Summary
نقدم هنا، إطارا قيود غذائية واسعة النطاق تتصل بالتعبير الجيني وعمر. يصف لنا البروتوكولات لتقييد نطاق واسع الغذائية والتصوير الكمي للتعبير الجيني في إطار هذا النموذج. كذلك فإننا مخطط التحليلات الحسابية للكشف عن ميزات معالجة المعلومات من الدوائر الوراثية الكامنة تشارك في الاستشعار عن بعد الغذاء.
Abstract
تسمح أنظمة حسية الحيوانات اكتشاف ومعالجة والاستجابة لبيئتهم. وفرة الغذاء هو جديلة بيئية التي لها آثار عميقة على فسيولوجيا الحيوان والسلوك. في الآونة الأخيرة، أظهرنا أن التحوير لطول العمر في ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس بوفرة الغذاء أكثر تعقيداً مما المعترف بها سابقا. استجابة العمر إلى تغييرات في مستوى الغذاء تحدده الجينات المحددة التي تعمل بالتحكم في المعلومات المعالجة داخل دائرة العصبية. لدينا إطار يجمع بين التحليل الجيني والتصوير الفائق الكمية ونظرية المعلومات. وهنا يصف لنا كيف يمكن استخدام هذه التقنيات لتوصيف أي الجينات التي له صلة فسيولوجية قيود غذائية واسعة النطاق. على وجه التحديد، تم تصميم سير العمل هذا لتكشف كيف ينظم مورثة لمصلحة عمر تحت قيود غذائية واسعة النطاق؛ ثم إلى تحديد كيفية التعبير عن الجين يختلف مع المستوى الغذائي؛ وأخيراً، توفير الكمي غير منحازة لكمية المعلومات التي تنقلها التعبير الجيني عن وفرة الغذاء في البيئة. يقوم سير العمل هذا عندما يتم فحص جينات عدة في الوقت نفسه ضمن سياق الدائرة العصبية، يمكن كشف الاستراتيجية الترميز التي تستخدمها الدائرة.
Introduction
جميع الكائنات الحية بحاجة إلى أن تكون قادرة على الشعور والاستجابة للتغييرات في البيئة لضمان بقائها. في الحيوانات، والعصبي هو الأولية للكشف عن محول طاقة للحصول على المعلومات حول البيئة وينسق الاستجابة الفسيولوجية لأي تغيير قد يؤثر على الكائن الحي للبقاء على قيد الحياة1. وفرة الغذاء هو جديلة بيئية التي يتم دراستها جيدا في سياقات متعددة لا ينظم السلوكيات المتعلقة بالأغذية، مثل مساحات العلف2، بل يؤثر أيضا طول العمر للحيوان. تحوير عمر بالتغيرات في وفرة الأغذية ظاهرة المعروفة باسم القيود الغذائية (DR)، وقد حفظ تطوري واسع3.
ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس نظام نموذجي قوية لمعالجة المسائل البيولوجية الأساسية. وقد وضعت مجموعة كبيرة تقنيات التي تسمح بالتلاعب جينوم دودة، مثل الجينات [رني] و في فيفو تقنيات التحرير. صغيرة الحجم الفعلي للدودة وشفافيته البصرية أيضا تصلح للتصوير في فيفو كل الصحفيين الفلورسنت النسخي ومتعدية الجنسيات وجدوى التكنولوجيات الإنتاجية العالية مثل ميكروفلويديكس4. معا، هذه الأدوات يمكن تسخيرها لدراسة كيف العصبية سلوك الحيوانات مباشرة من الدوائر.
C. ايليجانس باكتيريفوري وتم نشر العديد من الطرق التي تسمح بمراقبة دقيقة لوفرة الغذاء عن طريق التلاعب في تركيز البكتيرية5،،من67،8 . داخل مجتمع البحوث C. ايليجانس ، درس الدكتور في سياقين مختلفين. ويمكن وصف الأول 'الدكتور الكلاسيكية'، كما أنه يعكس التغييرات التي شهدت استجابة لانخفاض مستويات الغذاء في الكائنات الحية الأخرى. وفي هذا السياق، تناقص وفرة الغذاء من مستويات إعلانية libitum النتائج في عمر زيادة حتى يتم التوصل إلى الوجه أمثل، بعد هذه النقطة طول العمر يتناقص مع مزيد من الخفض للغذاء6،7، 9. هو سياق الثانية التي درست الدكتور في C. ايليجانس الحرمان الغذائي الذي يزداد طول عمر الديدان بالإزالة الكاملة لأي مصدر الغذاء البكتيرية10،11. في انتشيف وآخرون (2015)12، أظهرنا أنه يمكن بحث التعقد في الدكتور الناجم عن هذه النماذج المختلفة اثنين في وقت واحد ضمن سياق نحن مصطلح 'الدكتور واسع النطاق'. باستخدام بروتوكول المبينة أدناه، وقد حددنا فئة جديدة من الجينات المشتركة في الدكتور bidirectionally أن تعدل رد عمر على وفرة الغذاء ويشاركون في الدوائر العصبية التي بمعنى الغذاء12 (الشكل 1).
ويدمج استجابة الحيوان للتغييرات في البيئة سلسلة عمليات البيولوجية التي تربط النظام الحسي للتفاعلات التنظيمية المعقدة توصيل المعلومات البيئية إلى علم وظائف الأعضاء. على الرغم من أن التفاصيل آليا من هذا القبيل "تدفق المعلومات" غالباً ما تكون غير معروفة، يمكن استخدام الأدوات الجينية للحصول على نظرة ثاقبة في كيفية تنظيم هذه العملية الحسابية المعقدة بين مختلف المكونات البيولوجية. في أعماله الأخيرة، أظهرنا أن تشارك في نقل المعلومات البيئية عن وفرة الغذاء عن طريق دارة العصبية الاستشعار من الأغذية التي ينظم عمر في C. ايليجانس12 daf-7 و الهيدروكربونات النفطية-1 , 13-عن طريق تطبيق الإطار الرياضي لنظرية المعلومات14، كنا قادرين على تحديد مقدار المعلومات البيئية، من حيث بت، يتم تمثيلها بالتغييرات التعبير الجيني في daf-7 و tph-1 في الخلايا العصبية المحددة عبر مستويات مختلفة من الأغذية. ومن هذا، ثم كنا قادرين على الكشف عن استراتيجية الترميز التي تستخدمها هذه الدائرة العصبية، وكيف يتم التحكم وراثيا (الشكل 2).
في البروتوكول التالي، نحن تحديد الخطوات اللازمة لفهم ما تأثيرات جينات فائدة التي أعرب عنها في الخلايا العصبية المحددة وكيف تشارك فيها بتدفق المعلومات الغذائية من البيئة إلى عمر. عموما، يتم تقسيم إطارنا في اثنين من البروتوكولات التجريبية وسير عمل حسابي. للجوانب التجريبية، من الأهمية بمكان أن يكون طفرات الجينات من الفائدة التي يمكن دراستها ضمن نطاق واسع الصحفيين المؤمنين الدكتور النسخي أيضا ضرورية لتحديد مستوى تعبير الجينات في مستويات مختلفة من الأغذية. لتكون قادرة على القيام بالتحليل الحسابي وناقش في أسلوبنا، dataset يجب أن يكون حجم يكفي تقديم تقديرات ذات مغزى لتوزيعات التعبير. على الرغم من أن نقدم رموز المصدر قالب للتحليلات، يحتاج المستخدم لتكون على دراية بلغة نظرية المعلومات الذي يستخدم على نطاق واسع في جميع أنحاء إطارنا الحسابية. تتم كتابة رموز المصدر R و c + +. ولذلك، مستوى معيناً من البرمجة إجادة مطلوب أيضا تطبيقها بطريقة ذات مغزى.
Protocol
1-التحضير للثقافات البكتيرية ولوحات للثقافة العامة دودة
- تحضير 100 مل الإعلام مرق (رطل) ليسوجيني في زجاجة زجاج 250 مل وتعقيمها قبل التعقيم.
- تطعيم الزجاجة مع مستعمرة واحدة من سلالة الإشريكيّة القولونية OP50 واحتضانها في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ومن ثم تخزين الثقافة في 4 درجات مئوية حتى الحاجة.
- إعداد ل 5 من نمو السلكية العقيمة أجار (NGM) متوسطة 15 وقاسمه أحجام 12 مل في أطباق بتري بلاستيكية معقمة 6 سم.
- تسمح أجار تعيين بين عشية وضحاها وتخزينها ثم في 4 درجات مئوية حتى حاجة-
- لوحات NGM البذور على الأقل 3 أيام قبل الاستخدام مع 225 ميكروليتر من ثقافة OP50 المبردة. تخزين لوحات عند 20 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
2. إعداد الثقافات البكتيرية وتخفيف للتجارب
- إعداد اثنين من الكثير من 500 مل وسائط رطل في قارورة Erlenmeyer ل 2 وتعقيمها قبل التعقيم.
- تطعيم كل قارورة مع مستعمرة واحدة من OP50 وتنمو في 37 درجة مئوية تهز 200 لفة في الدقيقة لحوالي 14 حاء
- الملحق الثقافات مع ستربتوميسين المضادات الحيوية إلى تركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل. مواصلة تهتز عند 37 درجة مئوية و 30 دقيقة ثم ضع في قوارير على الجليد ل 15 دقيقة
- نقل 450 مل من كل ثقافة في زجاجات معقمة منفصلة للطرد المركزي (من الناحية المثالية 500 مل القدرات زجاجات تجنب تقسيم الثقافات). الاحتفاظ ببقايا ثقافة على الجليد، كما سيتم استخدامه لتحديد تركيز البكتيريا.
- تدور أسفل الزجاجات على 4500 س ز في مجموعة تبريد أجهزة الطرد مركزي في 4 درجات مئوية للحد الأدنى 25 تجاهل المادة طافية وتخزين الزجاجات على مدت
- تمييع 100 ميكروليتر من بقايا الثقافة من كل قارورة في 900 ميكروليتر معقمة رطل استخدام 1 مل من رطل العقيمة إلى الصفر جهاز المطياف الضوئي، ومن ثم تحديد OD 600 من إضعاف إذ لكل ثقافة. إذا، على سبيل المثال، OD 600 لتمييع الثقافة بين عشية وضحاها إذ هو 0.28 ثم الثقافة كان OD الفعلية 600 من 2.8-
- استخدام حل أسهم عامل من البكتيريا من 1.12 × 10 10 OP50 خلايا/مل، الذي يعادل OD 600 من 56. ولذلك، استخدام OD المثال 600 2.8 من أعلاه، ريسوسبيند بيليه من ثقافة 450 مل في 20 th المجلد الأصلي، وفي هذه الحالة مل 22.50. ريسوسبيند البكتيريا مع حل القاعدية S عقيمة وتستكمل مع ستربتوميسين إلى 50 ميكروغرام/مل (SB + بكتيريا).
- ريسوسبيند بيليه في حجم مناسب SB معقمة + بكتيريا.
- جعل جميع التركيزات اللاحقة المستخدمة في التجارب من تسلسلي تخفيف المخزون العامل في بينالي الشارقة + استخدام بكتيريا إضعاف العوامل المذكورة في الجدول 1-
3. الإعداد حتى عمر التجارب
ملاحظة: تجري فحوصات عمر على زراعة الأنسجة 6 سم تعامل مليئة 12 مل أجار NGM تكملة مع ستربتوميسين وكاربينيسيلين (مجلس الأمن القومي)، وكلاهما في تركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل. هذه اللوحات زراعة الأنسجة مناسبة تماما لفحوصات عمر أي أو جداً انخفاض تركيزات بكتيرية، كما الديدان إلى حد كبير أقل عرضه للالتصاق بالجدار اللوحة وديسيككاتينج. يمنع استعمال المضادات الحيوية المختلفة اثنين سلالة OP50 من تطوير مقاومة العقاقير، مما له أهمية حاسمة في تركيز البكتيريا في اللوحة التحكم. أيضا، بتعطيل البكتيريا بالمضادات الحيوية، علينا التقليل من آثار على عمر دودة بسبب العدوى الممرضة 16. وهذا يسمح لنا النظر فقط المكونات المتعلقة بالأغذية من تركيز البكتيرية في هذه التجارب. استكمال دراسات الشيخوخة C. ايليجانس العديد من لوحات NGM مع مخفضات الكيميائية-2 ′-ديوكسيوريديني (فودر) لتقديم الكبار العقيمة. مع ذلك، يمكن استخدام فودر إشكالية أن استخدامها يمكن أن يسبب عدة قضايا التباس مع طول العمر فحوصات 17 ، ، من 18 19 ، 20 ، 21-انتشيف et al. (2015) 12 الالتفاف حول هذه المسألة قبل التعرض لليرقات L4 [رني] بيضة-5 22 ، 23، الذي يحول دون انتقال البويضات إلى الجنين بعرقلة تشكيل قشر البيض من إخصاب بويضات C. ايليجانس أدى إلى موتهم.
سلالات- الثقافة C. ايليجانس الذي سيتم اختباره في المصنف لوحات NGM في 20 درجة مئوية. السماح لوحات لتجويع بها لضمان أن جميع الحيوانات وتزرع بطريقة موحدة، ويحتمل أن تكون من حساب لأي آثار تخذها الأوضاع الإنمائية- تفتقر
- نقل اليرقات L1 إلى لوحات NGM المصنف الجديد بالاستغناء عن قطعة صغيرة من أجار (5 مم × 5 مم) من لوحة المتعطشة باستخدام مشرط معقم ووضعه أسفل على لوحة جديدة، هي عملية يشار إليها ' chunking ' بالاتصالات البحث C. ايليجانس 15 من الوحدة. تنمو الديدان حتى بلوغ مرحلة L4. ثم نقل إلى فرادى لوحات NGM المصنف خمس يرقات L4 كل سلالة وأبقى في 20 درجة مئوية. هذه الحيوانات تمثل الجيل P0.
- ذرية L4 استخدام الجيل P0 لإعداد الجيل F1. مكان فردياً اليرقات F1 L4 من السلالة البرية نوع N2 إلى لوحات NGM المصنف 30-
ملاحظة: لسلالات متحولة، يعتمد عدد اللوحات المطلوبة في معدل نموها. على سبيل المثال، تخضع الحيوانات daf-7(ok3125) اعتقال دوير عابر في 20 درجة مئوية. وبالتالي، تنتج هذه السلالة أقل اليرقات L4 من الديدان لوحة نوع البرية N2. - للتعويض عن هذا الفارق، إعداد لوحات daf-7(ok3125) حتى قبل يوم واحد من N2 اللوحات وهو نسبة عمل جيدة في عدد أكبر، 3:1-
- نقل متزامنة L4-المرحلة ذرية الوالدين F1 إلى لوحات NGM تكملة مع 1 مم إيبتج و 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين (اللوحات [رني]) التي كانت تبذر مع 225 ميليلتر من البكتيريا HT115 الإعراب عن دسرنا استهداف الجين بيضة-5 وأبقى في 20 درجة مئوية ح 24. الديدان على الأقل 360 كل سلالة، أبقى في كثافة الحيوانات 15 كل لوح، هناك حاجة إلى كل تجربة.
- بعد البيض-5 [رني] في المعاملة، نقل الديدان إلى لوحات مجلس الأمن القومي المصنف مع 225 ميليلتر من OP50 معاملة ستربتوميسين بتركيز 2 × 10 9 خلايا/مل (الجدول 1) على 24 ساعة إضافية في 20 درجة مئوية. لتجنب الأضرار المادية التي لحقت الديدان خلال هذا وجميع التحويلات اللاحقة، بلطف حلج القطن الحيوانات من أسفل باستخدام دودة بيك دودة منحنية بلطف رقيقة جداً. تعويم انتقاء الحيوانات قبالة الدودة بتخبط عليه في معالجة تجميعية 10 ميليلتر SB + بكتيريا وضعت على سطح لوحة جديدة-
- في اليوم التالي، توزيع الديدان لمجلس الأمن القومي لوحات تمثل كل من ل المستويات الغذائيةكانيسترارو في الجدول 1، فضلا عن مجموعة من لوحات مجلس الأمن القومي التي تحتوي على لا البكتيريا. بذور جميع لوحات مجلس الأمن القومي مع 225 ميليلتر لتركيز البكتيريا ذات الصلة، والبذور لوحات مجلس الأمن القومي خالية من البكتيريا مع SB ميليلتر 225 + بكتيريا. الحفاظ على الديدان في كثافة الحيوانات 15 كل لوح، نتج عنه على الأقل أربعة ألواح كل حالة الأغذية كل سلالة. تحويل اللوحات على درجة الحرارة المرغوبة التجريبية.
- المصنف نقل الديدان إلى لوحات جديدة في مجلس الأمن القومي مع تركيز المواد الغذائية المناسبة وفقا للجدول الزمني المبين في الجدول 2- انتقاء الحيوانات نقاط
- للحركة بالحث بلطف مع سلك. وسجل عدم الرد هو كالموت. نقاط الحيوانات للموت في كل عملية نقل نقطة ويوميا ثم بعد نقل النقطة الأخيرة-
4. الإعداد حتى تجارب التصوير
ملاحظة: الخطوات المذكورة في هذا القسم كافية لتوليد ما يكفي من الديدان كل سلالة لتصوير حالة الأغذية التجريبية واحد عند درجة حرارة معينة. هذا البروتوكول يمكن أن يتم تحجيم عدد الشروط التي سوف يتم تصويرها في أي يوم من الأيام. ومع ذلك، ينبغي الحرص في تصميم تجريبي لضمان أن الإطار الزمني المعقول وأن الحيوانات عبر سلالات مختلفة ليس لها فارق سن أكبر من 12 ساعة في يوم تصوير. ينصح أن الصحفيين النسخي يجري تصويرها هي نسخة واحدة الوراثي، كما هذا سيشبه أوثق الأصلية تنظيم الجينات. وينص البروتوكول على المبينة أدناه، والملخصة في الجدول 3، أيضا طريقة مبسطة للحصول على السكان كبيرة السن متزامن مطابقة للسلالات، التي يمكن أن تستخدم لمهام سير العمل التجريبي-
- ثقافة الحيوانات في التصوير تجارب على 10 سم تعامل لوحات زراعة الأنسجة للسماح بكثافة أكبر من الديدان (∼ الحيوانات 100 للوحة الواحدة) من فحوصات عمر-
- ملء لوحات 10 سم مع 30 مل NGM أجار لوحات والبذور مع مختبرين 225 5 ميليلتر المبردة OP50 الثقافة في تشكيل مثل الصليب.
5. الأولى "ثقافة سلالات مراسل"
سلالات- الثقافة C. ايليجانس الذي سيتم اختباره في المصنف لوحات NGM في 20 درجة مئوية. السماح لوحات لتجويع بها لضمان أن جميع الحيوانات وتزرع بطريقة موحدة، ويحتمل أن تكون من حساب لأي آثار تخذها الظروف الإنمائية-
- القطعة L1 المتعطشة اليرقات إلى المصنف لوحات NGM وتنمو حتى تصل إلى مرحلة L4. نقل اليرقات L4 ثلاثة كل سلالة لاثنين من لوحات NGM المبذورة في 20 درجة مئوية. هذه الحيوانات تمثل الجيل P0. استخدام
- ذرية L4 الجيل P0 لإعداد الجيل F1. وضع اليرقات F1 L4 من سلالة مراسل نوع البرية إلى 4 لوحات NGM المصنف. لسلالات متحولة، يعتمد عدد اللوحات المطلوبة في معدل نموها. باستخدام مثال السابق من daf-7(ok3125)، تتطلب ثلاث مرات عدد لوحات سلالات مراسل في هذه الخلفية وتحتاج إلى إعداد يومين قبل سلالات مراسل نوع البرية، لمراعاة الاختلافات في معدل نمو.
6. جمع البيض والمزامنة لمراسل سلالات
ملاحظة: بعض الجينات من الاهتمام في أوساط بحوث الشيخوخة C. ايليجانس يؤدي إلى النمو وعيوب وضع البيض عندما تحور، مما يجعل من الصعب أكثر توليد عدد كبير من السكان متزامن من الحيوانات من مختلف الأنماط الوراثية. على سبيل المثال، يسبب طفرة daf-7(ok3125) عيب شديد وضع البيض بالمقارنة مع نوع البرية سلالة N2. ولذلك، للحصول على كافية يتطلب أعدادا من اليرقات L4 متزامن من سلالات مختلفة لتجارب التصوير الكمي منهجية أكثر قوة من التقاط الديدان يدوياً. ولهذا السبب، تعرضت سلالات مراسل النسخي لتحت كلوريت الصوديوم (ناكلو)/هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حل معاملة البالغين جرابيد لكسر فتح الحيوانات وتحرير البيض، هي عملية يشار إليها باسم ' تبيض ' قبل C. ايليجانس بحوث المجتمع 15-
معدلات بين سلالات- حساب الفروق في النمو وحساب عندما ينبغي أن تحصد لوحات لكل سلالة والمبيضة. للحصول على مثال عندما يتم المبيضة نوع البرية و daf-7(ok3125) من سلالات مراسل انظر الجدول 3-
- متسلسل غسل الديدان من سلالة معينة قبالة اللوحات، واليوم المناسب، تستخدم 15 مل من س. ب، وجمع في أنبوب عقيم 15 مل. السماح للحيوانات للرواسب بطبيعة الحال، ثم قم بضبط حجم السائل إلى 7 مل.
- إضافة 2 مل من 5% ناكلو و 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم م 5 إلى الأنبوب الذي يحتوي على الكبار جرابيد. روك بلطف الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن 3 دقيقة. ناكلو سيقتل البكتيريا والديدان، بينما هيدروكسيد الصوديوم يسبب الديدان التفكك من الإفراج عن أي البويضات المخصبة التي تحتويها إلى السائل. كيتين كثافة قشرة حول الأجنة يحميهم من آثار العلاج، ما دام وقت التعرض القصير نسبيا. بعد الحضانة 3-مين، دوامة الأنبوب ~ 30 s لتيسير المزيد من تفكك جيف دودة.
- بعد وتدور حضانة 3-مين أسفل الخليط في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة بيليه البيض. نضح معظم بعيداً من المادة طافية باستخدام ماصة زجاجية معقمة متصلاً قارورة فراغ، تاركاً مل ~0.5 في كل أنبوب، حتى لا يؤدي إلى الإخلال بالبيض-
- ريسوسبيند بيليه مع مل 9.5 من بينالي الشارقة ثم قم بتكرار الخطوة الطرد المركزي واستثارة خطوات إضافية مرتين حيث أن البيض قد تم غسلها مع س. ب ما مجموعة ثلاث مرات- بيليه البيض عن طريق الطرد المركزي
- بعد أن يغسل النهائية، وثم تجاهل كافة ولكن 0.5 مل من المادة طافية. ريسوسبيند البيض في مل 0.5 المتبقية من بينالي الشارقة وميليلتر 100 ثم الكوة إلى ثلاث لوحات NGM 10 سم المصنف. توزيع ميليلتر 100 على قدم المساواة على جميع المروج البكتيرية خمسة في كل لوحة. لسلالات النوع المتوحش، ينبغي أن تودع غير البيض في كثافة أكبر من 200 للوحة الواحدة.
- لوحات تبقى في 20 درجة مئوية ح 48 والحصول على عدد سكان عالية متجانسة من اليرقات L4. لسلالات مع تأخر النمو تعمل، فمن المستحسن لإيداع العديد من البيض المتاحة وزيادة فترة الحضانة. على سبيل المثال، الاحتفاظ daf-7(ok3125)--التي تحتوي على سلالات مراسل في 20 درجة مئوية ح ~ 64 السماح للبيض تفقس وتصل إلى مرحلة L4.
7. العلاج من "سلالات مراسل" مع البيض-5 [رني]
- متسلسل يغسل الديدان قبالة لوحات الثلاثة تستخدم 15 مل من بينالي الشارقة وجمع السائل في أنبوب عقيم 15 مل. تسمح اليرقات L4 للرواسب بطبيعة الحال، وثم نضح جميع ولكن ~0.5 مل من السائل. في typ البريةسلالات مراسل ه، هذه الخطوة يزيل أي يرقات أصغر سنا من L4. في الخلفيات متحولة، الإيدز هذه الخطوة إزالة أي يرقات المقبوض عليهم مثل دورس في حالة daf-7(ok3125)-
- ريسوسبيند الديدان مع 9 مل من س. ب. مرة أخرى، رصد معدل الترسيب اليرقات L4 وثم نضح لكن مل ~0.5 من المادة طافية كل مرة واحدة قد القريبون معظم اليرقات L4. كرر هذه العملية مرة أخرى. ثم نضح جميع ولكن ~0.5 مل من السائل حالما استقر معظم اليرقات L4.
- إضافة 10 ميليلتر ق العقيمة القاعدية وتستكمل مع 0.1% F-127 بلورونيك (SB + Plu) للسائل الذي يحتوي على اليرقات L4. هذا بمثابة خافض للتوتر السطحي ويمنع اليرقات من الالتصاق على سطح الداخلية من نصائح ماصة بلاستيكية.
- ريسوسبيند بلطف اليرقات باستخدام تلميح ماصة احتفاظ بانخفاض P200 ميليلتر 150 ثم الكوة على ثلاث لوحات [رني] 10 سم التي هي المصنف مع 5 × 225 ميليلتر من البيض-5 [رني] البكتيريا. التأكد من أن الديدان هي موزعة بالتساوي عبر جميع المروج البكتيرية خمسة.
- مرة واحدة قد استوعب السائل أجار، وإزالة اليرقات غير L4 أي من اللوحات التي ألغيت لا بإجراء الغسيل بانتقاء منهم يدوياً. ثم تخزين اللوحات في 20 درجة مئوية ل 24 h.
8. بدء الدكتور واسع النطاق
ملاحظة: بعد 24 ساعة بيضة-5 [رني] العلاج، سيصبح اليرقات L4 التي ترسبت أصلاً على اللوحات الكبار 1-يوم القديمة.
- سلخ أي يرقات الشباب الذي نجا في الخطوة السابقة الإزالة اليدوية قبالة في هذه المرحلة، ترك الكبار 1-يوم القديمة فقط على اللوحات-
- لكل سلالة، يغسل البالغين 1 يوم من العمر من ثلاث لوحات مع 15 مل العقيمة SB + بكتيريا في أنبوب 15 مل. السماح للديدان للرواسب بطبيعة الحال، وثم نضح لكن كل 0.5 مل من المادة طافية. ريسوسبيند الديدان مع مل 9.5 SB + بكتيريا وكرر الخطوات الترسبات والمياه والصرف الصحي-
- بعد أن يغسل النهائي، السماح للديدان للرواسب وثم نضح لكن كل 0.5 مل من المادة طافية. إضافة 10 ميليلتر SB + Plu وريسوسبيند بلطف اليرقات باستخدام تلميح ماصة P200 والكوة ثم ميليلتر 100 على لوح مجلس الأمن القومي المصنف مع البكتيريا ميليلتر 5 × 225 في تركيز 2 × 10 9 خلايا/مل.
- توزيع 100 ميليلتر بالتساوي عبر جميع المروج البكتيرية الخمسة. تحت مجهر تقدير عدد الحيوانات الموجودة على اللوحة: ويهدف إلى ما بين 100-150 الديدان على اللوحة-
- تحديد حجم السائل المطلوب لتحقيق كثافة دودة داخل هذا النطاق ثم قاسمة على لوحات إضافية اثنين. ضبط عدد الديدان على اللوحة الأولى تندرج أيضا في هذا النطاق ومن ثم تخزين اللوحات في 20 درجة مئوية ل 24 h.
- في اليوم التالي، جمع الكبار يوم 2 القديمة وتوزيعها على لوحات مجلس الأمن القومي الجديد المصنف مع تركيز التجريبية المطلوبة من المواد الغذائية (الجدول 1)، إعادة استخدام الأساليب الموضحة في الخطوات 2 و 3. مرة واحدة يتم امتصاص السائل إلى أجار، تحول اللوحات على درجة الحرارة المرغوبة التجريبية ل 24 h.
- في اليوم التالي، جمع الكبار اليوم 3 القديمة وتوزيعها على لوحات مجلس الأمن القومي الطازجة المصنف مع تركيز التجريبية نفسها من الغذاء، وإعادة استخدام الأساليب الموضحة في الخطوات 8.3 و 8.4. حالما يتم امتصاصه السائل إلى أجار، العودة اللوحات إلى درجة حرارة التجريبية ل 48 h. جمع البالغين من العمر يوم 5
- وتوزيعها على لوحات مجلس الأمن القومي الطازجة المصنف مع تركيز التجريبية نفسها من الغذاء، وإعادة استخدام الأساليب الموضحة في الخطوات 8.3 و 8.4. حالما يتم امتصاصه السائل إلى أجار، العودة اللوحات إلى درجة حرارة التجريبية ل 24 h.
9. موائع جزيئية التصوير مراسل من سلالات
- يوم 6 سن الرشد، صورة الحيوانات يستعمل منصة مخصصة موائع جزيئية 24 ، 25. سلخ الحيوانات من ثلاث لوحات جسديا وتعلق في أنبوب مبردة 5 مل تحتوي على 4.5 مل SB + بكتيريا.
- مرة الديدان الرواسب، نضح لكن كل مل ~0.5 من المادة طافية وريسوسبيند الحيوانات في 4 مل من س. ب + بكتيريا. يزيل هذا يغسل البكتيريا الزائدة وإلا تتعارض مع التصوير. يتم إدخال الديدان في جهاز موائع جزيئية مخصصة عن طريق الضغط مدفوعة تدفق 24 ، 25. داخل الجهاز، وهي موجهة إلى الديدان الفردية ومحاصرين داخل قناة تصوير بوابات التي يحركها ضغط الصمامات على شريحة 26 تحت سيطرة البرامج المخصصة.
- بمجرد دودة المحاصرين رءوسهم صبا في القناة التصوير، جمع فلورسنت z-مكدس، مع الأقسام 50 في 2 ميكرومتر الخطوات، استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي قياسية مع 40 × النفط الهدف (1.3 غ) وكاميرا. جمع الصور الفلورسنت الأحمر والأخضر لكل من الصحفيين النسخي الخائن انبعاثات استخدام وتخزين للتحليل في الوقت نفسه. الحصول على الصور آليا باستخدام برامج مخصصة.
- عملية الصورة تلقائياً باستخدام مخصص MATLAB البرامج النصية 27 (متوفرة في https://github.com/meizhan/SVMelegans). Z-رزمة يتم تحميلها في MATLAB وتحليلها لتحديد الخلايا العصبية-أزواج ومواقعها داخل الطائرة التصوير. ثم تحسب الإسقاطات الحد الأقصى، ويستخدم خوارزمية عتبة لتحديد موقع الخلايا الفردية الفلورسنت. تحديد الخلية ثم حسبت على أساس المسافات النسبية والمواقع داخل الدودة ' الرأس s- استخراج
- للتحديد الكمي لمراسل الأسفار، حجم ثلاثي الأبعاد حول كل موقع الخلوية من z-المكدس. دمج الكثافة على مدى عدد ثابتاً من بكسل ألمع، التي تغلف الخلية بأكملها في جميع الحالات تماما.
- للقضاء على التدخل من التغييرات الخاصة بشرط أو سلالة معينة التجريبية في القناة الهضمية السيارات الأسفار كل حيوان، حساب كثافة الخلفية لأزواج الخلية أقرب القناة الهضمية (ADF وعاصي) عن طريق تقدير الوضع توزيع كثافة في وحدة تخزين حولها العصبية. طرح هذه القيمة كثافة الخلفية من الأسفار المتكاملة للحصول على الناتج النهائي-
10. تجميع بيانات
ملاحظة: يتم دمج كثافات fluorescence جميع الخلايا العصبية تحليلها بواسطة برامج معالجة الصور في ملف البيانات المصفاة التعبير (بنك الاحتياطي الفيدرالي) الذي يستخدم لتقدير توزيع التشكيلات الجانبية للجينات التعبير (قالب R و c + + البرامج النصية متاحة في https://github.com/giovannidiana/templates)-
- صورة الاختيار كل معالجتها يدوياً للتأكد من الهوية الصحيحة لكافة الخلايا. ويجب تسجيل الصور مع تحديد الخلية الخاطئة في ملف استبعاد. في ديانا وآخرون (2017) 13 يتكون الملف الاستبعاد من جدول ثنائي مع ' 0 ' لتصحيح و ' 1 ' لتحديد الخلية غير صحيح. عدد الصفوف في الجدول مساو للعدد الديدان تصويرها مع عمود لكل خلية تصويرها (أي وكالة الفضاء الإيطالية، والقوات الديمقراطية المتحالفة و NSM)-
- إنشاء الملف الاحتياطي الفيدرالي:
- باش تشغيل البرنامج النصي " gen_data + الوقت " لإنشاء ملفات خاصة بخلية الجمع بين قيم التعبير التي تم الحصول عليها من كل دودة تصويرها تصفية باستخدام الملف الاستبعاد. لكل مجلد إنشاؤها بواسطة برامج معالجة الصور، البرنامج النصي باش يقرأ ملف التعليق التوضيحي < فولديربريفيكس > _EXP.txt لاستخراج الشروط التجريبية واستبعاد ملف < فولديربريفيكس > _X.csv لتحديد فقط بشكل صحيح تحديد الخلايا العصبية. تتم قراءة قيم التعبير من الملفات < فولديربريفيكس > _data_ < العصبية >.csv.
- سلسلة كافة الملفات في " FED_split.dat " وفرزها حسب المدونة الدفعة التجربة، دودة الهوية تسمية وخلية.
- تشغيل " فرز " (برنامج c + +، والاستخدام:./فرز FED_split.dat FED_merged.dat) تحديد إدخالات مع الأسفار غير الصفر لكل خلية والجمع بينهما في واحد من الصفوف في FED_merged.dat-
11. تقدير "ترميز المعلومات"
ملاحظة: يصف الإجراء التالي كيفية تحديد مقدار المعلومات حول ظروف بيئية محددة مرمزة بواسطة مجموعة التعبيرات الجينات. في ديانا et al. (2017) تم فحص 13، المعلومات المرمزة عن وفرة الغذاء في البيئة، غير أن الأسلوب نفسه ينطبق على أي عدد منفصلة من الدول البيئية. المكون الأساسي لقياس متغيرات نظرية المعلومات مثل معلومات انتروبيس أو التكرار هو توزيع الاحتمال المشترك للاستجابات العصبية تحت مجموعة المحفزات البيئية تعتبر. للقيام بمثل هذه التقديرات، من الأهمية بمكان أن يكون كافياً لأخذ عينات من الاستجابة عبر سكان ديدان. ويمكن تقدير توزيع غاوسي من عينات صغيرة نسبيا؛ ومع ذلك، من المهم الحصول على فكرة عن الشكل المتوقع لتوزيع تعبير لقياس حجم العينة المناسبة لإجراء تقدير موثوق بها كثافة. نظراً لأن التغير لا يمكن تجنبه عبر تجارب مختلفة، فمن الضروري للتحقق من عدم تحول القيم المركزية لعمليات التوزيع التي تم الحصول عليها من مختلف يكرر نفس التجربة بشكل منهجي أو أي من ميزات الإحصائية لم يتم تغيير توزيع التعبير كثيرا عبر التجارب. في حالة تقلب المحاكمة إلى محاكمة متوافق مع التباين داخل كل محاكمة، من الأهمية بمكان تحقيق التوازن في العدد المحاكمات مقابل عدد الديدان داخل المحاكمات في المتوسط إلى تلك العوامل البيئية والبيولوجية التي تؤثر على المحاكمة للمحاكمة تقلب. أونديرسامبلينج تلك العوامل يمكن أن التحيز بشكل كبير تحليل المعلومات النظرية.
- البرنامج النصي ك R " code3D.R " ينص على توليد الكثافات ثلاثية الأبعاد استناداً إلى الملف قالب " FED_merged.dat "، تعديل هذا القالب وفقا لتنسيق رأس بنك الاحتياطي الفيدرالي محددة. القائمة " هيديرناميس " يمثل أسماء كل حقل في ملف بنك الاحتياطي الفيدرالي بينما " روناميس " قائمة من قراءات. يستخدم البرنامج النصي الحزمة R ' ks ' 28 ، 29 لتقدير توزيعات المتغيرات داخل شبكة هايبركوبيك مع ع صناديق في كل بعد من أبعاد تقسيم النطاق بين الحد الأدنى والحد الأقصى القيم في مجموعة البيانات لكل قراءات. عندما المتغير الداخلي " الفريق " يتم تعيين إلى 0، يتم استخدام كافة البيانات لتقدير كثافة. عندما " الفريق " تسمية ما بين 1 إلى 5 dataset ينقسم إلى 5 مجموعات منفصلة، وتقدر كثافة التعبير من 80 في المائة البيانات الناتجة عن استبعاد واحدة من خمس مجموعات. يتم استخدام هذه الميزة في وقت لاحق لتقدير أوجه عدم التيقن.
ملاحظة: استخدام code3D.R: code3D.R رسكريبت < جي تي > < الغذاء > < ع > < أووتفولدير > < تسمية > < الفريق > < فارك > حيث GT يمثل النمط الوراثي، الغذاء الظروف البيئية، وهو أووتفولدير الموجودة مسبقاً المجلد حيث سيتم تخزين عمليات التوزيع والتسمية بادئة اسم ملف وفارك هي الجزء من مجموعة البيانات المستخدمة. - لكل الظروف البيئية تولد توزيعات المتغيرات مع شبكة مختلفة الأحجام (مثلاً 20,30,40 سلال) من فئة الخدمات العامة. لتقليل تحميل الحسابية، القيم الأصغر من فئة الخدمات العامة الأفضل عند القرارات الدقيقة لا تتغير كثيرا تقدير المعلومات. تتم كتابة التعبير الجيني التوزيع في المجلد < أووتفولدير > المحدد عند تشغيل code3D.R واحد ملفات نصية في عمود مع هيكل اسم الملف < تسمية > _ < GT > _ < الغذاء > _GS < ع > _group < مجموعة >. دات.
ملاحظة: الخطوات السابقة تقديم تقدير للتوزيعات الاحتمالية المشروطة
حيث يدل ز ناقل read-outs جميع وهو و الظروف البيئية. ومع ذلك، حساب المعلومات المتبادلة بين الجينات و البيئة 30 ، 31-
نحن بحاجة إلى توزيع المدخلات
الذي يحدد أيضا (الإدخال-) بلغ التعبير الجيني < img alt = "المعادلة 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg"/>. عندما لا يتوفر مباشرة توزيع المدخلات، كمية مجدية لتوصيف سمات الترميز هو قدرة القناة، التي يمكن الحصول عليها من تحقيق أقصى قدر من المعلومات المتبادلة عبر جميع التوزيعات المدخلات الممكنة. - باستخدام توزيع التعبير الجيني، تطبيق الخوارزمية 32 اريموتو-بلات لتقدير قدرة قناة النظام وتوزيع المدخلات البيئية التي تزيد من المعلومات. يمكن العثور على مثال لتنفيذ الخوارزمية في برنامج c + + " Ccap3D.cpp " للتعبير الجيني ثلاثي الأبعاد-تحليل التعليمات البرمجية في ديانا وآخرون (2017) 13. على سبيل المثال: إذا كان يتم الحصول على توزيعات من النمط الوراثي GT123 من 80% البيانات (المجموعة 3) مع حجم الشبكة يساوي 30 وتخزينها في المجلد "./pdf/" باستخدام تسمية بادئة = " PDF ". الأمر على حساب المعلومات المشفرة في الخلفية GT123./Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
ملاحظة: يتأثر تقدير المعلومات المشفرة بواسطة النظام من مصادر متعددة من عدم اليقين، بما في ذلك اختيار تقدير الكثافة الخوارزمية وعينه حجم التحيز. يجب تكرار الخطوات 11.1 11.2 استخدام أساليب تقدير كثافة مختلفة لتقييم حجم التحيز المنهجي عرضته كل خوارزمية. - لتقدير حالة عدم اليقين بسبب حجم العينة، وإعادة حساب معلومات من الخطوات 11.1 11.2 مع المجموعات بين 1 إلى 5. أن التغير عبر هذه العينات المستقلة الخمس 80 في المائة من البيانات سوف تعكس أثر حجم العينة في تقدير المعلومات.
- حساب المعلومات باستخدام الخطوات 11.2 11.1 عبر زيادة جزء البيانات (كما في الخطوة 5) لتصحيح التحيز حجم العينة (الطريقة جاككنيفي) 33-
حيث يدل ز ناقل read-outs جميع وهو و الظروف البيئية. ومع ذلك، حساب المعلومات المتبادلة بين الجينات و البيئة 30 ، 31-
الذي يحدد أيضا (الإدخال-) بلغ التعبير الجيني < img alt = "المعادلة 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg"/>. عندما لا يتوفر مباشرة توزيع المدخلات، كمية مجدية لتوصيف سمات الترميز هو قدرة القناة، التي يمكن الحصول عليها من تحقيق أقصى قدر من المعلومات المتبادلة عبر جميع التوزيعات المدخلات الممكنة.12. حساب التكرار والضوضاء والارتباط إشارة
توزيعات- الاستخدام الأمثل الإدخال التي تم الحصول عليها من التقدير للمعلومات القصوى حساب المعلومات المتبادلة
بين المدخلات والجينات استجابة التعبير لكل الخلايا العصبية N. الملف المصدر c + + " GetMI1D.c " برنامج عينة للحصول على المعلومات المتبادلة هامشية من توزيعات الاحتمال المشتركة. - حساب التكرار بأخذ مجموع المعلومات المتبادلة لكل الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها أعلاه وثم طرح قدرة القناة.
- حساب " المراوغة " مصطلح المعلومات
13 ، 34. يمكن العثور على ملف مصدر قالب c + + في " GetShuffle.c ". - استخدام " المراوغة " الأجل لحساب ارتباط الإشارات والضوضاء. signaالارتباط ل لدينا
والترابط الضوضاء ولدينا 
. - الشكوك في التكرار، الحصول على الضوضاء وإشارة الارتباط أما بالنسبة لمجموع المعلومات (الخطوة 11.3 من المقطع السابق) من عينات متعددة من 80% من البيانات وأخذ الانحراف المعياري.
بين المدخلات والجينات استجابة التعبير لكل الخلايا العصبية N. الملف المصدر c + + " GetMI1D.c " برنامج عينة للحصول على المعلومات المتبادلة هامشية من توزيعات الاحتمال المشتركة.
13 ، 34. يمكن العثور على ملف مصدر قالب c + + في " GetShuffle.c ".
والترابط الضوضاء ولدينا 
.Representative Results
قبل إجراء تجارب عمر على طفرات الجينات الاهتمام جنبا إلى جنب مع نوع البرية سلالة N2، واحدة يمكن إنشاء ما إذا كانت هذه الجينات لها دور في الاستجابة الغذائية للدكتور واسع النطاق. ينبغي أن تكون استجابة نوع البرية مماثلة لتلك المبينة في الشكل 1ألف. أي تعديل من هذا الرد من طفرات، يتجلى تأثير غير موحدة عبر الظروف الغذائية، يشير إلى أن هذه الجينات تؤثر في قدرة الدودة بشكل صحيح في الاستجابة للتغيرات في وفرة الأغذية، في أي نقطة مزيدا من التحقيق التعبير ردود هذه الجينات على نطاق واسع الدكتور له ما يبرره. إذا، بيد أن رد طول العمر طفرات لا تختلف اختلافاً كبيرا من نوع البرية ثم الجينات لا دور في ترانسدوسينج آثار الدكتور واسع النطاق، على الأقل على مستوى متوسط عمر. إذا تسبب الطفرات تحولاً موحدة لاستجابة العمر كله ثم الجينات تأثيراً مستقلاً عن الغذاء على طول العمر. وهذا لا يستبعد إمكانية التعبير عن الجينات للاهتمام الغذاء تستجيب، في هذه الحالة المعلومات التي تحملها هذه الجينات لا ينتقل إلى عمر.
المرحلة التالية من البروتوكول تحديد كيفية تغيير مستويات التعبير تحت الدكتور واسع النطاق للجينات للفائدة. في الشكل 1ب، يمكننا توضيح هذا من خلال مستويات التعبير مراسل النسخي daf-7، الذي يبين استجابة للتغيرات في مستوى الغذاء في الخلايا العصبية الحسية عاصي. في متحولة daf-7(-) ، يتم تبديل رد التعبير المراسل النسخي. إذا كانت جينات الفائدة الغذائية-تستجيب حقاً على مستوى عمر ثم واحدة يمكن أن نتوقع أن التعبير عنها سيغير أيضا مع الغذاء. وفي المقابل، ينبغي أن يكون مراسل النسخي في الخلفية متحولة ملف تعريف تعبير غيرت ردا على الدكتور واسع النطاق. ومع ذلك، من الممكن أيضا أن المراسل النسخي الجينات من الفائدة في خلفية نوع البرية لا تظهر أية تغييرات تستجيب للغذاء في التعبير. في هذه الحالة، قد يشير هذا إلى تأثير بوستترانسكريبشونال تنظيمية التي تقع خارج نطاق هذا البروتوكول.
في ديانا وآخرون (2017)13، نحن استخراج قيم التعبير daf-7 في وكالة الفضاء الإيطالية و الهيدروكربونات النفطية-1 في ADF و NSM. في الشكل 2أ، نحن توضيح تقدير توزيع التعبير في وكالة الفضاء الإيطالية والقوات الديمقراطية المتحالفة لمستوى معين من غذاء. وبعد قراءات متعددة من الصور دودة واحدة يسمح لنا بتحليل ليس فقط كمية المعلومات المشفرة بشكل مستقل بواسطة كل الخلايا العصبية ولكن أيضا المعلومات اندماجي للدائرة العصبية كله (الشكل 2ب-2 ج). الجمع بين هذين التدبيرين معلومات نظري يسمح لنا بتميز النظام من حيث الاستراتيجية الترميز التي تستخدمها الخلايا العصبية لنقل معلومات حول الغذاء. يمكن الحصول على مبلغ التكرار في الدائرة بأخذ مجموع المعلومات المتبادلة لكل الخلايا العصبية وطرح المعلومات المتبادلة المشتركة (قناة القدرات) التي تم الحصول عليها من خلال النظر في قراءات اندماجي للدائرة. قيمة إيجابية لمثل هذا الفارق يدل حرف زائدة عن الحاجة لاستراتيجية الترميز للمعلومات المتراكمة بين الأجزاء أكبر من المعلومات الفعلية مرمزة بواسطة الدائرة كلها. وفي المقابل قيمة سالبة يعكس استراتيجية تعاونية لترميز المعلومات الحقيقية أكبر من مجموع مكوناتها (الشكل 2ب). ويمكن مقارنة المعلومات والتكرار عبر مختلف الأنماط الجينية لاستكشاف الدور المحتمل لكل ترتيب أعلى لتنظيم الجينات، على سبيل المثال في ديانا et al. (2017) 13 أثر الطفرة daf-7 مفاتيح استراتيجية الترميز من زائدة عن الحاجة إلى التآزر (الشكل 2ج-2D).
الشكل 1 : رد عمر والجينات التعبير ضمن نطاق واسع د. (A) يعني عمر من النوع المتوحش N2 السلالة (الخط الأسود) يعرض استجابة معقدة للدكتور واسع النطاق. هو تخفيف حجم هذه الاستجابة في متحولة خالية من هذه الجينة داف-7 (الخط الأحمر). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط، البيانات المجمعة من انتشيف et al. (2015) 12-(ب) يعني تعبير مستويات مراسل النسخي للجينات daf-7 في الخلفية نوع البرية (الخط الأسود) أيضا عرض استجابة غير رتيبة معقدة للدكتور واسع النطاق. في الخلفية الوراثية daf-7(-) التعبير عن هذا المراسل النسخي هو تخفيف شدة ويظهر قليلاً واستجابة للتغيرات في مستوى الغذاء. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط، بيانات من محاكمة واحدة في انتشيف et al. (2015) 12- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : المنهجية الحسابية. (أ) رسم توضيحي لتقدير كثافة ثنائي الأبعاد الهيدروكربونات النفطية-1 التعبير في التعبير ADF و daf-7 في العاصي كما تم الحصول عليها من مجموعة 'كانساس' R استخدام شبكة بعد 30 × 30. التصور (ب) المعلومات المشفرة بواسطة التعبير المشترك عن الهيدروكربونات النفطية-1 و daf-7 (الجامعة) وفردي (مجموع الأجزاء) للقوات الديمقراطية المتحالفة وعاصي NSM الخلايا العصبية. ويمثل الفرق بين ارتفاع أشرطة مكدسة على اليمين والمعلومات المشفرة بواسطة الدائرة الكاملة أحرف زائدة عن الحاجة والمتآزر للترميز. (ج) المقارنة بين المعلومات الغذائية مرمزة بواسطة الحيوانات البرية نوع وطفرات daf-7(-) . (د) الحد من تبادل المعلومات ولاحظ في طفرات يرافق التحول نحو ترميز تآزرية. ألواح د ب مقتبسة من ديانا et al. (2017) 13- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| تركيز البكتيرية (خلايا/مل) | الكثافة البصرية (600nm) | عامل إضعاف (من السابق) |
| 1.12E + 10 | 56.000 | 0.00 |
| 2.00E + 09 | 10.000 | 5.60 |
| 6.32E + 08 | 3.160 | 3.16 |
| 6.32E + 07 | 0.316 | 10.00 |
| 2.00E + 07 | 0.100 | 3.16 |
| 0 (S القاعدية) | 0.000 | نا |
الجدول 1: المستويات الغذائية وتخفيف العوامل المستخدمة في نطاق واسع د. البكتيرياl تركيزات (خلايا/مل) المستخدمة في البروتوكول الدكتور واسع النطاق، جنبا إلى جنب مع القياسات600 OD كل منهما وعامل التخفيف المطلوب لتحقيق كل تركيز من سابقتها.
| درجة حرارة التجريبية من عمر | |||||||
| اليوم | 12.5 درجة مئوية | 15 درجة مئوية | 17.5 درجة مئوية | 20 درجة مئوية | 22.5 درجة مئوية | 25 درجة مئوية | 27.5 درجة مئوية |
| -12 | القطعة جميع سلالات إلى لوحات NGM جديدة والحفاظ على الأقل 20 درجة مئوية | ||||||
| -11 | |||||||
| -10 | إعداد جيل P0 سلالات daf-7(-) وصيانتها عند 20 درجة مئوية (1 L4 للوحة الواحدة، لوحات 5) | ||||||
| -9 | إعداد جيل P0 السلالات البرية نوع وصيانتها في 20 درجة مئوية (1 L4 للوحة الواحدة، لوحات 5) | ||||||
| -8 | |||||||
| -7 | |||||||
| -6 | |||||||
| -5 | إعداد الجيل F1 من سلالات daf-7(-) وصيانتها في 20 درجة مئوية (1 L4 للوحة الواحدة، لوحات 90) | ||||||
| -4 | إعداد الجيل F1 من سلالات النوع المتوحش وصيانتها عند 20 درجة مئوية (1 L4 للوحة الواحدة، لوحات 30) | ||||||
| -3 | |||||||
| -2 | |||||||
| -1 | |||||||
| 0 | اختيار اليرقات F2 L4 إلى > بيضة-5 [رني] لوحات والحفاظ على الأقل 20 درجة مئوية (15 L4 كل لوح، لوحات 24) | ||||||
| 1 | نقل البالغين 1-القديمة اليوم إلى مجلس الأمن القومي لوحات المصنف مع 2.0E + 9 المستوى الغذائي في خلايا/مل والحفاظ على الأقل 20 درجة مئوية | ||||||
| 2 | نقل الكبار 2-يوم قديمة لوحات مجلس الأمن القومي المصنف مع ظروف تجريبية الغذاء ودرجة الحرارة التجريبية | ||||||
| 3 | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل |
| 4 | |||||||
| 5 | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل |
| 6 | |||||||
| 7 | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل |
| 8 | |||||||
| 9 | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل |
| 10 | |||||||
| 11 | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل | نقل | |
| 12 | |||||||
| 13 | |||||||
| 14 | نقل | نقل | نقل | نقل | |||
| 15 | |||||||
| 16 | |||||||
| 17 | |||||||
| 18 | نقل | نقل | |||||
| 19 | |||||||
| 20 | |||||||
| 21 | |||||||
| 22 | نقل | ||||||
الجدول 2: الجدول الزمني لإعمار أجريت في درجات حرارة مختلفة- ملخص تخطيطي للخطوات اللازمة لإعداد واسعة النطاق الدكتور عمر التجارب في درجات حرارة مختلفة باستخدام سلالات daf-7(-) ونوع البرية كأمثلة. إنقاص عدد التحويلات إلى لوحات جديدة لكل مستوى الأغذية التجريبية مع ارتفاع درجة الحرارة. وهذا الاعتبار لحقيقة أن الحيوانات في درجات حرارة أعلى، هي الشيخوخة أكثر سرعة وحتى أكثر عرضه للضرر المادي لنقل.
| أيام | معهد العالم العربي |
3 الجدول: الجدول الزمني لتصوير أنابيب. ملخص تخطيطي للخطوات اللازمة لإعداد الدكتور واسع النطاق التصوير تجارب باستخدام سلالات مراسل النسخي الفلورسنت في الخلفيات daf-7(-) ونوع البرية في درجات حرارة مختلفة كأمثلة.
Discussion
وهنا نقدم طريقة جديدة لتقييد الغذائية التي تقوم بتغليف مجموعة أوسع بكثير من التركيزات الغذائية من البروتوكولات المنشورة سابقا. هذا الأسلوب يربط بين هاتين الظاهرتين منفصلة سابقا ينظر في الأدب الدكتور C. ايليجانس ، الحرمان البكتيرية وتقييد الغذائية الكلاسيكية، السماح لكل التأثيرات الغذائية أن تكون دراسة البروتوكول إطار واحد. باستخدام النموذج الجديد للدكتور واسع النطاق، نقدم إطارا عاماً لدراسة التعبير الجيني خلية مفردة ردا على أحد الرموز بيئية محددة، وتحديد مدى هذه الخلية بترميز المعلومات. لدينا إطار يتكون من بروتوكولين التجريبية التي توضح كيفية القيام بإعمار والتصوير الكمي، على التوالي، ضمن نطاق واسع يمكن ثم فحص بيانات الدكتور من هذه البروتوكولات التجريبية مع التحليلات الحسابية المنصوص عليها في وهذا الإطار تحديد مقدار المعلومات المشفرة بواسطة التغيرات في مستويات التعبير الجيني أو إعمار عبر الظروف الغذائية المختلفة.
عمر تجارب باستخدام نموذج الدكتور واسعة النطاق تشمل ستة مستويات متميزة الأغذية (الجدول 1). وهذا يقتضي اتباع نهج كثيفة العمالة أكثر من فحص طول العمر تحت مستويات غذائية أقل، مثل الحرمان الغذائي10،11 أو استخدام الخلفية الوراثية أكل 2 35. ومع ذلك، دراسة في عمر تحت شرط واحد يمكن الحد من تفسيرات لدور أحد الجينات في الدكتور. على سبيل المثال، نحن مؤخرا أظهرت أن طفرات daf-7 توهين ثنائي الاتجاه للاستجابة للتركيز الغذائي بالمقارنة مع الحيوانات البرية نوع12 (الشكل 1A). نظراً لغياب الغذاء، عرض طفرات daf-7 تقصير عمرها مقارنة بالحيوانات البرية نوع. إذا كان نظرنا فقط الحرمان الغذائي، علينا أن فسرت أن الجين داف-7 أنها ضرورية لتمديد عمر فقط، عند في الواقع دور daf-7 أكثر تعقيداً. ولذلك، نتائج حاسمة لهذا الجزء من البروتوكول لتحديد ما إذا كان الجين لمصلحة المتورطين في تحوير الاستجابة الشاملة لعمر للتغيرات في وفرة الغذاء.
ميزة واحدة كبرى لهذا البروتوكول مقارنة بالأساليب الأخرى أنه يستخدم طريقة جديدة للقضاء على إنتاج ذرية في الحيوانات تمر بتحليل عمر. معظم الدراسات استخدام المخدرات فودر لتمنع انتشار germline في الكبار مما يجعلها عقيمة. ومع ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة يمكن أن يكون العلاج فودر الآثار المحددة للشرط والجينات في عمر17،،من1819،،من2021، التشكيك في السؤال عن التطبيق العام. في هذا البروتوكول، والقضاء على إنتاج ذرية يتحقق من خلال 24 ساعة معاملة الحيوانات مع [رني] استهداف الجين بيضة-5 ، الذي يحول دون تشكيل قشر البيض كيتين لاخصاب بويضات C. ايليجانس مما أدى إلى انتهاء وفاة22،23. وميزة هذا الأسلوب هو أنها جداً الراحل بالنيابة وحتى لا تتداخل مع الخط، ومنظم رئيسي لطول العمر في C. ايليجانس.
أحد المحاذير المحتملة من البروتوكول الدكتور واسع النطاق هو الاعتماد على الاستخدام المضادات الحيوية للتحكم في انتشار البكتيريا لضمان مراقبة مشددة لتركيز البكتيريا. انتشار البكتيريا داخل القناة الهضمية للدودة المعروف أن يكون سببا رئيسيا للوفاة في C. ايليجانس16. وهكذا، استخدام المضادات الحيوية والاريثروسين، مثل كاربينيسيلين، في أجار NGM يمنع انتشار البكتيريا ويزيد عمر الديدان مقابل16من عناصر التحكم غير المضادات الحيوية. أنواع معينة من المضادات الحيوية، مثل الريفامبيسين36 وأعضاء الأسرة37،التتراسيكلين38، قد ثبت أن تمديد عمر في C. ايليجانس مستقل عن تأثيرها على البكتيريا الانتشار. ومع ذلك، لا يوجد دليل في الأدب أن كاربينيسيلين أو ستربتوميسين يمكن زيادة طول العمر في معزل عن أثرها على انتشار البكتيريا.
عمر يمكن اعتبار الناتج من عملية حسابية معقدة حيث تحال المعلومات البيئية، بالتعبير الجيني في الشبكات العصبية، وتوجيه إلى علم وظائف الأعضاء. يوفر بروتوكول لدينا منهجية لفهم جينات محددة كيف يؤثر هذا التدفق للمعلومات البيئية. ولمعالجة هذه المسألة، نحن بحاجة إلى معالجة لتحديد توزيع الردود التعبير الجيني على مستوى الخلايا المفردة الصور يمكن الاعتماد عليها. التمكن من تقدير متوسط استجابة التعبير الجيني للتغيرات في وفرة الغذاء بل أيضا توزيع إحصائية كاملة عن عدد كبير من السكان يمثل شرط هام للتطبيق أسلوب لدينا. هذا وصف دقيق للردود التعبير الجيني لوفرة الغذاء يسمح تطبيق نظرية المعلومات لتحديد مقدار المعلومات المشفرة بواسطة الخلايا العصبية المحددة، فضلا عن الاستراتيجية الترميز التي تستخدمها الدائرة العصبية.
جوانب التصوير والحسابية للأساليب المذكورة في هذا البروتوكول تنطبق على مجموعة أكبر من سياقات البيولوجية. في عملنا، وركزنا على شبكة العصبية صغيرة المعنية بالأغذية الاستشعار، ولكن تحليلات ميزات معالجة المعلومات لا تقتصر على نوع خلية محددة أو منبهات بيئية محددة. في المستقبل، يمكن تمديد هذه المنهجيات المحتملة إلى مجموعة أكبر من متغيرات المدخلات، التي تؤثر على أي إخراج الفسيولوجية. وسوف تسهم في فهم أفضل لكيفية ترميز الجينات شبكات تنظيمية، وعملية هذه النهج ونقل المعلومات.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر برجمان وهورفيتز المختبرات للمواد الكاشفة. وقدمت بعض سلالات كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). ونشكر أيضا م. ليبوفسيك للتعليقات على المخطوطة. وأيده هذا البحث ويلكوم ترست (المشروع منحة 087146 إلى مستشار)، بسرك (BB/H020500/1 و 1/BB/M00757X إلى مستشار)، مجلس البحوث الأوروبي (242666 نيراج إلى مستشار الملكة)، لنا المعاهد الوطنية للصحة (R01AG035317 و R01GM088333 إلى H.L.)، والولايات المتحدة مؤسسة العلوم الوطنية (0954578 إلى H.L.، جرفب 0946809 بوقار).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
| Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
| di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
| Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
| Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
| LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
| Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
| CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
| Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
| Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
| Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |
References
- Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. The sensory system: More than just a window to the external world. Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159 (2015).
- Calhoun, A. J., et al. Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans. Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).
- Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
- Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376 (2017).
- Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701 (2011).
- Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
- Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS ONE. 4 (2), 4535 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media. Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152 (2009).
- Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. -Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).
- Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
- Lee, G. D., et al. Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).
- Entchev, E. V., et al. A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan. elife. 4, 06259 (2015).
- Diana, G., et al. Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit. elife. 6, (2017).
- Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans). Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
- van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).
- Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition. Cell. 139 (3), 560-572 (2009).
- Parry, J. M., et al. EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans. Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Crane, M. M., et al. Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis. Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhan, M., et al. Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans. PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194 (2015).
- Duong, T. Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R. Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21 (2007).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).
- Cover, T. M., Thomas, J. A. Elements of information theory. , Wiley. (2006).
- Tkacik, G., Walczak, A. M. Information transmission in genetic regulatory networks: a review. J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102 (2011).
- Arimoto, S. An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels. IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).
- Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks. Science. 334 (6054), 354-358 (2011).
- Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. Synergy, redundancy, and independence in population codes. J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
- Golegaonkar, S., et al. Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).
- Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
- Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
