Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56292
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3,4, 2,3,4, 1
1Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, 2Interdisciplinary Bioengineering Graduate Program, Georgia Institute of Technology, 3Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 4School of Chemical & Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים מסגרת להתייחס הגבלות תזונתיות מגוון רחב ביטוי גנים ואת תוחלת החיים. אנו מתארים פרוטוקולים עבור הגבלות תזונתיות מגוון רחב, הדמיה כמותית של ביטוי גנים תחת הפרדיגמה הזו. אנחנו עוד חלוקה לרמות ניתוחים חישובית לחשוף שבבסיס תכונות עיבוד המידע של מעגלים גנטי מעורב חישה מזון.

Abstract

המערכות התחושתיות מאפשרים לבעלי חיים לאתר, לעבד, ולהגיב לסביבתם. שפע מזון הסימן הסביבה זה יש השפעה עמוקה על פיזיולוגיה של בעלי חיים ואת ההתנהגות. לאחרונה, הראינו כי אפנון לאריכות ימים בתולעים נימיות Caenorhabditis elegans על ידי שפע מזון היא יותר מורכבת ממה מזוהה בעבר. התגובה של תוחלת החיים לשינויים ברמת האוכל נקבעת על ידי גנים ספציפיים שפועלים על ידי שליטה מידע עיבוד בתוך מעגל עצבי. מסגרת שלנו משלב ניתוח גנטי, הדמיה כמותיים תפוקה גבוהה, תורת האינפורמציה. כאן, אנו נתאר כיצד טכניקות אלה ניתן להשתמש כדי לאפיין כל הגן בעל רלוונטיות פיזיולוגיים של הגבלות תזונתיות מגוון רחב. באופן ספציפי, זרימת עבודה זו נועדה לחשוף כמה גנים עניין מווסת את תוחלת החיים תחת הגבלות תזונתיות מגוון רחב; אז כדי לקבוע כיצד הביטוי של הגן משתנה עם רמת אוכל; בסופו של דבר, כדי לספק של כימות לא משוחדת של כמות המידע שנמסר על-ידי ביטוי גנים על שפע מזון בסביבה. כאשר מספר גנים נבדקים בו זמנית במסגרת ההקשר של מעגל עצבי, זרימת עבודה זו יכולה לחשוף את האסטרטגיה קידוד מועסק על ידי המעגל.

Introduction

כל האורגניזמים צריכים להיות מסוגלים לחוש ולהגיב לשינויים בסביבה כדי להבטיח את הישרדותם. ב בעלי חיים, מערכת העצבים הוא גלאי ראשי ומתמר של מידע אודות הסביבה והיא גם מתאמת את התגובה הפיזיולוגית לשינוי העלולות להשפיע על האורגניזם הישרדות1. שפע מזון הסימן הסביבה כי היא למדה היטב בהקשרים מרובים לא רק מסדיר התנהגויות הקשורות מזון, כגון הרעיה2, אלא גם משפיע על תוחלת החיים של חיה. האפנון של תוחלת החיים על ידי שינויים בשפע מזון הוא תופעה הידועה הגבלות תזונתיות (ד ר), ויש לו שימור אבולוציונית רחב3.

תולעים נימיות Caenorhabditis elegans הוא מערכת מודל חזק למיעון השאלות הביולוגיות הבסיסיות. פותחו למגוון רחב של טכניקות, המאפשרות מניפולציה של הגנום תולעת, כגון גן RNAi, ויוו עריכה טכניקות. גודל פיזי קטן של התולעת ושקיפות האופטי שלה גם להשאיל את עצמם ויוו הדמיה של שני גנים ברמת השעתוק והתרגום פלורסנט כתבים, השירות של תפוקה גבוהה טכנולוגיות כגון מיקרופלואידיקה4. יחד, ניתן לשלוט בכלים אלה כדי לבחון את המעגלים העצביים איך התנהגות בעלי חיים ישירה.

C. elegans bacterivore ויש מספר שיטות פורסמו המאפשרים שליטה מדויקת של שפע מזון על-ידי מניפולציה ריכוז חיידקי5,6,7,8 . בתוך קהילת המחקר C. elegans , ד ר נחקרה בהקשרים שונים שני. הראשון ניתן לכנות 'ד ר הקלאסית', כמו זה משקף את השינויים ראיתי בתגובה להפחתת רמות מזון אורגניזמים אחרים. בהקשר זה, הפחתת מזון שפע מרמות ad libitum תוצאות הגדלת תוחלת החיים עד אופטימום מתמלאת, לאחר אריכות ימים זה נקודת יורדת עם צמצום נוסף של מזון6,7, 9. ההקשר השני תחת אשר נחקרה ד ר C . elegans הוא מניעת התזונה שבו תוחלת החיים של התולעים מתגברת על ידי הסרה מלאה של כל מקור מזון חיידקי10,11. ב- Entchev et al. (2015)12, הראינו כי המורכבות. ד ר הנובע אלה שתי פרדיגמות שונות שניתן יהיה לבחון בו זמנית תחת הקשר אנו המונח 'מגוון רחב דר'. באמצעות פרוטוקול המפורטות להלן, זיהינו מחלקה חדשה של גנים המעורבים ד ר את ההכפלה לווסת את תוחלת החיים בתגובה שפע מזון, מעורבים את המעגלים העצביים המרגישות מזון12 (איור 1).

התגובה של חיה שינויים בסביבת משלבת רצף של תהליכים ביולוגיים לקשר מערכת החישה לאינטרקציות רגולטוריות מורכבות שינוע מידע סביבתי פיזיולוגיה. למרות הפרטים מכניסטית של כזה "זרימת המידע" לעתים קרובות לא ידוע, ניתן להשתמש בכלים גנטיים לרכוש תובנה כיצד זה חישוב מורכבים מאורגן בין מרכיבים ביולוגיים שונים. העבודה האחרונה שלנו, אנחנו הראו כי הדף היומי-7 ו- tph-1 המעורבים השידור של הסביבה מידע על שפע מזון דרך מעגל עצבי חישה מזון זה ממיקרו תוחלת החיים ב- C. elegans12 , 13. על-ידי החלת במסגרת תורת האינפורמציה14מתמטית, הצלחנו לכמת את כמות מידע סביבתי, במונחים של סיביות, המיוצג על-ידי השינויים ביטוי גנים הדף היומי-7 ו- tph-1 בנוירונים מסוים על פני רמות מזון שונים. מכאן, הצלחנו ואז לחשוף את האסטרטגיה קידוד המועסקים על ידי מעגל עצבי זה איך זה נקבע גנטית (איור 2).

בפרוטוקול הבא, אנחנו חלוקה לרמות השלבים הנדרשים כדי להבין מהן ההשפעות של הגנים של עניין לידי ביטוי נוירונים ספציפיים, איך הם משתתפים לזרימה של מזון מידע מן הסביבה כדי תוחלת החיים. באופן כללי, מסגרת שלנו מחולק שני פרוטוקולים ניסיוני, זרימת עבודה חישובית. על ההיבטים ניסיוני, זה קריטי יש מוטציות של גנים עניין זה תוכל להיבדק תחת מגוון רחב הכתבים תעתיק ד ר נאמן, גם צורך לכמת את רמת הביטוי של הגנים ברמות מזון שונים. כדי שתוכל לבצע את הניתוח חישובית שעלון השיטה שלנו, ערכת הנתונים צריך להיות בגודל מספיק כדי לספק הערכות משמעותי של הפצות ביטוי. למרות שאנו מספקים קודי המקור תבנית עבור הבדיקות, המשתמש צריך להיות מוכר עם השפה תיאוריית המידע שנמצא בשימוש נרחב לאורך שלנו מסגרת חישובית. קודי מקור כתובים R ו- C++. לכן, רמה מסוימת של מיומנות תכנות נדרש גם כדי להחיל אותם באופן משמעותי.

Protocol

1. הכנה של תרבויות חיידקי וצלחות לתרבות תולעת גנרל

  1. להכין 100 מ של מדיה מרק (ליברות) lysogeny בבקבוק זכוכית 250 מ ל, לעקר מאת autoclaving.
  2. לחסן את הבקבוק עם שמושבה בודדת של המתח Escherichia coli OP50 דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולאחר מכן לאחסן תרבות ב 4 ° C עד הצורך.
  3. להכין את 5 L של צמיחה נמטודות סטרילי בינונית (NGM) אגר 15 ו aliquot מ ל 12 כרכים פטרי פלסטיק סטרילית 6 ס מ.
  4. לאפשר את אגר להגדיר בין לילה ולאחר מכן אחסן ב 4 ° C עד הצורך.
  5. זרע NGM צלחות לפחות 3 ימים מראש לשימוש עם μL 225 של התרבות OP50 בקירור. לאחסן את הצלחות ב- 20 ° C עד הצורך.

2. הכנת תרביות חיידקים, דילולים לניסויים

  1. להכין שני מגרשים של 500 מ של התקשורת LB בקבוקון Erlenmeyer 2 ל' ולחטא מאת autoclaving.
  2. לחסן את כל הבקבוק עם מושבה בודדת של OP50 ולגדול ב 37 מעלות צלזיוס רועד ב rpm 200 עבור בסביבות 14 ח'
  3. תוספת התרבויות עם סטרפטומיצין לאנטיביוטיקה כדי ריכוז סופי של 50 μg/mL. המשיכו רועד במשך 30 דקות ב 37 ° C במקום אז המבחנות על קרח במשך 15 דקות
  4. העברת 450 מ של כל תרבות לתוך צנטריפוגה סטרילי נפרד בקבוקים (אידיאלי 500 מ"ל קיבולת בקבוקים כדי למנוע פיצול התרבויות). לשמר את שאריות התרבות על קרח, כמו זה ישמש כדי לקבוע ריכוז החיידקים.
  5. ספין למטה הבקבוקים ב x 4500 גרם סט צנטריפוגה בקירור ב 4 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות להשליך תגובת שיקוע ולאחסן את הבקבוקים על קרח
  6. לדלל 100 μL של תרבות שאריות של כל הבקבוק ב 900 μL של עקר LB. שימוש 1 מ ל LB סטרילי לאפס את ספקטרופוטומטרים ולאחר מכן לקבוע את יתר 600 של דילול 10-fold של כל תרבות. אם לדוגמה, ה OD 600 של דילול 10-fold של התרבות לילה הוא 0.28 אז התרבות היה של יתר בפועל 600 של 2.8.
  7. השתמש הפתרון עובד מניות של חיידקים של 1.12 x 10 10 OP50 תאים למ"ל, אשר משווה ל יתר 600 של 56. לכן, שימוש יתר דוגמה 600 של 2.8 מלמעלה, resuspend בגדר מתרבות 450-mL ב 20 th של אמצעי האחסון המקורי, אשר במקרה הזה הוא 22.50 mL. Resuspend חיידקים עם S סטרילי הבזליים פתרון בתוספת סטרפטומיצין עד 50 μg/מ"ל (SB + דלקת).
  8. Resuspend בגדר באמצעי האחסון המתאים של SB סטרילי + דלקת.
  9. להפוך כל ריכוזי הבאים נעשה שימוש בניסויים של דילולים טורי של המניה לעבוד ב SB + חיידק באמצעות הגורמים לדילול המפורטים בטבלה 1-

3. הגדרת את תוחלת החיים ניסויים

הערה: תוחלת החיים מבחני מבוצעות על תרביות רקמה 6 ס מ טיפול מלא עם 12 מ של אגר NGM בתוספת סטרפטומיצין ו- carbenicillin (המל ל), שניהם-ריכוז סופי של 50 μg/mL. הלוחיות תרביות רקמה מתאימים היטב עבור מבחני תוחלת החיים ללא או מאוד נמוך ריכוז חיידקי, כמו התולעים נוטים באופן משמעותי פחות דבק הקיר של הצלחת, desiccating. השימוש של שני סוגי אנטיביוטיקה שונים מונע את המתח OP50 לפתח עמידות לתרופות, אשר הוא קריטי בשליטה על ריכוז חיידקי על הצלחת. כמו כן, על-ידי inactivating חיידקים עם אנטיביוטיקה, להקטין את ההשפעות על תוחלת החיים של התולעת עקב זיהום פתוגניים 16. זה מאפשר לנו לחשוב רק קשורים למזון הרכיבים של ריכוז חיידקי בניסויים אלה. מחקרים רבים של הזדקנות C. elegans תוספת NGM צלחות עם פטור-2 כימיים ′-deoxyuridine (FUdR) לעיבוד המבוגרים סטרילי. עם זאת, השימוש FUdR יכול להיות בעייתי כמו השימוש בו יכול לגרום כמה בעיות מבלבלים עם תוחלת החיים מבחני 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Entchev et al. (2015) 12 תעקוף בעיה זו על ידי חשיפה של הזחלים L4 RNAi של ביצה-5 22 , 23, אשר מעכב המעבר oocyte-כדי-העובר על ידי חסימת היווצרות קליפת של מופרית oocytes C. elegans וכתוצאה מכך המוות שלהם.

  1. התרבות C. elegans שמקודדים את לבדיקה על נזרע NGM צלחות בגיל 20 מעלות צלזיוס לאפשר את הצלחות לרעוב החוצה כדי להבטיח כי כל בעלי החיים גדל בצורה אחידה, לחשבון פוטנציאלי עבור כל תופעות transgenerational של תנאים התפתחותית-
  2. העברת מורעבים L1 הזחלים ללוחות NGM הזריעה חדש על ידי חיתוך חתיכה קטנה של אגר (5 מ מ x 5 מ מ) מהצלחת מורעבים באמצעות אזמל סטרילי והנחתי אותה למטה על צלחת חדשה, תהליך המכונה ' chunking ' על ידי קשר מחקר C. elegans. אחדות 15. לגדל את התולעים עד שהם מגיעים לשלב L4. הזחלים L4 5 לכל זן ואז הועבר לוחות בודדים NGM הזריעה, שמרו ב 20 º C. בעלי חיים אלה מייצגים את הדור P0.
  3. שימוש L4 צאצא. של הדור P0 כדי להגדיר את הדור F1. בנפרד למקם F1 L4 הזחלים של המתח פראי סוג N2 על 30 צלחות NGM הזריעה.
    הערה: עבור זנים מוטציה, מספר הצלחות הנדרש תלוי קצב הצמיחה שלהם. לדוגמה, daf-7(ok3125) בעלי חיים עוברים מעצר dauer ארעי ב 20 º C. לפיכך, זן זה מייצר פחות הזחלים L4 מאשר צלחת של N2 פראי סוג התולעים.
  4. כדי לפצות על ההבדל הזה, להגדיר לוחות daf-7(ok3125) עד יום לפני כן מ- N2 צלחות, במספר גדול, יחס עובד טוב הוא 3:1.
  5. העברת מסונכרנים L4-שלב צאצא. של ההורים F1 ללוחות NGM בתוספת 1 מ"מ IPTG ו- µg/mL 50 carbenicillin (צלחות RNAi) היו נזרע עם µL 225 של חיידקים HT115 לבטא dsRNA מיקוד הגן ביצה-5, המשיכה. 20 ° C במשך 24 שעות ביממה. תולעים לפחות 360 לכל זן, שמרה על צפיפות של 15 בעלי חיים לכל צלחת, נדרשים לכל ניסוי.
  6. לאחר הביצה-5 טיפול RNAi, להעביר את התולעים לבטחון לאומי צלחות עם µL 225 של OP50 סטרפטומיצין שטופלו בריכוז של 2 x 10 9 תאים/mL (טבלה 1) 24 שעות נוספות ב 20 º C. כדי למנוע פגיעה פיזית התולעים במהלך זה, כל העברות עוקבות, בעדינות תגרדו חיות מ מתחת התולעת באמצעות תולעת בעדינות מעוקל דק מאוד לבחור. לצוף החיות את התולעת לבחור במועט זה לתוך droplet 10 µL של SB + דלקת להציב על פני השטח של הלוח החדש.
  7. למחרת, להפיץ את התולעים ללוחות לבטחון לאומי המייצגים כל אחד l רמות מזוןisted טבלה 1, כמו גם סט צלחות לבטחון לאומי המכילים אין בקטריות. זרע כל הצלחות לבטחון לאומי עם µL 225 הריכוז הרלוונטיים של חיידקים, זרע את הצלחות לבטחון לאומי ללא חיידקים עם SB 225 µL + דלקת. לשמור על התולעים-צפיפות של 15 בעלי חיים לכל צלחת, וכתוצאה מכך לפחות ארבעה לוחות לכל תנאי מזון לכל זן. להעביר את הצלחות ניסיוני הטמפרטורה הרצויה.
  8. העברת תולעים ללוחות לבטחון לאומי טריים נזרע לריכוז המזון המתאים בהתאם ללוח הזמנים המתוארים בטבלה מס ' 2-
  9. חיות הציון לתנועה על ידי לדרבן בעדינות עם חוט לבחור. כשל להגיב הוא הבקיע כמוות. לצבור חיות למוות על העברת כל נקודת יומי ואז לאחר המקודה האחרונה.

4. הגדרת את הניסויים הדמיה

הערה: השלבים המתוארים בסעיף זה מספיקים לייצר מספיק תולעים לכל זן הדמיה תנאי אחד ניסיוני מזון בטמפרטורה נתונה. פרוטוקול זה וניתן לשנותם כדי להתאים את מספר תנאים ידומה בכל יום. עם זאת, כדאי לשים לב בעיצוב ניסיוני כדי להבטיח פרק זמן סביר, כי בעלי חיים על פני זנים שונים אין גדול מ- 12 שעות ביום של הדמיה גילאים שונים. מומלץ מאוד כי הכתבים תעתיק להיות עם תמונה הם עותק יחיד transgenics, כמו זה שיהיה דומה יותר ברגולציה מקורית של הגן. פרוטוקול המפורטות להלן, מסוכמים בטבלה 3, מספק גם שיטה יעילה להשגת אוכלוסיות גדולות גיל סינכרונית מתאימים של זנים, אשר יכול לשמש עבור זרימות עבודה אחרות ניסיוני.

  1. תרבות בעלי חיים הדמיה ניסויים על 10 ס מ מטופלים צלחות תרביות רקמה כדי לאפשר צפיפות גדולה של תולעים (∼ בעלי חיים 100 לכל צלחת) מאשר תוחלת החיים מבחני.
  2. למלא את הצלחות 10 ס מ עם 30 מ של פלטות אגר NGM, זרע עם חמש 225 µL aliquots התרבות OP50 בקירור במבנה דמוי צלב.

5. ראשוניות תרבות של הכתב זנים

  1. התרבות C. elegans שמקודדים את לבדיקה על נזרע NGM צלחות בגיל 20 מעלות צלזיוס לאפשר את הצלחות לרעוב החוצה כדי להבטיח כי כל בעלי החיים גדל בצורה אחידה, לחשבון פוטנציאלי עבור כל transgenerational השפעות התנאים התפתחותית-
  2. צ'אנק L1 מורעבים את הזחלים להוסיף נזרע NGM צלחות ולגדול עד שהם מגיעים לשלב L4. להעביר את הזחלים L4 שלוש לכל זן שתי צלחות NGM הזריעה ב 20 º C. בעלי חיים אלה מייצגים את הדור P0.
  3. השתמש הוא צאצא L4 של הדור P0 כדי להגדיר את הדור F1. במקום F1 L4 הזחלים של המתח פראי סוג כתב על ארבע פלטות NGM הזריעה. עבור זנים מוטציה, מספר הצלחות הנדרש תלוי קצב הצמיחה שלהם. באמצעות הדוגמה הקודמת של daf-7(ok3125), כתב זנים ברקע הזה דורשות שלוש פעמים מספר לוחיות הרישוי, צריך להגדיר אותה יומיים לפני פראי סוג הכתב זנים, להביא בחשבון הבדלים שיעור הצמיחה.

6. ביצה-אוסף וללחצים סינכרון של הכתב

הערה: כמה גנים עניין בקהילת המחקר C. elegans הזדקנות לגרום לצמיחה, פגמים להטלת ביצים כאשר מוטציה, מה שהופך את זה קשה יותר ליצור אוכלוסיות גדולות סינכרונית של בעלי חיים שונים אחרים. לדוגמה, המוטציה daf-7(ok3125) גורם פגם להטלת ביצים קשות ביחס לסוג הפראי N2 זן. לכן, כדי לקבל מספיק מספרים של הזחלים L4 סינכרונית של זנים שונים לניסויים הדמיה כמותיים דורשת מתודולוגיה עמידים יותר מאשר באופן ידני אוסף תולעים. מסיבה זו, כתב תעתיק זנים היו נתונים של נתרן תת-כלורי (NaClO) / הידרוקסיד הנתרן (NaOH) פתרון לטיפול gravid מבוגרים לשבור פתח את החיות, לשחרר את ביציהם, תהליך נפוץ המכונה ' הלבנה ' על ידי C. elegans מחקר הקהילה 15.

  1. חשבון על ההבדלים צמיחה מדרג בין זנים ולחשב מתי צלחות של כל זן צריך להיות שנקטפו וכיבסה. לקבלת דוגמה של מתי זנים כתב wild type, daf-7(ok3125) הם מולבן ראו טבלה 3-
  2. באופן סדרתי לשטוף את התולעים של זן נתון מהצלחות, ביום המתאים, באמצעות 15 מ"ל של SB ולאסוף בשפופרת סטרילי 15 מ"ל. לאפשר, לחיות באופן טבעי משקעים ולאחר מכן התאם את עוצמת הקול של נוזל 7 מ ל.
  3. להוסיף 2 mL של 5% NaClO ו- 1 מ"ל של NaOH M 5 אל הצינור המכיל המבוגרים gravid. רוק בעדינות את התערובת בטמפרטורת החדר למשך לא יותר מ 3 דקות. NaClO יהרוג את חיידקים, תולעים, בזמן NaOH גורם התולעים להתפרק. שחרור כל הביצים הם מכילים לתוך הנוזל. כיטין קליפת הביצה מסביב העוברים מגן עליהם מפני ההשפעות של הטיפול, כל עוד זמן החשיפה נשאר קצר יחסית. לאחר 3-מין הדגירה, מערבולת הצינור ב-30 ~ s כדי להקל עוד יותר על הפרידה של הגוויות תולעת.
  4. לאחר 3-מין הדגירה ספין למטה התערובת ב x 1000 g עבור 1 דקות הצניפה את הביצים. וארוקן את מרבית תגובת שיקוע באמצעות פיפטה זכוכית סטריליים מחובר flask ואקום, בגוש ~0.5 מ"ל כל שפופרת, כדי לא להפריע את הביצים.
  5. Resuspend בגדר עם 9.5 מ ל SB ולאחר מכן חזור על שלב צנטריפוגה, resuspension צעדים נוספים פעמיים כך הביצים נשטפו עם SB בסך הכל שלוש פעמים.
  6. אחרי הגמר לשטוף, גלולה הביצים באמצעות צנטריפוגה ולאחר מכן למחוק הכל חוץ 0.5 מיליליטר תגובת שיקוע. Resuspend את הביצים ב 0.5 mL הנותרים של SB, ואז aliquot 100 µL על שלוש צלחות NGM 10 ס מ נזרע. להפיץ את µL 100 באופן שווה על פני כל המדשאות חיידקי חמישה על כל צלחת. עבור זנים פראי סוג, ביצים צריך לא להפקיד את צפיפויות גדול מ- 200 לכל צלחת-
    1. לשמור על צלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות וכדי להשיג אוכלוסיה מאוד הומוגנית של הזחלים L4. עבור זנים עם פנוטיפים עיכוב גדילה, רצוי להפקיד ביצים רבות זמינות ולהגדיל את זמן הדגירה. לדוגמה, לשמור daf-7(ok3125)-המכילים זנים כתב ב- 20 ° C עבור ~ 64 h לאפשר את הביצים בוקעות ולהגיע לבמה L4.

7. טיפול כתב זנים עם ביצה-5 RNAi

  1. באופן סדרתי לשטוף את התולעים מהצלחות 3 באמצעות 15 מ"ל של SB ולאסוף את הנוזל בשפופרת סטרילי 15 מ"ל. לאפשר את הזחלים L4 כדי באופן טבעי משקעים, תשאף ואז כולם חוץ ~0.5 מ ל הנוזל. ב- סוג פראיe כתב זנים, שלב זה מסיר כל הזחלים צעיר יותר L4. מוטציה ברקעים, שלב זה מסייע להסרת כל הזחלים נעצר כגון dauers במקרה של daf-7(ok3125).
  2. Resuspend התולעים עם 9 מ ל- SB. שוב, לנטר את קצב שקיעת הזחל L4, ואז האחות הכל חוץ מ ~0.5 ל תגובת שיקוע ברגע רוב הזחלים L4 יש מגורען. חזור על תהליך זה פעם נוספת. אז תשאף כולם חוץ ~0.5 מ"ל של הנוזל, ברגע המכריע של הזחלים L4 התיישבו.
  3. µL להוסיף 10 של הבסיס סטרילי S בתוספת 0.1% Pluronic F-127 (SB + Plu) אל הנוזל המכיל את הזחלים L4. זה פועל כמו חומרים פעילי שטח ומונעת הזחלים מפני השטח הפנימי של טיפים פיפטה פלסטיק.
    1. Resuspend בעדינות את הזחלים באמצעות טיפ פיפטה P200 השמירה נמוך ו- µL 150 ואז aliquot על גבי שלוש צלחות RNAi 10 ס מ זה הם נזרע עם 5 x 225 µL של חיידקים RNAi ביצה-5. להבטיח כי התולעים מופצים בצורה שווה על פני כל חמשת מדשאות חיידקי.
  4. , ברגע הנוזל ספג לתוך אגר, להסיר כל הזחלים שאינו-L4 הלוחות לא חוסלו על-ידי הפרוצדורה כביסה מאת ידנית לתלוש אותם. מכן לאחסן את הצלחות ב- 20 ° C עבור ה 24

8. חניכה של ד ר מגוון רחב

הערה: אחרי 24 שעות ביצה-5 טיפול RNAi, בזחלים L4 במקור הופקדו על הלוחות תהפוך להיות מבוגרים 1 - בן יום.

  1. לחסל כל בזחלים צעירים שברחו השלב להסרה ידנית מוקדמת בשלב זה משאיר רק המבוגרים 1 - בן יום על הלוחות.
  2. עבור כל זן, לשטוף את המבוגרים בן 1 יום של שלוש צלחות עם 15 מ"ל של SB + דלקת סטרילית לתוך צינור 15 מ"ל. לאפשר את התולעים כדי באופן טבעי משקעים, ואז האחות והכל אבל 0.5 מיליליטר תגובת שיקוע. Resuspend התולעים 9.5 מ ל SB + דלקת, חזור על השלבים שקיעת ושטוף.
  3. אחרי הגמר לשטוף, לאפשר את התולעים כדי משקעים, ואז האחות והכל אבל 0.5 מ של תגובת שיקוע. להוסיף 10 µL SB + אלינה, resuspend בעדינות את הזחלים באמצעות טיפ פיפטה P200 ולאחר מכן aliquot 100 µL על גבי צלחת לבטחון לאומי עם 5 x 225 µL חיידקים בחלק ריכוז עונה 2 פרק 10 9 תאים למ"ל. µL
    1. להפיץ 100 באופן שווה על פני כל חמשת מדשאות חיידקי. תחת מיקרוסקופ להעריך את מספר בעלי ההווה בצלחת: המטרה היא בין 100-150 תולעים על הצלחת.
    2. לקבוע את עוצמת הקול של נוזל נדרש כדי להשיג צפיפות תולעת בתוך זה טווח ולאחר מכן aliquot על גבי שני לוחות נוספים. לכוונן את מספר תולעים על צלחת הראשונה כדי ליפול גם טווח זה ולאחר מכן אחסן את הצלחות ב- 20 ° C עבור ה 24
  4. ביום המחרת, המבוגרים בן 2 יום איסוף והפצה ללוחות חדשה לבטחון לאומי עם הריכוז ניסיוני הרצוי של מזון (טבלה 1), שימוש חוזר השיטות המתוארות ב שלבים 2 ו- 3. ברגע הנוזל נספג על אגר, להעביר את הצלחות ניסיוני הטמפרטורה הרצויה עבור ה 24
  5. למחרת, לאסוף את המבוגרים בן 3 יום ולהפיץ ללוחות לבטחון לאומי טריים עם ריכוז ניסיוני זהה של מזון, שימוש חוזר השיטות המתוארות בשלבים 8.3 ו- 8.4. לאחר שהנוזל נספג על אגר, לחזור הלוחות הטמפרטורה ניסיוני עבור ה 48
  6. לאסוף את המבוגרים בן 5 יום ולהפיץ ללוחות לבטחון לאומי טריים עם ריכוז ניסיוני זהה של מזון, שימוש חוזר השיטות המתוארות בשלבים 8.3 ו- 8.4. לאחר שהנוזל נספג על אגר, לחזור הלוחות הטמפרטורה ניסיוני עבור ה 24

9. Microfluidic הדמיה של הכתב זנים

  1. ביום 6 של בגרות, תמונת בעלי החיים באמצעות של 24 , פלטפורמה מותאמת אישית microfluidic 25. פיזית לחסל חיות מכל הלוחות שלוש, להשהות מ ל צינור קריוגני המכילים 4.5 מ ל SB + דלקת. משקעים
    1. פעם את התולעים, תשאף הכל חוץ מ ~0.5 ל תגובת שיקוע, resuspend את בעלי החיים ב- 4 מ"ל של SB + דלקת. זו שטיפת מסיר חיידקים עודף אחרת שאולי יפריע הדמיה. התולעים הם הציגו מכשיר microfluidic מותאם אישית באמצעות לחץ מונע זרימה 24 , 25. בתוך המכשיר, תולעים בודדים הם לתוך ובימוי: לכוד בתוך ערוץ הדמיה פיקוח על-ידי מונחה לחץ על שבב שסתומים 26 תחת השליטה של תוכנות מותאמות אישית.
  2. , ברגע תולעת לכוד ונופלת בערוץ הדמיה, לאסוף ערימה z פלורסנט, עם סעיפים 50 בשלבים 2 מיקרומטר, באמצעות מיקרוסקופ רגיל epifluorescence עם 40 X שמן אובייקטיבית (1.3 NA), מצלמה. איסוף תמונות ניאון אדום וירוק לכל אחד מהכתבים תעתיק בו זמנית באמצעות הפיצול של פליטה ומאוחסנת לצורך ניתוח. ייבוא תמונות אוטומטית באמצעות תוכנה מותאמת אישית-
  3. לעבד את התמונה באופן אוטומטי באמצעות מותאם אישית MATLAB סקריפטים 27 (זמין ב- https://github.com/meizhan/SVMelegans). Z-הערימות נטען לתוך MATLAB וניתח בשביל לזהות נוירון-זוגות והמיקומים שלהם בתוך המטוס הדמיה. ההשתקפויות מקסימלית ואז מחושבים, אלגוריתם קביעת סף הוא מנוצל כדי לאתר תאים בודדים פלורסנט. זיהוי תאים ואז מחושב בהתבסס על יחסי מרחקים מיקומים בתוך התולעת ' זה הראש.
  4. לכמת כתב פלורסצנטיות, לחלץ האחסון תלת מימדי סביב כל מיקום סלולארי מ z-המחסנית. לשלב את העוצמה על פני מספר הפיקסלים המבריקים, אשר מלא לתמצת את התא כולו בכל המקרים עקבית.
  5. לחסל את ההפרעות ניסיוני שינויי תנאי ספציפי או זן ספציפי הבטן האוטומטי-זריחה של כל בעל חיים, לחשב את עוצמת רקע עבור זוגות תא הקרוב לבטן (ADF, אסי) באמצעות הערכה של המצב של התפלגות עוצמת באמצעי אחסון סביב הנוירון. הפחתה זו ערך בעוצמה רקע זריחה משולב כדי לקבל את הפלט הסופי.

10. מכלול הנתונים

הערה: עוצמות קרינה פלואורסצנטית כל הנוירונים נותחו על ידי התמונה בתוכנת עיבוד משולבים לתוך קובץ הנתונים המסוננים ביטוי (פד) אשר משמש כדי להעריך את הפרופילים הפצה של ג'ין הביטוי (תבנית R וסקריפטים C++ עומדים לרשותכם https://github.com/giovannidiana/templates).

  1. באופן ידני סימון כל עיבוד תמונה כדי לוודא זיהוי נכון עבור כל התאים. תמונות עם זיהוי מוטעה תא חייב להירשם בקובץ הדרה. בדיאנה et al. (2017) 13 הקובץ הדרה מורכבת מטבלה בינארי עם ' 0 ' עבור תקן, ' 1 ' לזיהוי תא שגויה. מספר השורות בטבלה שווה למספר של תולעים עם תמונה עם עמודה עבור כל תא עם תמונה (כלומר אסי, מזין מסמכים אוטומטי, NSM).
  2. ליצור את הקובץ פד:
    1. בניהול bash script " gen_data + זמן " כדי להפיק קבצים ספציפיים תא שילוב הערכים בביטוי המתקבל כל תולעת עם תמונה מסונן באמצעות הקובץ הדרה. עבור כל תיקיה שנוצר על ידי התמונה בתוכנת עיבוד, התסריט bash קורא את קובץ ביאור < folderprefix > _EXP.txt כדי לחלץ את תנאי הניסוי ואת קובץ ה-הדרה < folderprefix > _X.csv כדי לבחור רק כראוי לזהות את הנוירונים. ביטוי הערכים הם לקרוא מקבצי ה-< folderprefix > _data_ < תא עצב >. csv.
    2. לשרשר כל הקבצים לתוך " FED_split.dat ", מיונם לפי הקוד אצווה ניסוי, תולעת תווית וזהות תא.
    3. לרוץ " מיון " (תוכנית + + C, השימוש:. / מיון FED_split.dat FED_merged.dat) כדי לבחור ערכים עם פלורסצנטיות שאינו אפס עבור כל תא ולשלב אותן לשורות יחיד ב- FED_merged.dat.

11. הערכה של מידע מקודד

הערה: ההליך הבא מתאר כיצד ניתן לכמת את המידע אודות מסוים התנאים הסביבתיים מקודד על ידי קבוצת גנים ביטויים. ב. דיאנה et al. (2017) 13, המידע המקודד על שפע מזון בסביבה נבחנה, לעומת זאת, השיטה עצמה ישימה לכל מספר דיסקרטית של הברית סביבתיים. המרכיב העיקרי לכמת מידע והנכויות משתנים כגון מידע entropies או יתירות היא התפלגות ההסתברות משותף של ההיענויות עצבית תחת הגדרת הגירויים הסביבתיים נחשב. כדי לבצע הערכה כזו, זה הכרחי לקבל דגימה מספקת של התגובה על פני אוכלוסיות של תולעים. יכול להיות מוערך לפי עקומת גאוס הפצות מן מדגמים קטנים יחסית; עם זאת, חשוב לי רעיון של הצורה הצפוי של ההתפלגות ביטוי לכמת גודל המדגם המתאים עבור הערכה צפיפות אמין. לאור ההשתנות הבלתי נמנעת על פני ניסויים שונים, זה חיוני כדי לבדוק את הערכים המרכזיים של ההפצות המתקבל שונה חזרה של הניסוי אותו לא באופן שיטתי יוזזו או את כל התכונות הסטטיסטיות של הביטוי הפצה לא שינו באופן משמעותי על פני ניסויים. במקרה ההשתנות ומה--כן קל תואם עם ההשתנות בתוך בכל ניסוי, זה הכרחי כדי לאזן את מספר הנסיונות לעומת המספר של תולעים בתוך ניסויים כדי ממוצעים האלה גורמים סביבתיים/ביולוגיה להשפיע על המשפט-כדי-משפט השתנות. Undersampling גורמים אלו יכולת הטיה בכבדות ניתוח מידע מתורת.

  1. סקריפט כמו R " code3D.R " מספק תבנית ליצירת צפיפות תלת מימדי המבוסס על הקובץ " FED_merged.dat ", לשנות תבנית זו על פי התבנית כותרת פד ספציפיים. הרשימה " HeaderNames " מייצג את השמות של כל אחד מהשדות בקובץ פד תוך " RONames " רשימת הקריאות. קובץ ה-script משתמש החבילה R ' ks ' 28 , 29 כדי להעריך הפצות כמנבאים בתוך רשת hypercubic עם אלף ארגזים בכל ממד סוגייה משפטית הטווח בין מינימום ומקסימום ערכים ב- dataset לבדיקה לכל. כאשר המשתנה הפנימי " קבוצת " מוגדר כ- 0 כל הנתונים משמשים להערכת צפיפות. כאשר " קבוצת " תווית הוא בין 1 ל 5 ערכת הנתונים מחולק 5 קבוצות זרות, הצפיפויות הביטוי מוערך 80% של הנתונים הנובעים הדרתם של אחד מחמשת התרגילים. תכונה זו משמש בהמשך להערכת אי ודאות.
    הערה: השימוש code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < אוכל > < GS > < outfolder > < תווית > < קבוצת > < frac > שם GT מייצג את גנוטיפ, אוכל תנאי הסביבה, outfolder הוא הקיימים מראש התיקיה שבה ההפצות יאוחסנו תווית קידומת של שם הקובץ, frac הוא השבר של ערכת הנתונים המשמש.
  2. עבור כל תנאי הסביבה ליצור ההפצות כמנבאים עם רשת שונים מידות GS (למשל 20,30,40 סלי). כדי לצמצם את העומס חישובית, ערכים קטנים של GS עדיפים כאשר החלטות פיינר אינם משתנים באופן משמעותי הערכת מידע. גנים הפצה נכתבות בתיקיה < outfolder > שצוינה בעת הפעלת קבצי טקסט בעמודה יחידה code3D.R עם מבנה שם הקובץ < תווית > _ < GT > _ < מזון > _GS < GS > _group < קבוצת >. ידיים למעלה
    הערה: השלבים הקודמים לספק את ההערכה על ההפצות הסתברות מותנית Equation 1 איפה g מציין הוקטור של כל הקריאות ו- f היא התנאי סביבתיים. עם זאת, כדי לחשב את המידע הדדית בין גנים לסביבה 30 , 31-
    Equation 2
    . אנחנו צריכים את ההפצה של הקלט Equation 3 אשר קובעת גם את (קלט-) בממוצע גנים < img alt = "משוואה 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. כאשר ההתפלגות הקלט אינו זמין ישירות, כמות משמעותית לאפיון התכונות קידוד הוא קיבולת הערוץ, אשר יכולה להיות מושגת על ידי למקסם את המידע ההדדית על פני כל ההפצות קלט אפשרי.
  3. באמצעות ההתפלגות גנים, להחיל את האלגוריתם 32 Arimoto-Blahut כדי להעריך את קיבולת הערוץ של המערכת והפצה של הקלט הסביבה בדימונה מידע. דוגמה של מימוש האלגוריתם יכול להימצא בתכנית C++ " Ccap3D.cpp " לביטוי-ג'ין תלת מימדי קוד ניתח ב דיאנה et al. (2017) 13. דוגמה: אם הפצות של גנוטיפ GT123 מתקבלים מן 80% של הנתונים (קבוצה 3) עם גודל רשת שווים 30 וכל מאוחסן בתיקיה ". /pdf/ " באמצעות קידומת תווית = " PDF ". הפקודה כדי לחשב את המידע המקודד ברקע GT123. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
    הערה: הערכת מידע מקודד על ידי המערכת מושפעת ממספר מקורות של אי וודאות, כולל הבחירה של הערכת צפיפות הטיה בגודל אלגוריתם ולדגום. צעדים 11.1-11.2 יש לחזור בשיטות הערכה צפיפות שונה כדי להעריך את הגודל של האפליה השיטתית שהוצגו על ידי כל אלגוריתם.
  4. כדי להעריך הוודאות בשל גודל המדגם, חישוב מחדש של מידע מצעדי 11.1-11.2 עם קבוצות בין 1 ל 5. ההשתנות על פני אלה חמישה samplings עצמאית של 80% של הנתונים ישקפו את ההשפעה של גודל המדגם לפי הערכה מידע.
  5. לחשב מידע באמצעות צעדים 11.1-11.2 על הגדלת שבר של הנתונים (כמו בשלב 5) לתיקון הטיה גודל המדגם (שיטת Jack-knife) 33-

12. חישוב של יתירות, רעש, אות המתאם

  1. שימוש האופטימלית הפצות קלט המתקבל ההערכה של מידע מקסימלי כדי לחשב את המידע הדדית Equation 5 בין קלט וג'ין ביטוי התגובה של כל נוירון N. קובץ המקור C++ " GetMI1D.c " היא תוכנית דגימה כדי לקבל מידע הדדי שולית התפלגויות ההסתברות משותף.
  2. לחשב יתירות על ידי לקיחת הסכום מידע הדדי עבור כל נוירון שהושג לעיל, ואז לחסר את קיבולת הערוץ.
  3. חישוב " דשדוש " מידע המונח Equation 6 13 , 34. ניתן למצוא קובץ מקור תבנית C++ " GetShuffle.c ".
  4. השתמש " דשדוש " המונח לחישוב מתאם האות והרעש. עבור signaהמתאם l יש לנו Equation 7 עבור המתאם רעש יש לנו Equation 8.
  5. הוודאות על יתירות, השגת רעש של אות המתאם באשר המידע הכולל (שלב 11.3 של המקטע הקודם) מ samplings מרובים של 80% של הנתונים, לוקח את סטיית התקן של.

Representative Results

באמצעות ניסויים תוחלת חיים על המוטנטים של הגנים של עניין לצד הסוג הפרוע זן N2, אחד יכול להקים אם הגנים האלה יש תפקיד בתגובה מזון ד ר מגוון רחב. התגובה פראי סוג אמורים להיות דומים במהירותם האחד מתואר באיור 1א. כל אפנון של תגובה זו על ידי המוטציות, בא לידי ביטוי אפקט לא אחידה על פני מזון תנאים, מציין כי גנים אלו משפיעים על היכולת של התולעת כראוי מגיבות לשינויים שפע מזון, על איזו נקודה בהמשך החקירה של תגובות ביטוי של גנים אלה מגוון רחב ד ר היא מוצדקת. אם, לעומת זאת, התגובה אריכות ימים של המוטציות אינה שונה באופן מהותי מן הסוג הפרוע אז הגנים יש אין תפקיד transducing את ההשפעות של מגוון רחב, ד ר, לפחות ברמה של תוחלת החיים רעים. אם מוטציות גורמים לשינוי אחיד של התגובה תוחלת החיים כל הגנים יש השפעה עצמאית מזון על אריכות ימים. זה לא לשלול את האפשרות כי הביטוי של הגנים של עניין הוא אוכל להפסיק להגיב, בעוד שבמקרה המידע נישא על ידי הגנים האלה לא מועבר תוחלת החיים.

השלב הבא של הפרוטוקול זה כדי לקבוע כיצד לשנות רמות הביטוי תחת מגוון רחב ד ר על הגנים של עניין. איור 1B, אנחנו להמחיש זאת דרך רמות הביטוי של כתב תעתיק של הדף היומי-7, אשר מראה תגובה לשינויים ברמת האוכל בנוירונים החישה אסי. במוטציה daf-7(-) , התגובה ביטוי של גנים ברמת השעתוק הכתב היא שונה. אם הגנים של עניין הם מגיבים באמת אוכל ברמה של תוחלת החיים ואז אחד יכול לצפות כי הביטוי שלהם ישתנה גם באוכל. בהתאמה, כתב תעתיק ברקע מוטציה צריך פרופיל ביטוי שונה בתגובה ד ר מגוון רחב. עם זאת, זה גם אפשרי כי הכתב תעתיק של הגן עניין ברקע פראי סוג אינה מראה שינויים מזון מגיב בביטוי. במצב זה, זה עשוי להצביע על השפעה רגולטורית post-transcriptional שנופל מההיקף של פרוטוקול זה.

בדיאנה et al. (2017)13, שלפנו ביטוי ערכים עבור הדף היומי-7 באסי ו- tph-1 ADF NSM. איור 2א, אנו ממחישים ההערכה של ההתפלגות ביטוי אסי, מזין מסמכים אוטומטי עבור רמת האוכל נתון. יש מספר הקריאות הבאות מתמונות תולעת אחת מאפשר לנו לבחון לא רק את כמות המידע המקודד באופן עצמאי על ידי כל נוירון, אלא גם את המידע קומבינטורית של מעגל שלם עצבית (איור 2B-2 C). שילוב של אמצעי מידע מתורת שני אלה מאפשר לנו לאפיין את המערכת מבחינת האסטרטגיה קידוד המועסקים על ידי הנוירונים כדי להעביר מידע על אוכל. הכמות של יתירות במעגל ניתן להשיג על-ידי לקיחת הסכום מידע הדדי עבור כל נוירון הפחתה משותפת הדדית המידע (קיבולת הערוץ) מתקבל על ידי בהתחשב הקריאות קומבינטורית של המעגל. ערך חיובי כזה משנה מציין תו מיותר של האסטרטגיה קידוד כי המידע המצטבר בין החלקים הוא גדול יותר המידע בפועל מקודד על ידי כל המסלול. לעומת זאת ערך שלילי משקף אסטרטגיה סינרגטי כי המידע נכון מקודד הוא גדול מסכום רכיביו (איור 2B). מידע ויתירות ניתן להשוות על פני אחרים שונים לחקור תפקידים סדר גבוהה יותר אפשרי של הכונה, למשל אצל דיאנה. et al. (2017) 13 האפקט של הדף היומי-7 מוטציה מעביר את האסטרטגיה קידוד של יתיר סינרגטי (איור 2C-2D).

Figure 1
איור 1 : התגובה של הביטוי וג'ין, תוחלת החיים תחת מגוון רחב ד ר תוחלת החיים (A) הממוצע של הסוג הפרוע זן N2 (קו שחור) מציג את מורכבות בתגובה ד ר מגוון רחב. סדר הגודל של תגובה זו הוא נחלש במוטציה null של הגן הדף היומי-7 (הקו האדום). קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע, במאגר נתונים מ. Entchev et al. (2015) 12. (B) הממוצע רמות הביטוי של כתב תעתיק של הגן הדף היומי-7 ברקע פראי סוג (קו שחור) גם להציג מענה שאינם במדעי המחשב מורכבים ד ר מגוון רחב. ברקע גנטי daf-7(-) הביטוי של גנים ברמת השעתוק לכתב מאוד הקלוש ומראה קטנה תגובה לשינויים ברמת האוכל. קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע, נתונים ממשפט בודד ב-. Entchev et al. (2015) 12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : חישובית מתודולוגיה. (א) איור של צפיפות מימדי הערכה tph-1 ביטוי בביטוי אסי כפי שהתקבל מן החבילה 'ks' R באמצעות רשת ממד 30 x 30 ב- ADF והדף היומי-7 . (B) ויזואליזציה של מידע מקודד על-ידי הביטוי משותפת של tph-1 ו- 7-הדף היומי (שלם) ובאופן אינדיבידואלי (סכום חלקי) של נוירונים ב- ADF, אסי, NSM. תווים של סינרגטי של קידוד מיוצגים על ידי ההבדל בין הגובה של הסורגים מוערמים בצד הימין את המידע המקודד על ידי המעגל מלאה. (ג) השוואה בין מזון מידע מקודד על ידי חיות פראי סוג daf-7(-) מוטציות. (ד) ההפחתה של אינפורמציה הדדית שנצפתה המוטנטים מלווה מתג לכיוון קידוד סינרגטי. לוחות B-D הם ממאמרו של דיאנה. et al. (2017) 13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ריכוז חיידקי (תאים/ml) צפיפות אופטית (600nm) דילול פקטור (מ הקודם)
1.12E + 10 56.000 0.00
2.00E + 09 10.000 5.60
6.32E + 08 3.160 3.16
6.32E + 07 0.316 10.00
2.00E + 07 0.100 3.16
0 (S הבסיס) 0.000 נה

טבלה 1: רמות מזון וגורמים דילול בשימוש מגוון רחב ד ר חיידקיםl ריכוזי (תאים/mL) בשימוש פרוטוקול ד ר מגוון רחב, יחד עם המדידות600 בהתאמה שלהם OD, הגורם הדילול הנדרשים כדי להשיג בכל ריכוז מקודמו.

הטמפרטורה ניסיוני של תוחלת החיים
היום 12.5° C 15° C 17.5 º C 20° C 22.5 מעלות צלזיוס 25° C 27.5 מעלות צלזיוס
-12 צ'אנק כל זני ללוחות NGM טריים ולתחזק ב- 20° C
-11
-10 P0 דור זנים daf-7(-) ולתחזוקה ב 20 מעלות צלזיוס (L4 1 לכל צלחת, 5 צלחות)
-9 P0 דור זנים פראי סוג ולתחזוקה ב 20 מעלות צלזיוס (L4 1 לכל צלחת, 5 צלחות)
-8
-7
-6
-5 דור F1 של זנים daf-7(-) ולתחזוקה ב 20 מעלות צלזיוס (L4 1 לכל צלחת, צלחות 90)
-4 דור F1 של זנים פראי סוג ולתחזוקה ב 20 מעלות צלזיוס (L4 1 לכל צלחת, 30 צלחות)
-3
-2
-1
0 לבחור הזחלים F2 L4 כדי > RNAi ביצה-5 צלחות ולתחזק ב- 20° C (15 L4 לכל צלחת, 24 צלחות)
1 להזיז מבוגרים 1 - בן יום ללוחות לבטחון לאומי עם 2.0E + 9 תאים למ"ל מזון רמה ולשמור על-20 ° C
2 הזז מבוגרים 2 - בן יום ללוחות לבטחון לאומי עם מזון ניסיוני תנאי טמפרטורה ניסיוני
3 העברה העברה העברה העברה העברה העברה העברה
4
5 העברה העברה העברה העברה העברה העברה העברה
6
7 העברה העברה העברה העברה העברה העברה העברה
8
9 העברה העברה העברה העברה העברה העברה העברה
10
11 העברה העברה העברה העברה העברה העברה
12
13
14 העברה העברה העברה העברה
15
16
17
18 העברה העברה
19
20
21
22 העברה

בטבלה 2: לוח הזמנים עבור לכלבים שנערך בטמפרטורות שונות. חלוקה סכמטית של השלבים הדרושים כדי להגדיר מגוון רחב תוחלת החיים ד ר ניסויים בטמפרטורות שונות באמצעות daf-7(-) ו- wild type זנים כדוגמאות. מספר העברות ללוחות טריים של כל רמה ניסיוני מזון פוחתת עם העליה בטמפרטורה. . זה להביא בחשבון את העובדה חיות בטמפרטורות גבוהות יותר מזדקן מהר יותר, כך יותר נוטה נזק פיזי לכל העברה.

ימים האגודה הבינלאומית למינרלוגיה
גינג צינור -14 צ'אנק כתב זנים ברקע daf(-). שתשמור על 20 º C. -13 צ'אנק כתב זנים ברקע פראי סוג. שתשמור על 20 º C. -12 בצע כיוונון P0 דור זנים כתב daf-7(-). השתמש הזחלים 3 L4 לכל צלחת NGM 10 ס מ. שתי צלחות ולתחזוקה ב 20 º C. -11 -10 להגדיר את הדור P0 פראי סוג הכתב זנים. השתמש הזחלים 3 L4 לכל צלחת NGM 10 ס מ. שתי צלחות ולתחזוקה ב 20 º C. -9 -8 להגדיר את דור F1 של זנים כתב daf-7(-). השתמש הזחלים 3 L4 לכל צלחת NGM 10 ס מ. 12 צלחות ולתחזוקה ב 20 º C. -7 -6 להגדיר את דור F1 של פראי סוג הכתב זנים. השתמש הזחלים 3 L4 לכל צלחת NGM 10 ס מ. ארבע פלטות ולתחזוקה ב 20 º C. -5 -4 -3 אקונומיקה daf-7(-) כתב זנים אחר הצהריים (~ 5 pm), להפקיד ביצים על צלחות NGM 10 ס מ 3 ולתחזק ב 20 º C. -2 אקונומיקה פראי סוג הכתב זנים בבוקר (~ 10 אני) או פיקדון משפיעה על 3 10 ס מ NGM צלחות ולתחזק ב 20 º C. -1 0 רחץ L4 ללוחות RNAi ביצה-5 10 ס מ. 3 צלחות לכל זן ולתחזוקה ב 20 º C. 1 לרחוץ בת יום אחד מבוגרים ללוחות לבטחון לאומי עם 2.0E + 9 תאים / ml. 3 צלחות לכל זן ולתחזוקה ב 20 º C. 2 שטיפת מבוגרים 2 יום ללוחות לבטחון לאומי נזרע עם רמות מזון ניסיוני. השתמש 3 צלחות לכל זן ו- shift לחוצים לטמפרטורת ניסיוני. 3 להעביר צלחות לבטחון לאומי טריים. 3 צלחות לכל זן ולתחזוקה בטמפרטורת ניסיוני. 4 5 להעביר צלחות לבטחון לאומי טריים. 3 צלחות לכל זן ולתחזוקה בטמפרטורת ניסיוני. 6 לאסוף חיות את הצלחות ולהתכונן הדמיה.

טבלה 3: לוח הזמנים עבור הדמיה צינור. חלוקה סכמטית של השלבים הדרושים כדי להגדיר מגוון רחב ד ר הדמיה ניסויים באמצעות כתב תעתיק פלורסנט זנים ברקע daf-7(-) או פראי סוג בטמפרטורות שונות כדוגמאות.

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה חדשה עבור הגבלת תזונתיים המכיל מגוון הרבה יותר רחב של מזון ריכוזי מאשר הפרוטוקולים שפורסמו בעבר. שיטה זו מקשרת שתי תופעות נפרדות בעבר ראיתי בספרות ד ר C. elegans , מניעת חיידקים והגבלה תזונתיים קלאסי, המאפשר שתי ההשפעות תזונתיים להיות למד תחת פרוטוקול. באמצעות התפיסה החדשה של ד ר מגוון רחב, אנו מציגים את מסגרת כללית בחינת תא בודד ביטוי גנים בתגובה רמז סביבתי ספציפי וקביעה כיצד תא זה מקודד מידע. מסגרת שלנו מורכב שני פרוטוקולים ניסיוני להמחיש כיצד לבצע לכלבים והדמיה כמותית, בהתאמה, תחת מגוון רחב נתונים ד ר בפרוטוקולים ניסיוניים אלה אפשר ואז לבחון עם הניתוחים חישובית הניתנים מסגרת זו כדי לכמת את המידע המקודד על ידי שינויים רמות ביטוי גנים או לכלבים על פני תנאי מזון שונים.

תוחלת החיים ניסויים באמצעות מגוון רחב ד ר הפרדיגמה לערב מזון ברורים שש רמות (טבלה 1). זה מצריך בגישה שדורשת יותר מאשר בוחן אריכות ימים תחת רמות אוכל פחות, כגון מניעת תזונתיים10,11 או באמצעות הרקע הגנטי לאכול-2 35. עם זאת, בחינת-תוחלת החיים תחת תנאי יחיד יכול להגביל הפירושים של תפקידו של הגן ד ר. לדוגמה, אנחנו לאחרונה הראה שיש מוטציות הדף היומי-7 הנחתה דו-כיווני של התגובה מזון ריכוז לעומת חיות פראי סוג12 (איור 1 א'). בהיעדר מזון, הדף היומי-7 המוטציות להציג לקיצור של תוחלת החיים שלהם בהשוואה חיות פראי סוג. אם היה רק שקלנו מחסור תזונתי, לנו היה מפרש את זה הגן הדף היומי-7 כמו להיות הכרחי עבור הארכת תוחלת החיים רק, , כאשר למעשה הדף היומי-7 תפקיד מורכב יותר. לכן, התוצאה קריטי של חלק זה של הפרוטוקול הוא להקים אם הגן עניין מעורב הכוח ויסות התגובה הכולל של תוחלת החיים לשינויים בשפע מזון.

אחד היתרונות של פרוטוקול זה לעומת שיטות אחרות הוא שהוא משתמש שיטה לחסל את רומא ייצור את החיות שעברו ניתוח תוחלת החיים. רוב המחקרים משתמשים בסם FuDR לעכב התפשטות germline במבוגרים והוציאם סטרילי. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו טיפול FuDR יכול להיות תנאי-גנים ספציפיים או השפעות על תוחלת החיים17,18,19,20,21, מתקשר אל שאלה את תחולתן כללי. ב פרוטוקול זה, חיסול של רומא ייצור מושגת באמצעות ה 24 היחס לבעלי חיים עם RNAi מיקוד הגן ביצה-5 , אשר מעכב את היווצרות קליפת כיטין של מופרית oocytes C. elegans והתוצאה שלהם מוות22,23. היתרון של שיטה זו הוא כי זה מאוד מאוחר אקטינג, אז לא מפריע germline, אשר מווסת העיקריים של אריכות ימים C. elegans.

אחד הקונה הפוטנציאלי של פרוטוקול ד ר מגוון רחב הוא הסתמכותו על השימוש באנטיביוטיקה כדי לשלוט שגשוג חיידקים כדי להבטיח שליטה הדוקה של ריכוז חיידקי. שגשוג חיידקים בתוך הבטן של התולעת ידוע להיות הגורם העיקרי למוות ב C. elegans16. לפיכך, השימוש באנטיביוטיקה bacteriostatic, כגון carbenicillin, באגר NGM מונעת שגשוג חיידקים ומגביר את תוחלת החיים של תולעים לעומת אנטיביוטיקה שאינה שולטת16. סוגים מסוימים של אנטיביוטיקה, ריפאמפיצין36 וחברי משפחה37,טטרציקלין38, הוכחו כדי להאריך את תוחלת החיים ב- C. elegans בנפרד השפעתם על בקטריאלי התפשטות. עם זאת, יש הוכחות בספרות או carbenicillin או סטרפטומיצין יכול להגדיל את תוחלת החיים בנפרד השפעתם על שגשוג חיידקים.

תוחלת החיים ניתן להציג בתור הפלט של חישוב מורכבים בו מועבר מידע סביבתי, על ידי ביטוי גנים ברשתות עצביים, פיזיולוגיה. פרוטוקול שלנו מספק מתודולוגיה להבין גנים ספציפיים איך להשפיע על זרם זה של מידע על איכות הסביבה. כדי להתייחס לשאלה זו, אנחנו צריכים עיבוד כדי לקבוע את התפלגות התגובות ביטוי הגן ברמת תא בודד תמונה אמינה. היכולת להעריך לא רק התגובה הממוצע של ביטוי גנים כדי משתנה בשפע מזון אלא מייצג גם את ההתפלגות הסטטיסטית מלא של אוכלוסיות גדולות של הדרישה הישימות. חשוב בשיטה שלנו. זה תיאור מדויק של ביטוי גנים התגובות שפע מזון מאפשר היישום של תורת האינפורמציה לכמת את המידע המקודד על ידי הנוירונים ספציפי, כמו גם את האסטרטגיה קידוד מועסק על ידי המעגל העצבי.

הדמיה היבטים חישובית מהשיטות המתוארות ב פרוטוקול זה ישימות לקבוצה גדולה של הקשרים ביולוגיים. בעבודתנו, התמקדנו ברשת עצבית קטנה מעורב מזון חישה, עם זאת, הבדיקות של תכונות עיבוד הנתונים אינם מוגבלים סוג תא מסוים או רמזים סביבתיים מסוימים. בעתיד, מתודולוגיות אלה פוטנציאל ניתן להרחיב מגוון גדול יותר של משתני הקלט, המשפיעים על כל פלט פיזיולוגיים. הגישות הללו תורמים להבנה גדולה יותר של מה רשתות בקרה רגולטריות לקודד, תהליך ולהעביר מידע.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים המעבדות Bargmann, הורביץ על נוגדנים. זנים מסוימים נמסרו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). אנו מודים גם מ Lipovsek להערות על כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי טרסט (פרוייקט גרנט 087146 כדי עוד), BBSRC (BB/H020500/1 ו- BB/M00757X/1 כדי עוד), המועצה האירופית למחקר (NeuroAge 242666 כדי עוד), לנו מכוני הבריאות הלאומיים (R01AG035317 ו- R01GM088333 כדי מרגשת), ארה ב הקרן הלאומית למדע (0954578 ל ה. ל, GRFP 0946809 אל M.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin di-Sodium salt Sigma-Aldrich C1389-5G Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt Sigma-Aldrich S6501-50G Antibiotic
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758-10G Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 71380-1KG-M Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) Sigma-Aldrich 1.05104.1000 Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791-1KG Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M2643-1KG Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 71687-500G Used for bleaching
Pluronic-F127 Sigma-Aldrich P2443-1KG Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO) Sigma-Aldrich 1.05614.2500 Used for bleaching
LB Broth Invitrogen 12780052 Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 628960 Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 664160 Plates for imaging
Low Retention P200 tips Brandt 732832 Tips for handling worms in liquid
Agar BD 214510 Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone BD 211820 Peptone for NGM, RNAi and NSC plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. The sensory system: More than just a window to the external world. Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159 (2015).
  2. Calhoun, A. J., et al. Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans. Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).
  3. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  4. Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376 (2017).
  5. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701 (2011).
  6. Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
  7. Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS ONE. 4 (2), 4535 (2009).
  8. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media. Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152 (2009).
  9. Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. -Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).
  10. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  11. Lee, G. D., et al. Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).
  12. Entchev, E. V., et al. A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan. elife. 4, 06259 (2015).
  13. Diana, G., et al. Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit. elife. 6, (2017).
  14. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).
  15. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  16. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  17. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).
  18. Anderson, E. N., et al. C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).
  19. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).
  20. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans). Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
  21. van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).
  22. Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition. Cell. 139 (3), 560-572 (2009).
  23. Parry, J. M., et al. EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans. Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).
  24. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  25. Crane, M. M., et al. Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis. Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).
  26. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  27. Zhan, M., et al. Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans. PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194 (2015).
  28. Duong, T. Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R. Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21 (2007).
  29. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).
  30. Cover, T. M., Thomas, J. A. Elements of information theory. , Wiley. (2006).
  31. Tkacik, G., Walczak, A. M. Information transmission in genetic regulatory networks: a review. J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102 (2011).
  32. Arimoto, S. An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels. IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).
  33. Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks. Science. 334 (6054), 354-358 (2011).
  34. Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. Synergy, redundancy, and independence in population codes. J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).
  35. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  36. Golegaonkar, S., et al. Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).
  37. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  38. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).

Tags

גנטיקה גיליון 126 הגבלות תזונתיות תפוקה גבוהה הדמיה תורת האינפורמציה מדעי המוח מיקרופלואידיקה קידוד עצבי ביטוי גנים
כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב <em>C</em> . elegans
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. … More

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. V., Zhan, M., Lu, H., Ch'ng, Q. Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans. J. Vis. Exp. (126), e56292, doi:10.3791/56292 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter