Summary
在这里,我们提出一个框架,以宽范围饮食限制涉及基因表达和使用寿命。我们描述协议为宽范围限制饮食和定量成像的这个范式下的基因表达。我们进一步列出了计算分析,以揭示潜在的信息处理功能的基因电路参与食品遥感。
Abstract
感官系统允许动物进行检测,处理,及对他们的环境作出反应。食物丰富度是环境的提示,有深远的影响,对动物生理和行为。最近,我们表明,长寿的秀丽隐杆线虫线虫的食物丰富度调制比以前认为的更复杂。寿命到食物水平变化的响应能力是由作用是通过控制信息处理内神经电路的特定基因决定的。我们的框架结合遗传分析、 高通量定量成像和信息理论。在这里,我们描述如何使用这些技术来描述任何具有宽范围限制饮食的生理相关性的基因。具体来说,此工作流被为了揭示如何感兴趣的基因调节寿命下宽范围限制饮食;然后建立基因的表达是如何随食物水平;和最后,提供的信息量客观的量化传达的关于食物丰富度环境中的基因表达。当几个基因同时神经电路的语境下,检查此工作流可以发现电路所采用的编码战略。
Introduction
所有的有机体需要能够感知和响应变化的环境,以确保他们的生存。在动物中,中枢神经系统原发性探测器和换能器的有关环境的信息和协调对任何可能会影响生物的生存1的变化的生理反应。食物丰富度是环境的提示,在多个上下文中具有很好的研究,不仅调节食品相关的行为,如觅食2,而且也会影响长寿的动物。寿命的食物丰富度变化的调制是一种现象称为饮食限制 (DR) 和具有广泛的进化环境保育3。
秀丽隐杆线虫线虫是一个强大的模型系统为解决基本的生物学问题。大量的技术已经发展到了允许蠕虫病毒基因组,如编辑技巧的 RNAi 和体内基因操纵。小的物理尺寸的蠕虫和光学透明度也把自己借给体内成像的两个转录和翻译荧光记者和实用的高通量技术如微流体4。在一起,可以利用这些工具来检查如何神经电路直接动物行为。
线虫是 bacterivore 和几个已发表的方法,允许食物丰富度的精确控制,操纵8,细菌浓度5,,67.线虫研究社群,博士研究了在两个不同的上下文中。第一次可称之为 '古典博士',它反映了在降低食品中其他生物的响应中看到的变化。在这方面,减少食物丰富度从随意水平导致了越来越多的使用寿命,直到达到最佳之后这点长寿随进一步减少食品6,7, 9。第二个背景下的线虫研究了博士是膳食剥夺蠕虫的寿命增加任何细菌的食物源10,11完全去除。在 Entchev 等人 (2015 年)12,我们表明博士因这两种不同范式的复杂性可以被审查同时语境下我们称之为 '宽范围博士'。通过使用协议概述如下,我们确定了一类新的基因参与博士那双向调节对食物丰富的寿命响应并参与感觉食物12 (图 1) 的神经回路。
动物对环境变化的响应集成链接到复杂的监管交互环境信息传达给生理感官系统的生物学过程的序列。虽然这种"信息流"的机械细节往往是未知的遗传的工具可以用于获得深入了解这个复杂的计算如何组织之间不同的生物成分。在我们最近的工作中,我们展示了daf 7和tph 1参与有关通过调节线虫12寿命食物传感神经电路的食物丰富的环境信息的传输,13.通过应用信息理论14的数学框架,我们就能够量化的环境信息,在位,由在daf 7和基因表达的变化表示 tph 1在跨不同食品级别的特定神经元。从这一点,我们当时无法揭示编码策略受雇于该神经回路和基因控制的方式 (图 2)。
在以下协议中,我们概述了解什么是基因的兴趣在特定神经元中表达的影响以及如何他们参与食品信息流向从环境到生命周期所需的步骤。广义地说,我们的框架分为两个实验和计算的工作流。实验方面,它是关键有突变的基因的兴趣,可以在宽范围下审查博士忠实转录记者也是必要的不同食品级基因的表达水平进行量化。能够进行了计算分析,讨论在我们的方法,数据集需要足够的尺寸,以便提供有意义的表达分布的估计。尽管我们为分析提供模板源代码,用户需要熟悉信息理论,广泛应用在我们计算框架的语言。源代码是 R 和 c + + 写的。因此,有一定的编程能力也是需要在有意义的方式加以应用的。
Protocol
1.细菌培养制备与一般蜗杆文化印版
- 准备 100 毫升的一瓶 250 毫升玻璃溶源性肉汤 (LB) 媒体和高压蒸汽灭菌。
- 接种一单菌落的 大肠埃希氏大肠杆菌 菌株 OP50 瓶和一夜之间,在 37 ° C 孵育,然后存储在 4 ° C,直到所需的文化。
- 准备 5 L 的无菌线虫生长介质 (NGM) 琼脂 15 和分装 12 毫升卷成不育 6 厘米塑料培养皿。
- 允许琼脂,一夜之间设置,然后存储在 4 ° C,直到需要。
- 种子 NGM 板至少 3 天前与冷藏 OP50 文化 225 μ L 一起使用。商店在 20 ° C,直到所需板材。
2。细菌培养和稀释实验制备
- 准备的 500 mL LB 培养基 2 L 锥形瓶中的两幅和高压蒸汽灭菌。
- 每瓶与 OP50 一单菌落接种和成长在 37 ° C 200 rpm,大约 14 h.摇晃
- 补充文化与抗生素链霉素对终浓度为 50 μ g/m l。继续摇晃在 37 ° C 的 30 分钟然后将烧瓶放在 15 分钟的冰上
- 每个文化融入单独无菌离心瓶 (理想情况下 500 毫升容量瓶以避免拆分文化) 转让 450 毫升。保留剩余文化对冰,因为它将用于确定细菌浓度。
- 降速 4500 x g 在 25 分钟,4 ℃ 冷冻的离心机组在瓶弃上清液和存储瓶上冰。
- 稀释的剩余文化从每瓶 900 μ L 无菌磅使用 1 毫升的不育磅为零分光光度计,在 100 μ L,然后确定每一种文化的 10 倍稀释,OD 600。例如,OD 600 过夜培养的 10 倍稀释 0.28 如果我们的文化都有实际的 OD 600 2.8。
- 使用细菌 1.12 x 10 10 OP50 细胞/毫升,相当于 56 OD 600 工作液。因此,使用示例 OD 600 的 2.8 从上面,重悬在 20 世纪 的原始卷,在这种情况下是 22.50 mL 的颗粒从 450 毫升文化。重悬细菌与不育的 S 基部解决方案,辅以链霉素对 50 μ g/m l (某人 + 链球菌)。
- 悬小球在适当体积的无菌某人 + 链球菌。
- 使从某人的工作股票系列稀释实验中使用的所有后续浓度 + 链球菌使用稀释因素表 1 中列出。
3。设置了寿命实验
注: 寿命测定上演 6 厘米治疗组培充满 12 毫升的 NGM 琼脂辅以链霉素和羧苄青霉素 (NSC),两者在终浓度为 50 μ g/m l。这些组织培养板很适合寿命检测在没有或很低细菌浓度,如蠕虫是大大不易粘壁的盘子和干燥。两种不同的抗生素使用防止 OP50 应变发展耐药,这非常关键的控制板上的细菌浓度。此外,通过灭活细菌与抗生素,我们减少对蠕虫的生命周期,由于病原感染 16 的影响。这使我们能够考虑只在这些实验中细菌浓度食品相关组件。许多 线虫 衰老研究补充 NGM 板与化学氟-2 ′-脱氧尿苷 (FUdR) 来呈现成人不育。然而,使用 FUdR 可以会有问题因为它的使用可能会导致混淆的几个问题与长寿化验 17 , , 18 19 , 20 21.Entchev 等人 (2015 年) 12 鸡蛋 5 22 , 23,阻碍了 RNAi L4 幼虫暴露规避此问题卵母细胞胚胎过渡通过阻断的蛋壳的形成受精 线虫 卵母细胞造成他们死亡。
将测定的- 文化 线虫 株种子 NGM 板在 20 ° C.允许盘子会饿死,确保所有的动物都是种植在一种统一的方式和潜在占任何跨代影响发育条件。
- 转让饿 L1 幼虫新种子 NGM 板切割出一块小小的琼脂 (5 毫米 × 5 毫米) 从饥饿的板使用无菌手术刀和下置于一个新的板块,过程被称为 ' 分块 ' 由 线虫 研究国际信息通信展览会团结 15。直到他们到达 L4 阶段成长的蠕虫。每株 5 L4 幼虫转移到个人种子 NGM 板然后保持在 20 ° c。这些动物代表 P0 代。
- 使用 L4 P0 一代树立 F1 代的后代。个别地方的野生型 N2 应变到 30 种子 NGM 板 F1 L4 幼虫。
注: 对于突变株,所需的塔板数取决于其生长速度。例如,daf-7(ok3125) 动物经过瞬态 dauer 逮捕在 20 ° c。因此,该菌株产生少 L4 幼虫比 N2 野生型板蠕虫。 - 为了弥补这种差异,建立了前一天的 daf-7(ok3125) 板比 N2 板和更多,好的工作比是 3:1。
- 传输同步 L4 级后代 F1 家长对 NGM 板辅以 1 mM IPTG 和 50 微克/毫升的羧苄青霉素 (RNAi 板),播种了 225 微升的 HT115 细菌表达针对 鸡蛋-5 基因的双链 Rna 并保持在20 ° C 为 24 小时。每株,保持在 15 动物每板,密度至少 360 蠕虫需要每实验。
- 后 鸡蛋 5 RNAi 治疗,转移蠕虫到 NSC 板播种了 225 µ L 的链霉素治疗 OP50 在浓度为 2 x 10 9 细胞/毫升 (表 1) 额外的 24 小时在 20 ° c。这和所有后续传送期间避免对蠕虫的物理损坏,轻轻舀动物从下面蠕虫使用非常薄的微微弯曲的蠕虫挑选。关闭该蠕虫动物摘浸入某人 + 链球菌 10 微升滴浮放在新板的表面。
- 第二天,重新分配到 NSC 板代表每个食品级 l 蠕虫在表 1,以及一套包含没有细菌的 NSC 板的协助。种子 225 微升相关浓度的细菌,所有 NSC 板和都种子无菌 NSC 板的 225 微升某人 + 链球菌感染。保持在密度板,在每个食品条件每株至少四个板块造成每 15 动物蠕虫。印版转移到所需的实验温度。
- 转让蠕虫到新鲜 NSC 板种子与适当的食物浓度根据 表 2 中列出的时间表。 通过轻轻地戳丝运动的
- 得分动物挑。未能响应得分为死亡。分数动物死亡在每次转让点,然后日常后最后的传送点。
4。设置了成像实验
注: 本节中介绍的步骤是不足以产生足够蠕虫每应变成像在给定温度的一个实验食品状况。本议定书可以缩放以适合的条件将在任何给定的一天拍摄数量。但是,应该注意在实验设计以确保时限是合理和各地不同品系的动物并没有年龄差异大于成像的一天 12 小时。强烈建议转录的记者能够用于成像是单拷贝转基因,因为这将越来越接近本机的基因的调控。议定书 》 概述如下,并总结了在 表 3 中,还提供了获取匹配的大型同步年龄人口的菌株,可以用于其他实验的工作流的简化的方法.
- 文化在成像上 10 厘米治疗组织培养板,以便的蠕虫密度更大的实验动物 (∼ 100 动物每板) 比寿命测定。
- 10 厘米盘子装满 30 毫升 NGM 琼脂平板和种子与冷藏 OP50 文化交样形成的五个 225 微升整除数。
5。最初的文化记者菌株
将测定的- 文化 线虫 株种子 NGM 板在 20 ° C.允许盘子会饿死,确保所有的动物都是种植在一种统一的方式和潜在的任何帐户发展条件跨代影响。
- 块饥饿的 L1 幼虫对种子 NGM 板和成长直到他们到达 L4 阶段。将三个 L4 幼虫每株转移到两个种子 NGM 板在 20 ° c。这些动物代表 P0 代。
- 使用 P0 代 L4 后代可以设置 F1 代。地方野生型记者应变到 4 种子 NGM 板 F1 L4 的幼虫。对于突变株,所需的塔板数取决于其生长速度。采用 daf-7(ok3125) 上面的示例,在这种背景下记者株需要三次车牌和需要成立两天前记者野生型菌株,占增长率的差异。
6。鸡蛋收集和同步的记者菌株
注: 线虫 衰老研究社会兴趣的一些基因导致生长和产蛋的缺陷当发生变异,使它更难生成同步人口众多的不同基因型的动物。例如,daf-7(ok3125) 突变导致与野生型 N2 应变蛋的严重缺陷。因此,要得到充分同步 L4 幼虫为定量成像实验的不同菌株的数目必须比手动选择蠕虫更健壮的方法论。为此,转录记者株遭到次氯酸钠 (次氯酸钠) / 氢氧化钠 (NaOH) 溶液治疗妊娠成人打破打开动物和它们的蛋,通常被称为过程中解放出来 ' 漂白' 由 线虫 研究社区 15.
- 帐户的增长差异之间株率和计算时应该收获和漂白板的每一株。例如,当野生型和 daf-7(ok3125) 记者菌株进行双氧水漂白,见 表 3。
- 串行洗的给定应变掉盘子,蠕虫上相应的一天,使用 15 毫升的某人和收集在一个无菌 15 毫升管。允许该动物对自然沉积物,然后调整到 7 毫升液体的体积。
- 添加 2 毫升的 5%次氯酸钠和 1 毫升的 5 M 氢氧化钠管含妊娠成人。轻轻摇动的混合物在室温下不超过 3 分钟。次氯酸钠会杀死细菌和蠕虫,而氢氧化钠导致蠕虫掰开释放任何受精的鸡蛋,它们包含进液体。甲壳素蛋壳胚胎周围保护他们从治疗的疗效,只要曝光时间仍然相对较短。经过 3 分钟孵化,涡管 ~ 30 s,以便进行进一步解体的蠕虫尸体。
- 后在 1,x g 1 分钟颗粒鸡蛋混合物 3 分钟孵化降速。吸出大部分的上清液用无菌玻璃吸管连接到一个保温瓶,在每个管,离开 ~0.5 毫升,以免惊扰鸡蛋。
- 重悬颗粒与 9.5 毫升的某人,然后重复离心步骤和再悬浮步骤增加两倍,鸡蛋已经被冲刷与某人共三次。
- 后最后洗,颗粒通过离心鸡蛋,然后丢弃所有但 0.5 毫升的上清液。在剩余的 0.5 毫升的某人,然后分装 100 微升到三个 10 厘米种子 NGM 板悬蛋。在每个印版上的所有五个细菌草坪平均分配 100 微升。野生型菌株,政府不应存放鸡蛋在密度大于 200 每板。
- 保持板在 20 ° C 48 小时,并争取一群高度均一的 L4 幼虫。菌株生长延迟表型,是不宜作为可用多产卵和增加孵化时间。例如,保持 daf-7(ok3125)-包含记者菌株在 20 ° C ~ 64 h 允许鸡蛋孵化,达到 L4 阶段。
7。记者菌株与 鸡蛋 5 RNAi 治疗
- 连续清洗掉三个盘子使用 15 毫升的某人蠕虫和收集无菌 15 毫升管内的液体。允许 L4 幼虫对自然沉积物,然后吸出所有但 ~0.5 毫升的液体。在野生 type 记者株,这一步中移除任何比 L4 年轻的幼虫。在突变的背景,这一步艾滋病的任何被捕的幼虫,如 dauers 在 daf-7(ok3125) 的情况下去除。
- 重悬 9 毫升的某人与蠕虫。又在此基础上,监测沉积速率的 L4 幼虫,然后吸出所有但 ~0.5 毫升的上清液一旦大多数 L4 幼虫有颗粒。再一次重复此过程。然后吸出所有但 ~0.5 毫升的液体,一旦 L4 幼虫绝大多数已经谈妥了。
- 添加 10 µ L 的不育的基生辅以 0.1%尼克 F-127 (某人 + Plu) 到含 L4 幼虫的液体。这作为表面活性剂,防止幼虫坚持塑料吸液管的内表面。
- 轻轻重悬采用 5 x 225 微升的 鸡蛋 5 RNAi 细菌 P200 低保留针提示和种子都是的三个 10 厘米 RNAi 盘子上然后分装 150 微升的幼虫。确保蠕虫同样分布在所有五个细菌草坪。
- 一旦液体已被吸收进琼脂培养基中,删除任何非 L4 幼虫从不被淘汰的洗涤程序手动拿的板材。然后将存储在 20 ° C 为 24 h.板
8。宽范围博士启动
注: 后 24h 鸡蛋 5 RNAi 治疗,在板表面沉积了最初的 L4 幼虫会已成为 1 日龄成虫。
- 摘下任何年轻的幼虫,在现阶段,在板上留下只 1 日龄的成年人掉逃脱事先手工清除步骤。
- 对于每个应变,洗 1 日龄成虫从 15 毫升的不育某人 + 链球菌三个板成 15 毫升管。允许自然沉积物,蠕虫,然后吸出所有但 0.5 毫升的上清液。重悬与 9.5 毫升的某人 + 链球菌感染蠕虫和重复的沉淀和洗涤步骤。
- 后最后洗,允许蠕虫到沉积物,然后所有但 0.5 毫升的上清液吸出。添加 10 微升某人 + Plu 和轻轻地重悬使用 P200 针提示,然后分装 100 μ L 接种了 5 x 225 微升细菌浓度 2 x 10 9 细胞/ml NSC 板上的幼虫。
- 分发 100 微升均匀地分布到所有五个细菌草坪。在显微镜下估计目前在盘子上的动物的数量: 目的是要之间 100-150 蠕虫在盘子上。
- 确定实现蠕虫密度在此范围内,然后分装两个额外盘子内的所需的液体的体积。调整的关于第一板块也落入这个范围,然后存储在 20 ° C 为 24 h.板蠕虫数
- 第二天,收集 2 天老成人,并将分发给新 NSC 板种子随着所需实验浓度的食品 (表 1),重复步骤 2 和 3 所述的方法。一旦液体被吸收进琼脂培养基中,转移到所需的实验温度为 24 h.板
- 第二天,收集 3 天老成人,并将分发给种子与食物,重用方法步骤 8.3 及 8.4 所述的相同实验浓度的新鲜 NSC 板。一旦液体被吸收进琼脂培养基中,返回板实验温度为 48 h.
- 收集 5 日龄成虫,并将分发给种子与食物,重用方法步骤 8.3 及 8.4 所述的相同实验浓度的新鲜 NSC 板。一旦液体被吸收进琼脂培养基中,返回板实验温度为 24 h.
9。记者菌株的微流控成像
- 在成年后第 6 天,图像使用自定义的微流控平台 24 , 25 的动物。物理上摘下动物从三个板块,并暂停在含 4.5 毫升的某人 + 链球菌 5 毫升低温管。
- 一次蠕虫泥沙,所有但 ~0.5 毫升的上清液吸出,重动物悬在某人 + 链球菌 4 毫升。这个洗中移除多余的细菌可能会以其它方式干扰成像。这种蠕虫引入自定义微流控装置通过压力驱动流 24 , 25。在该装置内蠕虫个体是改行并被困在由自定义软件的控制下的压力驱动芯片上阀门 26 门控成像通道内。
- 一旦蠕虫一头被困在成像通道,收集一个荧光的 z 栈,与在 2 µ m 步骤中,使用标准的荧光显微镜与 X 油目的 (1.3 NA) 和相机的 40 50 节。为每个转录记者同时使用排放分离器和存储分析收集红色和绿色的荧光图像。图像采集自动使用自定义软件。
- 处理图像自动使用自定义 MATLAB 脚本 27 (可在 https://github.com/meizhan/SVMelegans)。Z 栈都加载到 MATLAB 和分析来识别神经元对及其在成像平面内的位置。然后计算的最大的预测,并利用阈值分割算法查找单个荧光细胞。细胞识别然后计算基于相对距离和位置内蠕虫 ' s 头。
- 量化记者荧光,从 z 堆栈中提取三维容量在每个细胞的位置附近。在大量一致的最亮的像素,完全封装中所有案件的整个单元格积分强度。
- 以消除干扰从肠道自体荧光的每一种动物,实验条件特定或特定应变的变化通过估算模式的计算背景强度为最近的肠道 (ADF 和 ASI) 的细胞对周围的神经元卷中的光强分布。减去从综合的荧光来获得最终的输出此背景强度值。
10。数据集
注: 通过图像处理软件分析的所有神经元的荧光强度组合成的筛选的表达式数据文件 (美联储) 用来估计基因的分布概况表达式 (模板 R c + + 的脚本,并可在 https://github.com/giovannidiana/templates)。
- 手动检查每个处理图像的所有单元格的正确鉴定确认。错误的细胞识别的图像必须排除文件中记录。在戴安娜等人 (2017) 13 排除的文件由一个二进制表组成与 ' 0 ' 为纠正和 ' 1 ' 识别不正确的单元格。表中的行数等于蠕虫成像成像的每个单元格的列 (即 ASI、 ADF 和 NSM) 数目。
- 生成美联储文件:
- 运行 bash 脚本 " gen_data + 时间 " 以生成细胞特异性结合从每只虫成像获得的表达式值的文件筛选使用排除的文件。为每个文件夹,生成的图像处理软件,bash 脚本读取注释文件 < folderprefix > _EXP.txt 提取的实验条件和排除的文件 < folderprefix > _X.csv,只有正确选择发现的神经元。表达式的值从文件中读取 < folderprefix > _data_ < 神经元 >.csv。
- 连接到的所有文件 " FED_split.dat " 和排序的实验批次代码、 蜗杆标签和细胞身份。
- 运行 " 排序 " (c + + 程序,使用:./ 排序 FED_split.dat FED_merged.dat) 与非零荧光每个单元格选择条目并将它们合并为单个行中 FED_merged.dat。
11。估计的信息编码
注: 下面的过程描述如何量化编码的基因表达的具体环境条件有关的信息。在戴安娜 等.(2017) 13,编码食物丰富度环境中的信息进行了检查,但是,这一方法本身是适用于任意离散数量的环境状态。量化信息理论的变量,例如信息熵或冗余的基本要素之一是考虑设置环境刺激下的神经反应的联合概率分布。若要执行此类估计,是关键要有足够的抽样响应的整个种群的蠕虫。高斯分布可以估计从相对较小的样品;然而,它是重要的是有一个想法的表达分布的预期形状量化可靠密度估计的适当的样本大小。由于各不同试验不可避免的变化,就必须检查从不同重复相同的实验获得的分布的中心值,不系统地被转移或任何的统计特征表达分布没有显著改变各试验中。万一审判审判变异性与内每项试验变异性兼容,至关重要的是要平衡试验与数的蠕虫内试验出影响审判审判那些环境/生物因素平均次数变异性。欠采样这些因素,有严重偏向信息理论分析.
- " code3D.R " 提供一个模板用于生成基于文件的三维密度 " FED_merged.dat ",修改此模板根据特定的美联储标题格式。该列表 " HeaderNames " 表示同时美联储文件中每个字段的名称 " RONames " 是读数的名单。该脚本使用 R 包 ' ks ' 28 , 29,估计多元分布与 GS 的正规网格内垃圾桶在细分的最小和最大值之间的范围的每个维度每个读数,dataset 中的值。当内部变量 " 组 " 设置为 0 的所有数据都用于密度估计。当 " 组 " 标签是数据集划分为 5 的不相交集,1 到 5 之间和表达密度估计从 80%的数据产生的排斥的五套之一。此功能稍后用于估计的不确定性。
注意: 使用的 code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < 食品 > < GS > < outfolder > < 标签 > < 集团 > < 压裂 > GT 表示基因型,食物是环境条件下,outfolder 是预先存在的文件夹将存储分布,标签是文件名前缀,、 压裂是用的数据集的一部分。
注意: 前面的步骤提供的条件概率分布估计 其中 g 表示所有读出的矢量,f 是环境条件。然而,计算基因表达和环境 30 , 31 之间的互信息。
我们需要输入的分布 从而也决定了 (输入-) 平均基因表达 。当输入的分布不是直接可用的时有意义的数量,以明确的编码特征是信道容量,可以通过跨所有可能输入分布,最大限度地互信息。
注: 信息编码系统的估计受多个来源的不确定性,包括密度估计的选择算法和样品的尺寸偏差。应使用不同的密度估计方法来评估介绍了每种算法的系统性偏差的大小重复步骤 11.1 11.2。
12。冗余、 噪声和信号的相关性计算
- 使用最优输入分布从估计的最大的信息来计算互信息 之间的每个神经元 N 的输入和基因表达响应。C + + 源文件 " GetMI1D.c " 是一个示例程序,从联合概率分布获取边际互信息。
- 利用互信息的获得以上每个神经元的总和计算冗余,然后减去信道容量。
- 计算 " 洗牌 " 信息词 13 , 34。C + + 模板源文件中可以发现在 " GetShuffle.c ".
- 使用 " 洗牌 " 术语来计算信号和噪声的相关性。为特定的信号l 相关我们有 和噪声相关我们有 .
- 不确定性对冗余,获得噪声和信号相关的数据和采用标准差的总信息 (前一节的步骤 11.3) 从多个采样的 80%。
Representative Results
通过进行突变体基因的兴趣与野生型 N2 应变寿命实验,一个可以建立是否这些基因在宽范围博士食品响应中发挥作用。野生型反应应该类似于图 1所示。这种反应的突变体,反映了非均匀效应的整个食品的条件,任何调制指示这些基因是如何影响该蠕虫能够正确响应更改,在食物丰富度,在哪点进一步调查对宽范围博士的这些基因表达响应被必要。如果,然而,突变体的长寿反应并不明显不同于野生型基因有没有转导的宽范围博士影响至少一级的平均使用寿命的作用。如果基因突变导致的整个寿命响应统一转变基因有长寿食品独立影响。这并不排除出感兴趣的基因的表达是食物敏感,在这种情况下,由这些基因的信息不会传递给使用寿命的可能性。
议定书 》 的下一个阶段是兴趣的确定如何表达水平改变下宽范围博士为基因。在图 1B,我们说明这通过daf-7,在食物中 ASI 感觉神经元水平显示响应更改转录记者的表达水平。在一个daf-7(-)突变体,改变了转录记者表达响应。如果感兴趣的基因是真正食物快速响应的寿命一级然后就可以预期他们表达也会改变与食物。相应地,在突变体为背景的转录记者应有表达改变配置文件宽范围博士回应。但是,它也可能是基因的野生型背景感兴趣转录记者中不显示任何食物反应的变化,在表达式中。在这种情况,这可能表明本议定书范围之内的转录调节作用。
在戴安娜等人 (2017)13,我们提取表达式值为daf 7在 ASI 和 ADF 和 NSM tph 1 。在图 2A,我们说明了 ASI 和 ADF 为给定的食物水平的表达分布的估计。有多个读数从单一蠕虫图像使我们能够分析不仅独立编码的每个神经元,但整个神经电路 (图 2B-2 C) 的组合信息的信息量。结合这两项的信息理论措施允许我们来表征系统的神经元的编码策略来传达有关食物的信息。在电路中的冗余量可以通过采取互信息的每个神经元数目和联合互信息 (信道容量) 通过考虑电路的组合读数中减去。这种差异为正值表示冗余字符的编码策略因为零部件之间的累积信息大于编码由整个电路的实际信息。相反一个负的值反映了协同的战略因为真实信息编码大于其组件 (图 2B) 的总和。信息和冗余可以跨不同的基因型,以探讨可能高顺序作用的基因调控,例如在戴安娜等人进行比较(2017)13的daf 7突变影响切换到协同 (图 2C-2D) 从冗余编码策略。
图 1: 响应的寿命和基因表达下宽范围博士(A) 平均寿命的野生型 N2 应变 (黑线) 显示宽范围博士的复杂反应。此反应的规模被衰减在空的突变体的daf 7基因 (红线)。误差线代表的意思,从 Entchev等人汇集数据的标准误差(2015 年)12.(B) 平均表达水平的野生型背景 (黑线) daf 7基因转录的记者也显示宽范围博士非单调的复杂反应。Daf-7(-)遗传背景中的转录记者表达高度减毒和在食品水平显示小响应的变化。误差线代表的意思,数据从 Entchev等人单独审判的标准误差(2015 年)12.请点击这里查看此图的大版本。
图 2:计算方法.(A) 插图的二维密度估计的tph-1表达的 ADF 和daf 7表达的 ASI 所得 'ks' R 包使用网格尺寸 30 × 30。(B) 可视化的信息编码的tph 1和daf 7 (整体) 的联合表达和单独 (部分的总和) ADF、 ASI 和 NSM 神经元。冗余和协同字符编码的表示由堆积条形图右边的高度和信息编码的完整电路之间的区别。(C) 比较食品信息编码的野生型动物和daf-7(-)突变体。(D) 减少互信息在突变体中观察到的被伴随着对协同编码开关。小组 B-D 都改编自戴安娜等.(2017)13.请点击这里查看此图的大版本。
细菌浓度 (细胞/毫升) | 光密度 (600nm 处) | 稀释因子 (从以前的) |
1.12E + 10 | 56.000 | 0.00 |
2.00E + 09 | 10.000 | 5.60 |
6.32E + 08 | 3.160 | 3.16 |
6.32E + 07 | 0.316 | 10.00 |
2.00E + 07 | 0.100 | 3.16 |
0 (S 基) | 0.000 | NA |
表 1: 食物水平及稀释因素在宽范围博士用细菌l 浓度 (细胞/毫升) 使用在宽范围博士协议,以及他们各自的 OD600测量和实现每个浓度从上一个所需的稀释倍数。
实验温度为寿命 | |||||||
一天 | 12.5 ° C | 15 ° C | 17.5 ° C | 20 ° C | 22.5 ° C | 25 ° C | 27.5 ° C |
-12 | 大块新鲜 NGM 板所有菌株和保持在 20 ° C | ||||||
-11 | |||||||
-10 | 设置 P0 daf-7(-) 菌株的生成和维护在 20 ° C (每板 1 L4、 5 版) | ||||||
-9 | 设置 P0 一代的野生型菌株和保持在 20 ° C (每板 1 L4、 5 版) | ||||||
-8 | |||||||
-7 | |||||||
-6 | |||||||
-5 | 设置 daf-7(-) 菌株的 F1 代和保持在 20 ° C (每板 1 L4、 90 板) | ||||||
-4 | 建立了野生型菌株的 F1 代和保持在 20 ° C (每板 1 L4、 30 个板块) | ||||||
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0 | 拿到 F2 L4 幼虫 > 蛋 5 RNAi 板和保持在 20 ° C (15 L4 每板,24 片) | ||||||
1 | 1 日龄成虫移动到 NSC 板与 2.0 e + 9 细胞/毫升食品级种子,并保持在 20 ° C | ||||||
2 | 移动 2 日龄成虫,到实验温度和 NSC 板实验食品条件下种子 | ||||||
3 | 转让 | 转让 | 转让 | 转让 | 转让 | 转让 | 转让 |
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表 2: 在不同温度下的寿命的时间表进行。步骤来设置宽范围博士寿命在不同温度下,使用daf-7(-)和野生型菌株作为例子的实验所需的纲要。数量转移到新鲜板的每个实验食品水平随温度的升高。这是占动物在较高温度下老化的速度快的事实,所以更倾向于物理伤害,每份转让。
天 | Ima |
表 3: 成像管道时间表。步骤来设置成像实验使用荧光转录记者株在不同温度下的daf-7(-)和野生型背景作为例子的宽范围博士所需的纲要。
Discussion
在这里,我们提出新方法封装广泛得多的食物浓度比以前发布协议的饮食限制。此方法链接两个以前单独现象见于线虫博士文学、 细菌剥夺和古典的饮食限制,允许两个饮食的影响,要研究下一个协议。我们使用新的宽范围博士范式,目前检查单个细胞基因表达在特定的环境提示响应和确定此单元格如何对信息进行编码的一般框架。我们的框架包括说明如何执行寿命和定量成像,分别的两个实验协议下宽范围, 从这些实验协议博士数据然后可以检查与中提供的计算分析这一框架进行量化编码的基因的表达水平或寿命的变化跨不同的食物条件的信息。
使用宽范围博士范式的寿命实验涉及六个独特的食物水平 (表 1)。这就需要比检查较少的食物水平,如膳食剥夺10,11下长寿或使用吃 2遗传背景35更劳动密集型的解决办法。然而,审查在单一条件下的寿命可以限制博士的基因作用的解释。例如,我们最近表明, daf 7突变体食物浓度相比野生型动物12 (图 1A) 响应双向衰减。在没有食物的情况下, daf 7突变体显示野生型动物相比其寿命的缩短。如果我们只考虑膳食剥夺,我们将解释, daf 7基因作为必要只寿命延长,时事实上daf 7作用是更复杂。因此,关键的结果议定书 》 的这一部分是寿命的去确定是否感兴趣的基因参与调制在食物丰富整体响应的变化。
本议定书与其他方法相比的一大优点是,它使用一种新的方法来消除后代生产在经历寿命分析的动物。大多数研究使用药物 FuDR 成人呈现他们不育系的增殖抑制作用。然而,最近的研究表明 FuDR 治疗可以有条件和基因特异性影响寿命17,,1819,20,21,调用到质疑其普遍适用性。在本议定书,消除后代的生产通过 24 小时实现治疗的动物与 rna 干扰靶向的鸡蛋 5基因,抑制几丁质蛋壳的形成受精线虫卵母细胞导致他们死亡22,23。此方法的优点是寿命的它是寿命的非常晚代理,所以不会干扰的胚,是寿命的一个主要调节器,线虫。
一个潜在的警告,宽范围博士议定书 》 是对使用的抗生素来控制细菌的增殖,从而确保严格控制空气细菌浓度的依赖。蠕虫在肠道内的细菌扩散是已知事件中线虫16的主要死因。因此,抑菌抗生素,如羧苄青霉素 NGM 琼脂中的使用可以防止细菌扩散,增加寿命的蠕虫相比,非抗生素控制16。某些类型的抗生素,如利福平36和四环素家庭37,38,成员已被证明延长寿命中的线虫独立及其对细菌的影响扩散。然而,尚无证据在文献中羧苄青霉素或链霉素可增加长寿独立及其对细菌增殖的影响。
使用寿命可以看作一个复杂的计算的输出地方环境信息,通过基因表达中的神经网络,路由转交生理学。我们的协议提供了一种方法来理解特定基因如何影响这流动的环境信息。为了解决这个问题,我们需要可靠的图像处理,以确定在单个细胞水平基因表达响应的分布。能够估计不仅对基因表达的平均响应更改在食物丰富,也从大量人口的全面统计分布表示适用方法的一项重要要求。食物丰富基因表达回应此准确描述允许应用程序信息理论的量化编码的特定神经元的信息,以及神经电路所采用的编码战略。
在本议定书中概述的方法的成像和计算方面都适用于生物背景一大套。我们的工作,我们重点放在小的神经网络所涉及的食物传感,然而,信息处理功能的分析并不限于特定的单元格类型或具体环境线索。在将来,这些方法可能给予的输入变量,影响任何生理的输出更大的品种。这些方法将有助于更好地理解基因调控网络是如何编码的过程和传输信息。
Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
我们感谢巴格曼和霍维茨的实验室试剂。毛细管气相色谱法,这由美国国立卫生研究院办公室的研究基础设施项目 (P40 OD010440) 提供了一些毒株。我们还感谢 M.Lipovsek 对手稿 》 的评论。这项研究受维康信托基金会 (项目赠款 087146 向王室法律顾问)、 BBSRC (BB/H020500/1 和 BB/M00757X/1 对王室法律顾问)、 欧洲研究理事会 (NeuroAge 242666 向王室法律顾问)、 美国国立卫生研究院 (R01AG035317 和 R01GM088333 到 H.L.) 和美国国家自然科学基金 (0954578 到 H.L.,分别被称为 M.Z 到 0946809 GRFP)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |
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