen NSC-Platten. 3 Platten pro Stamm zu verwenden und auf experimentelle Temperatur zu halten. 6 Wählen Sie Tiere aus Platten und bereiten Sie für die Bildgebung.

Tabelle 3: Zeitplan für imaging Pipeline. Schematische Übersicht über die notwendigen Schritte zur breiten Palette DR imaging Experimente mit fluoreszierenden transkriptionelle Reporter Stämme daf-7(-) und Wildtyp Hintergrund bei unterschiedlichen Temperaturen als Beispiele einrichten.

Discussion

Hier präsentieren wir Ihnen eine neue Methode für diätetische Einschränkung, die eine viel breitere Palette von Lebensmittel-Konzentrationen als zuvor veröffentlichten Protokolle kapselt. Diese Methode verbindet zwei bisher getrennte Phänomene in C. Elegans DR Literatur gesehen, bakterielle Deprivation und klassische diätetische Einschränkung, so dass beide diätetische Effekte zu studierte unter einem Protokoll. Mit dem neuen breiten Palette DR Paradigma, präsentieren wir einen allgemeinen Rahmen für die Prüfung der Einzelzelle Genexpression in Reaktion auf einen spezifischen ökologischen Cue und bestimmen, wie diese Zelle Informationen kodiert. Unser Rahmen besteht aus zwei experimentelle Protokolle, die veranschaulichen, wie Lebensdauer und quantitative Bildgebung, bzw. durchgeführt, unter breiter Palette DR. Data aus dieser experimentelle Protokolle können dann mit der computergestützten Analysen geprüft werden diesem Rahmen, die Informationen kodiert durch Veränderungen in der gen-Expression-Ebenen oder Laufzeiten über verschiedene Lebensmittel-Bedingungen zu quantifizieren.

Lebensdauer-Experimente mit breiter Palette DR Paradigma umfassen sechs verschiedene Lebensmittel Ebenen (Tabelle 1). Dies erfordert einen arbeitsintensiven Ansatz als Prüfung Langlebigkeit unter weniger essen Ebenen wie diätetische Entbehrung10,11 oder über das Essen 2 genetischen Hintergrund35. Prüfung auf Lebensdauer unter einer einzigen Bedingung kann jedoch die Interpretationen der Rolle eines Gens in DR einschränken. Beispielsweise haben wir vor kurzem gezeigt, dass Daf-7 Mutanten eine bidirektionale Dämpfung der Reaktion auf Lebensmittel-Konzentration im Vergleich zum Wildtyp Tiere12 (Abbildung 1A haben). In Ermangelung von Lebensmitteln anzeigen Daf-7 Mutanten eine Verkürzung ihrer Lebensdauer im Vergleich zu Wildtyp-Tieren. Wenn wir nur diätetischen Mangel betrachtet hatte, wir würden haben interpretiert, dass das Daf-7 -gen als notwendig für nur Lebensdauerverlängerung, , Daf-7 Rolle viel komplexer ist. Daher ist das entscheidende Ergebnis dieses Teils des Protokolls, ob ein Gen des Interesses herzustellen modulieren die gesamte Antwort Lebensdauer für Änderungen in Hülle und Fülle Essen beteiligt ist.

Ein großer Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zu anderen Methoden ist, dass es eine neuartige Methode verwendet, um Nachkommen Produktion bei den Tieren Lebensdauer Analyse unterziehen zu beseitigen. Die meisten Studien verwenden Sie das Medikament FuDR, um Verbreitung der Keimbahn bei Erwachsenen, wodurch sie steril zu hemmen. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, FuDR Behandlung Zustand und Gen-spezifischen Auswirkungen auf die Lebensdauer17,18,19,20,21, vordringen können die allgemeine Anwendbarkeit in Frage zu stellen. In diesem Protokoll, Beseitigung von Nachkommen Produktion wird erreicht durch eine 24 h Behandlung von Tieren mit Ausrichtung auf das Ei-5 -gen, das hemmt die Bildung von Chitin Eierschale von RNAi befruchtet C. Elegans Eizellen wiederum ihre Tod,22,23. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es sehr spät wirkend und so stört nicht die Keimbahn, die ein wichtiger der Langlebigkeit in C. Elegans Regulator.

Eine mögliche Einschränkung des breiten Palette DR Protokolls ist seine Abhängigkeit von der Verwendung von Antibiotika, bakterielle Vermehrung um enge Kontrolle der Bakterienkonzentration gewährleisten zu kontrollieren. Bakterielle Vermehrung im Darm des Wurms ist bekanntermaßen eine Hauptursache des Todes in C. Elegans16. So bakteriostatische Antibiotika, wie z. B. Carbenicillin in NGM Agar verhindert bakterielle Proliferation und erhöht die Lebensdauer der Würmer im Vergleich zu nicht-Antibiotikum Kontrollen16. Bestimmte Antibiotika wie Rifampicin36 und Mitglieder von Tetracyclin Familie37,38, haben gezeigt worden, um Lebensdauer in C. Elegans unabhängig von ihrer Wirkung auf bakterielle verlängern Verbreitung. Allerdings gibt es keine Hinweise in der Literatur, dass entweder Carbenicillin oder Streptomycin Langlebigkeit unabhängig von ihrer Wirkung auf bakterielle Vermehrung erhöhen kann.

Lebensdauer kann als die Ausgabe einer komplexen Berechnung wo Umweltinformationen, geleitet durch Genexpression in neuronalen Netzwerken, Physiologie übermittelt angesehen werden. Unser Protokoll bietet eine Methode um zu verstehen, wie bestimmte Gene beeinflussen diese Strömung von Umweltinformationen. Um diese Frage zu lösen, brauchen wir zuverlässige Bildverarbeitung um die Verteilung von gen Ausdruck Antworten auf die einzelne Zelle Ebene zu bestimmen. Die Möglichkeit, nicht nur die durchschnittliche Antwort der Genexpression, ändert sich in Hülle und Fülle Essen aber auch die vollständige statistische Verteilung von großen Populationen stellt eine wichtige Voraussetzung für die Anwendbarkeit der Methode zu schätzen. Diese genaue Beschreibung der gen Ausdruck Reaktionen auf Lebensmittel Fülle ermöglicht die Anwendung der Informationstheorie, die Informationen kodiert, indem die spezifischen Nervenzellen sowie die Codierung Strategie durch die neuralen Schaltkreis zu quantifizieren.

Die bildgebenden und rechnerische Aspekte der in diesem Protokoll beschriebenen Methoden sind anwendbar auf eine größere Gruppe von biologischen zusammenhängen. In unserer Arbeit konzentrierten wir uns auf ein kleines neuronales Netz beteiligt Essen abfragend, beschränken sich jedoch die Analysen der Informationsverarbeitung Funktionen nicht zu einem bestimmten Zelltyp oder bestimmte ökologische Hinweise. In Zukunft können diese Methoden möglicherweise zu einer größeren Vielfalt an Eingabevariablen, beeinträchtigen keine physiologische Ausgabe erweitert werden. Diese Ansätze trägt zu einem besseren Verständnis der wie gen Regulationsnetzwerke kodieren, Prozess und Informationen zu übermitteln.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir bedanken uns bei den Bargmann und Horvitz Labors für Reagenzien. Einige Stämme lieferte die CGC, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Wir danken auch M. Lipovsek für Kommentare auf das Manuskript. Diese Forschung wurde von der Wellcome Trust (Project Grant 087146, Q.C), BBSRC (BB/H020500/1 und BB/M00757X/1, Q.C), European Research Council (NeuroAge 242666, Q.C), US National Institute of Health (R01AG035317 und R01GM088333, H.L) und USA unterstützt. National Science Foundation (0954578, H.L., 0946809 GRFP, M.Z).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin di-Sodium salt Sigma-Aldrich C1389-5G Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt Sigma-Aldrich S6501-50G Antibiotic
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758-10G Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 71380-1KG-M Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) Sigma-Aldrich 1.05104.1000 Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791-1KG Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M2643-1KG Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 71687-500G Used for bleaching
Pluronic-F127 Sigma-Aldrich P2443-1KG Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO) Sigma-Aldrich 1.05614.2500 Used for bleaching
LB Broth Invitrogen 12780052 Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 628960 Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 664160 Plates for imaging
Low Retention P200 tips Brandt 732832 Tips for handling worms in liquid
Agar BD 214510 Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone BD 211820 Peptone for NGM, RNAi and NSC plates

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References

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Genetik Ausgabe 126 diätetische Einschränkung High-Throughput Imaging Informationstheorie Neurowissenschaften Mikrofluidik neuronale Kodierung Genexpression
Quantifizierung der Information kodiert durch Gene Expression Ebenen während der Lebensdauer Modulation unter breiter Palette diätetische Einschränkung in <em>C. elegans</em>
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Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. V., Zhan, M., Lu, H., Ch'ng, Q. Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans. J. Vis. Exp. (126), e56292, doi:10.3791/56292 (2017).

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