Kvantificering af oplysninger kodet af genet udtryk niveauer under levetid graduering Under bred vifte kosten begrænsning i C. elegans

Summary

Her præsenterer vi en ramme for at relatere bred vifte kosten restriktioner til genekspression og levetid. Vi beskriver protokoller for bred vifte kosten restriktioner og kvantitative billeddannelse af genekspression under dette paradigme. Vi skitsere yderligere beregningsmæssige analyser for at afsløre underliggende information processing funktioner af de genetiske kredsløb involveret i mad-sensing.

Abstract

Sensoriske systemer tillader dyr at opdage, behandle og reagere på deres miljø. Mad overflod er en miljømæssig cue, som har dybtgående virkninger på dyrs fysiologi og adfærd. For nylig, viste vi, at graduering af levetiden i nematode Caenorhabditis elegans af mad overflod er mere kompleks end tidligere anerkendt. Lydhørhed af levetid til ændringer i mad niveau bestemmes af specifikke gener, der fungerer ved at kontrollere information behandling inden for en neurale kredsløb. Vores rammer kombinerer genetisk analyse, høj overførselshastighed kvantitative imaging og informationsteori. Her beskriver vi, hvordan disse teknikker kan bruges til at karakterisere et gen, der har en fysiologisk relevans for bred vifte kosten restriktioner. Specifikt, er denne arbejdsproces designet til at afsløre, hvordan et gen af interesse regulerer levetid under bred vifte kosten restriktioner; derefter at fastslå, hvordan udtryk af genet varierer med mad plan; og endelig, at give en objektiv kvantificering af mængden af oplysninger formidles af genekspression om mad overflod i miljøet. Når flere gener undersøges samtidigt i forbindelse med en neurale kredsløb, kan denne arbejdsproces afsløre den kodning strategi ansat af kredsløbet.

Introduction

Alle organismer har brug at føle og reagere på ændringer i miljøet for at sikre deres overlevelse. I dyr, nervesystemet er den primære detektor og transducer oplysninger om miljøet og koordinerer den fysiologiske respons til enhver ændring, der kan påvirke den organisme overlevelse¹. Mad overflod er en miljømæssige stikord, der er godt undersøgt i flere sammenhænge, at ikke kun regulerer fødevare-relaterede adfærd, såsom fouragering², men også påvirker levetiden af et dyr. Graduering af levetiden af ændringer i mad overflod er et fænomen kendt som kosten restriktioner (DR), og har brede evolutionær bevarelse³.

Nematode Caenorhabditis elegans er en kraftfuld modelsystem for grundlæggende biologiske spørgsmål. Har udviklet et utal af teknikker, der giver mulighed for manipulation af ormen genom, såsom RNAi og i vivo gen redigering teknikker. Den lille fysiske størrelse-ormen og dens optisk gennemsigtighed også egner sig til i vivo billeddannelse af både transcriptional og translationel fluorescerende journalister og nytte af høj overførselshastighed teknologier såsom mikrofluidik⁴. Sammen, kan disse værktøjer udnyttes for at undersøge hvordan neurale kredsløb direkte dyrs adfærd.

C. elegans er en bacterivore og flere metoder har været offentliggjort, giver mulighed for præcis kontrol af fødevarer overflod ved at manipulere bakteriel koncentration^5,6,7,8 . Inden for forskningsverdenen C. elegans er DR blevet undersøgt i to forskellige sammenhænge. Først kan betegnes 'klassisk DR', så det afspejler de ændringer som reaktion på faldende mad niveauer i andre organismer. I denne sammenhæng, faldende mad overflod fra ad libitum niveauer resulterer i en stigende levetid indtil en optimal er nået, efter dette punkt levetid falder med yderligere reduktion af mad^{6,7, 9}. Den anden sammenhæng under som DR har været studeret i C. elegans er kosten afsavn, hvor levetiden af orme er øget ved fuldstændig fjernelse af enhver bakteriel mad kilde^10,11. I Entchev et al. (2015)¹², viste vi, at kompleksiteten i DR som følge af disse to forskellige paradigmer kan undersøges samtidigt i en kontekst, vi kalder 'bred vifte DR'. Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet nedenfor, vi identificeret en ny klasse af gener involveret i DR at begge veje modulere levetid reaktion på fødevarer overflod og er involveret i neurale kredsløb, der fornemmer mad¹² (figur 1).

Svar af et dyr på ændringer i miljøet integrerer en sekvens af biologiske processer, der knytter den sensoriske system til komplekse regulerende interaktioner formidle miljøoplysninger til fysiologi. Selv om de mekanistiske detaljer af sådanne "informationsflow" er ofte ukendt, kan genetiske værktøjer bruges til at erhverve et indblik i hvordan dette kompleks beregning er organiseret blandt forskellige biologisk komponenter. I vores seneste arbejde viste vi at daf-7 og tph-1 er involveret i overførsel af miljøoplysninger om mad overflod gennem en mad-sensing neurale kredsløb, der modulerer levetid i C. elegans^{12 , 13}. ved at anvende matematiske rammerne af informationsteori¹⁴, vi var i stand til at kvantificere mængden af miljøoplysninger, i form af bits, der er repræsenteret ved gen expression ændringer i daf-7 og tph-1 i specifikke neuroner på tværs af forskellige fødevarer niveauer. Fra dette har vi så kunnet afdække den kodning strategi af denne neurale kredsløb, og hvordan det er genetisk kontrolleret (figur 2).

I den følgende protokol skitsere vi de nødvendige skridt til at forstå virkningerne af gener af interesse udtryk i specifikke neuroner og hvordan de deltager i strømmen af fødevareinformation fra miljø til levetid. Bredt, vores rammer er opdelt i to eksperimentelle protokoller og en beregningsmæssige arbejdsproces. For de eksperimentelle aspekter, er det afgørende at have mutanter af gener af interesse, som kan undersøges under bred vifte DR. Faithful transcriptional reportere er også nødvendigt at kvantificere niveauet udtryk af gener på forskellige fødevarer niveauer. For at kunne gennemføre den beregningsmæssige analyse drøftet i vores metode, skal datasættet være af tilstrækkelig størrelse til at give meningsfulde skøn over udtryk distributioner. Selvom vi give skabelon kildekoder for analyserne, skal som brugeren være bekendt med sproget i informationsteori, som er flittigt brugt i hele vores beregningsmæssige ramme. Kildekoder er skrevet i R og C++. Derfor er en vis grad af programmering færdigheder også forpligtet til at anvende dem på en meningsfuld måde.

Protocol

1. forberedelse af bakteriel kulturer og plader for General Worm kultur

1. forberede 100 mL lysogeny bouillon (LB) medier i en 250 mL glasflaske og steriliseres ved autoklavering.
2. Podes flaske med en enkelt koloni af Escherichia coli-stamme OP50 og inkuberes ved 37 ° C natten over og derefter gemme kultur ved 4 ° C indtil behov.
3. Forberede 5 L af sterile ødelægge vækst medium (NGM) agar ¹⁵ og alikvot 12 mL diskenheder i plast petriskåle med sterilt 6 cm.
4. Tillade agar natten over og derefter opbevares ved 4 ° C indtil behov.
5. Frø NGM plader mindst 3 dage før brug med 225 μl af den kølede OP50 kultur. Gemme plader ved 20 ° C indtil behov.

2. Forberedelse af bakteriel kulturer og fortyndinger for eksperimenter

1. forberede to masser af 500 mL af LB medier i en 2 L Erlenmeyerkolbe og steriliseres ved autoklavering.
2. Podes hver kolbe med en enkelt koloni af OP50 og vokse ved 37 ° C ryster på 200 rpm for omkring 14 h.
3. Supplere kulturer med den antibiotika streptomycin til en slutkoncentration på 50 μg/mL. Fortsat ryster for 30 minutter ved 37 ° C derefter placere kolberne på is i 15 min.
4. Overføre 450 mL af hver kultur i separate sterile centrifuge flasker (ideelt 500 mL kapacitet flasker til at undgå at opdele kulturer). Bevare den sidesten kultur på is, da det skal bruges til at bestemme koncentrationen af bakterierne.
5. Spin ned flasker på 4500 x g i et nedkølet centrifuge sæt ved 4 ° C i 25 min. Fjern supernatanten og gemme flasker på ice.
6. Fortyndes 100 μL af sidesten kultur fra hver kolbe i 900 μl sterilt LB. Brug 1 mL sterilt LB til nul spektrofotometrets, og derefter bestemme OD ₆₀₀ af 10-fold fortynding af hver kultur. Hvis for eksempel OD ₆₀₀ af 10-fold fortynding af overnight kultur er 0,28 så kultur havde en faktiske OD ₆₀₀ af 2.8.
7. Brug en stock brugsopløsning af bakterier af 1.12 x 10 ¹⁰ OP50 celler/mL, hvilket svarer til en OD ₆₀₀ 56. Derfor bruger eksempel OD ₆₀₀ af 2.8 ovenfra, resuspenderes fra 450 mL kultur i en 20 ^th af den originale lydstyrke, som i dette tilfælde er 22.50 mL. Resuspend bakterier med en steril S basal løsning suppleres med streptomycin til 50 μg/mL (SB + strep).
8. Resuspenderes i den passende mængde af sterile SB + strep.
9. Gøre alle efterfølgende koncentrationerne anvendes i eksperimenter fra serielle fortyndinger af arbejdende bestanden i SB + strep ved hjælp af fortynding faktorer anført i tabel 1.

3. Indstilling op levetid eksperimenter

Bemærk: levetid assays udføres på 6 cm behandlet vævskultur fyldt med 12 mL af NGM agar suppleret med streptomycin og carbenicillin (NSC), begge i en endelig koncentration på 50 μg/mL. Disse vævskultur plader er velegnet for levetid assays på ingen eller meget lav bakteriel koncentrationer, som ormene er betydeligt mindre tilbøjelige til at holder sig til væggen i pladen og udtørrende. Brugen af to forskellige antibiotika forhindrer OP50 stammen fra at udvikle resistens, som er kritiske i at kontrollere bakteriel koncentrationen på pladen. Også, ved at inaktivere bakterier med antibiotika, vi minimere virkningerne på orm levetid på grund af patogen infektion ¹⁶. Dette gør det muligt for os at overveje kun de mad-relaterede komponenter af bakteriel koncentration i disse eksperimenter. Mange C. elegans aldrende undersøgelser supplere NGM plader med kemiske fluoro-2 ′-deoxyuridine (FUdR) til at gengive voksne sterile. Men brug af FUdR kan være problematisk, da dens anvendelse kan forårsage flere confounding spørgsmål med lang levetid assays ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21}. Entchev et al. (2015) ¹² omgås dette spørgsmål ved udsættelse af L4 larver for RNAi af æg-5 ^{22 , 23}, der hæmmer den oocyt til embryo overgangen ved at blokere for dannelsen af æggeskal af befrugtet C. elegans oocyter resulterer i deres død.

1. Kultur C. elegans stammer, der vil blive analyseret på seedede NGM plader ved 20 ° C. tillade plader til at sulte sig til at sikre, at alle dyr er dyrket på en ensartet måde og potentielt konto for enhver transgenerationel effekter af udviklingsmæssige betingelser.
2. Overførsel sultet L1 larver til nye seedede NGM plader ved at skære et lille stykke af agar (5 mm x 5 mm) fra den sultet plade ved hjælp af en steril skalpel og placere det ned på en ny plade, en proces kaldet ' chunking ' af C. elegans forskning comm enhed ¹⁵. Vokse orme, indtil de når L4 fase. Fem L4 larver pr. stamme er derefter overført til individuelle seedede NGM plader og opbevares ved 20 ° C. Disse dyr repræsenterer P0 generation.
3. Brug L4 afkom af P0 generation at oprette F1-generation. Individuelt sted F1 L4 larver af vildtype N2 stamme på 30 seedede NGM plader.
   Bemærk: For mutantstammen afhænger antallet af plader kræves på deres vækstrate. For eksempel, underkastes daf-7(ok3125) dyr en forbigående dauer anholdelse ved 20 ° C. Således, denne stamme producerer mindre L4 larver end en plade af N2 vildtype orm.
4. For at kompensere for denne forskel, nedsat daf-7(ok3125) plader op en dag tidligere end N2 plader og på et større antal, en god orden forholdet er 3:1.
5. Overførsel synkroniseres L4-fase afkom af F1 forældre at NGM plader suppleret med 1 mM IPTG og 50 µg/mL carbenicillin (RNAi plader), der var seedet med 225 µL af HT115 bakterier at udtrykke dsRNA målretning æg-5-genet og holdt på 20 ° C i 24 timer. Mindst 360 orme pr. stamme, holdt med en tæthed på 15 dyr pr. plade, behøves pr. eksperiment.
6. Efter æg-5 RNAi behandling, overføres ormene til NSC plader med 225 µL af streptomycin-behandlede OP50 i en koncentration på 2 x 10 ⁹ celler/mL (tabel 1) for en yderligere 24 timer ved 20 ° C. Undgå fysiske skader til orme under dette og alle efterfølgende overførsler, forsigtigt scoop dyr fra nedenunder orm ved hjælp af en meget tynd blidt buet orm pick. Float dyr ud ormen pick ved at nedsænke det i en 10 µL dråbe af SB + strep placeret på overfladen af den nye plade.
7. Den næste dag, videredistribuere orme til NSC plader repræsenterer hver af mad niveauer lIsted i tabel 1 samt en række NSC plader, der indeholder ingen bakterier. Frø alle NSC plader med 225 µL af de relevante koncentration af bakterier, og seed de bakterier-fri NSC plader med 225 µL SB + strep. Vedligeholde orme med en tæthed på 15 dyr pr. plade, hvilket resulterede i mindst fire plader pr. mad betingelse pr. stamme. Skifte pladerne til den ønskede temperatur, eksperimentelle.
8. Overførsel orme til frisk NSC plader seedede med passende mad koncentration efter den tidsplan, der er skitseret i tabel 2.
9. Score dyr til bevægelse af forsigtigt prodding med en wire vælge. Manglende evne til at reagere er scoret som død. Score dyr for død på hver overførsel punkt og derefter dagligt efter det sidste overførsel punkt.

4. Indstilling af Imaging eksperimenter

Bemærk: trinene i dette afsnit er tilstrækkelige til at generere nok orme pr. stamme for imaging en eksperimenterende mad tilstand ved en given temperatur. Denne protokol kan skaleres til at passe antallet betingelser, der vil blive afbildet på en given dag. Dog bør udvises forsigtighed i den eksperimentelle design til at sikre, at tidsrammen er rimelig og dyr på tværs af forskellige stammer ikke har en større end 12 timer på dagen for billeddannelse aldersforskel. Det anbefales stærkt, at de transkriptionel journalister bliver afbildet er enkelt-kopi transgenics, da dette vil mere ligner den oprindelige forordning af genet. Protokollen skitseret nedenfor, og sammenfattet i tabel 3, giver også en strømlinet metode til at opnå store synkron alder matchede populationer af stammer, som kan bruges til andre eksperimentelle arbejdsprocesser.

1. Kultur dyr i imaging eksperimenter på 10 cm behandlet vævskultur plader til at give mulighed for en større tæthed af orme (∼ 100 dyr pr. plade) end levetid assays.
2. Fylde 10 cm plader med 30 mL af NGM agar plader og frø med fem 225 µL delprøver af kølede OP50 kultur i en cross-lignende formation.

5. Oprindelig kultur af Reporter stammer

1. kultur C. elegans stammer, der vil blive analyseret på seedede NGM plader ved 20 ° C. tillade plader til at sulte sig til at sikre, at alle dyr er dyrket på en ensartet måde og potentielt konto for nogen transgenerationel effekter af udviklingsmæssige betingelser.
2. Luns den sultet L1 larver til seedede NGM plader og vokse indtil de når L4 fase. Overføre tre L4 larver pr. stamme til to seedede NGM plader ved 20 ° C. Disse dyr repræsenterer P0 generation.
3. Bruge L4 afkommet af P0-generation til at konfigurere F1 generation. Sted F1 L4 larver af vildtype reporter stamme på 4 seedet NGM plader. For mutante stammer afhænger antallet af plader kræves deres vækstrate. Bruge den tidligere eksempel på daf-7(ok3125), reporter stammer i denne baggrund kræver tre gange nummerplader og skal sættes op to dage før vildtype reporter stammer, for at tage højde for forskelle i vækstrate.

6. Indsamling af æg og synkronisering af Reporter stammer

Bemærk: nogle gener af interesse i Fællesskabets C. elegans aldring forskning resultere i vækst og æglægning mangler når muteret, hvilket gør det vanskeligere at generere store synkron populationer af dyr af forskellige genotyper. For eksempel, forårsager daf-7(ok3125) mutationen en alvorlig æglægning defekt i forhold til vildtype N2 stamme. Derfor, for at få tilstrækkelig antal synkron L4 larver af forskellige stammer for kvantitative imaging eksperimenter kræver en mere robust metode end manuelt picking orme. Af denne grund, transcriptional reporter stammer blev udsat for en natriumhypochlorit (NaClO) / natriumhydroxid (NaOH) løsning behandling af fælderne voksne at bryde åbne dyrene og befri deres æg, en proces, der almindeligvis omtales som ' blegning ' af C. elegans forskning EF ¹⁵.

1. Højde for forskelle i vækst satser mellem stammer og beregne Hvornår plader af hver stamme bør høstes og bleget. Et eksempel på Hvornår vildtype og daf-7(ok3125) reporter stammer er bleget Se tabel 3.
2. Seriefremstillede vaske orme af en given stamme fra pladerne, den relevante dag, med 15 mL SB og indsamle i en steril 15 mL tube. Tillade, at dyr til naturligt sediment og derefter justere mængden af væske til 7 mL.
3. Tilføje 2 mL 5% NaClO og 1 mL 5 M NaOH til det rør, der indeholder de fælderne voksne. Forsigtigt rock blanding ved stuetemperatur for ikke mere end 3 min. NaClO vil dræbe bakterier og orme, mens NaOH forårsager orme at bryde apart frigive alle befrugtede æg de indeholde i væsken. Chitin æggeskal omkring embryonerne beskytter dem mod virkningerne af behandlingen, så længe eksponeringstiden er forholdsvis kort. Efter 3-min inkubation, vortex tube for ~ 30 s til at lette yderligere opløsning af ormen slagtekroppe.
4. Efter 3-min inkubation spin ned blanding ved 1.000 x g i 1 min til at pille æggene. Opsug væk de fleste af supernatanten ved hjælp af et sterilt glas pipette tilsluttet en sugekolbe, forlader ~0.5 mL i hver tube, for ikke for at forstyrre æggene.
5. Resuspenderes med 9,5 mL af SB og derefter gentage centrifugering trin og resuspension skridt yderligere to gange så at æggene er blevet vasket med SB tre gange i alt.
6. Efter sidste vask, pellet æg gennem centrifugering og derefter slette alle, men 0,5 mL af supernatanten. Resuspend æggene i de resterende 0,5 mL af SB og derefter alikvot 100 µL til tre 10 cm seedede NGM plader. Distribuere den 100 µL lige over alle fem bakteriel græsplæner på hver plade. For vildtype stammer, bør æggene ikke deponeres ved tætheder på over 200 pr. plade.
   1. Holde plader ved 20 ° C for 48 h og at opnå en meget homogen befolkning på L4 larver. For stammer med forsinket vækst fænotyper er det tilrådeligt at deponere så mange æg som tilgængelige og øge inkubationstiden. For eksempel, holde daf-7(ok3125)-indeholdende reporter stammer ved 20 ° C for ~ 64 h at tillade æg udklækkes og nå stadiet L4.

7. Behandling af Reporter stammer med æg-5 RNAi

1. seriefremstillede vaske orme ud af tre plader ved hjælp af 15 mL af SB og indsamle flydende i en steril 15 ml tube. Tillad L4 larver til naturligt sediment, og derefter Aspirér alle, men ~0.5 mL af væsken. I den vilde type reporter stammer, dette trin fjerner enhver yngre end L4 larver. I mutant baggrunde, dette trin hjælper fjernelse af enhver anholdt larver som dauers for daf-7(ok3125).
2. Resuspend orme med 9 mL af SB. Igen, overvåge blodsænkning af L4 larver og derefter Aspirér alle, men ~0.5 mL af supernatanten, når de fleste af L4 larver har pelleted. Gentag denne proces en gang mere. Derefter Aspirér alle, men ~0.5 mL af væsken, når størstedelen af L4 larver har afgjort.
3. Tilføje 10 µL sterilt S basal suppleret med 0,1% Pluronic F-127 (SB + Plu) til væske indeholdende L4 larver. Dette fungerer som et overfladeaktivt stof og forhindrer larverne klistrer til den indvendige overflade af plast pipette tips.
   1. Forsigtigt resuspend larverne ved hjælp af en P200 lav retention pipette spids og derefter alikvot 150 µL på tre 10 cm RNAi plader, der er seedet med 5 x 225 µL af æg-5 RNAi bakterier. Sikre, at orme er jævnt fordelt over alle fem bakteriel græsplæner.
4. Når væsken har absorberet i agaren, fjerne enhver ikke-L4 larver fra de plader, der ikke blev elimineret af proceduren for vask af manuelt picking dem. Derefter gemme plader ved 20 ° C til 24 h.

8. Indledning af bred vifte DR

NOTE: efter 24 h æg-5 RNAi behandling, L4 larver, der oprindeligt blev deponeret på pladerne er blevet 1 - dag gamle voksne.

1. Pick off alle unge larver, der undslap det forudgående manuelle fjernelse trin ned på dette stadium, forlader kun de 1 - dag gamle voksne på pladerne.
2. For hver stamme, vaske de 1 dag gamle voksne fra de tre plader med 15 mL sterilt SB + strep ind i en 15 mL rør. Tillad orme til naturligt sediment, og derefter Aspirér alle men 0,5 mL af supernatanten. Resuspend orme med 9,5 mL af SB + strep og Gentag trinene bundfældning og vask.
3. Efter sidste vask, tillade orme til sediment og derefter Aspirér alle men 0,5 mL af supernatanten. Tilsæt 10 µL SB + Plu og forsigtigt resuspend larverne ved hjælp af en P200 pipette spids og derefter alikvot 100 µL på en NSC tallerken med 5 x 225 µL bakterier på en koncentration 2 x 10 ⁹ celler/mL.
   1. Fordel 100 µL jævnt på tværs af alle fem bakteriel græsplæner. Under et mikroskop estimere antallet af dyr på pladen: målet er at have mellem 100-150 orme på tallerkenen.
   2. Bestemmer mængden af væske, der kræves for at opnå en orm tæthed inden for dette område og derefter alikvot på to ekstra plader. Justere antallet af orme på den første plade også falder i denne række og derefter gemme plader ved 20 ° C til 24 h.
4. Den næste dag, indsamle de 2 dage gamle voksne og distribuere nye NSC plader med den ønskede eksperimentelle koncentration af mad (tabel 1), genbrug af metoderne beskrevet i trin 2 og 3. Når væsken absorberes i agaren, skifte pladerne til den ønskede eksperimentelle temperatur for 24 h.
5. Den næste dag, indsamle de 3 dage gamle voksne og distribuere til frisk NSC plader med samme eksperimentelle koncentrationen af mad, genbrug metoden i trin 8.3 og 8.4. Når væsken absorberes i agaren, returnere pladerne til den eksperimentelle temperatur for 48 h.
6. Indsamle de 5 dage gamle voksne og distribuere til frisk NSC plader med samme eksperimentelle koncentrationen af mad, genbrug metoden i trin 8.3 og 8.4. Når væsken absorberes i agaren, returnere pladerne til den eksperimentelle temperatur for 24 h.

9. Mikrofluid Imaging af Reporter stammer

1. på dag 6 i voksenalderen, billede dyr ved hjælp af en brugerdefineret mikrofluid platform ^{24 , 25}. Fysisk pick off dyr fra de tre plader og suspendere i 5 mL kryogene rør indeholdende 4,5 mL af SB + strep.
   1. Når ormene sediment, Aspirér alle, men ~0.5 mL af supernatanten og resuspend dyrene i 4 mL af SB + strep. Denne vask fjerner overskydende bakterier, der ellers kan forstyrre billeddannelse. Ormene er indført i en brugerdefineret mikrofluid enhed via pres drevet flow ^{24 , 25}. Inden for enheden, individuelle orme er rettet ind og fanget i en billeddannelse kanal gated af pres-drevet på chip ventiler ²⁶ under kontrol af brugerdefinerede software.
2. Når en orm er fanget hovedkulds i den billeddiagnostiske kanal, indsamle en fluorescerende z-stack, med 50 afdelinger i 2 µm-trin, ved hjælp af en standard epifluorescensmikroskop med en 40 X olieobjektiv (1,3 NA) og et kamera. Indsamle røde og grønne fluorescerende billeder for hver af transcriptional reportere samtidigt ved hjælp af en emission splitter og gemt til analyse. Billede erhvervelse er automatiseret ved hjælp af brugerdefinerede software.
3. Behandle billedet automatisk ved hjælp af brugerdefinerede MATLAB scripts ²⁷ (findes på https://github.com/meizhan/SVMelegans). Z-stakke er indlæst i MATLAB og analyseres at identificere neuron-par og deres placeringer inden for billedbehandling flyet. De maksimale fremskrivninger beregnes derefter, og en tærskel algoritme er udnyttet til at lokalisere enkelte fluorescerende celler. Cell id beregnes derefter baseret på relative afstande og steder i ormen ' s hoved.
4. At kvantificere reporter fluorescens, uddrag den tre-dimensionelle volumen omkring hver cellular placering af z-stakken. Integrere intensitet over et konsistent antal de lyseste pixel, som fuldt indkapsle hele cellen i alle tilfælde.
5. At fjerne indblanding fra eksperimentelle betingelse-specifikke eller stamme-specifikke ændringer i gut auto-fluorescens af hvert dyr, beregne baggrund intensiteten for celle par nærmeste gut (ADF og ASI) via vurdering af tilstanden af den intensitet distribution i et bind omkring neuron. Trække denne baggrund intensitetsværdien fra den integrerede fluorescens at opnå det endelige output.

10. Data forsamling

Bemærk: fluorescens-intensiteten af alle neuroner analyseret af billedbehandling software er kombineret i den filtrerede udtryk-datafil (FED), som bruges til at beregne fordelingen profiler af gen udtrykket (skabelon R og C++ scripts er tilgængelige på https://github.com/giovannidiana/templates).

1. Manuelt check hver behandlet billede at bekræfte korrekte identifikation for alle celler. Billeder med fejlagtige celle identifikation skal registreres i en udelukkelse fil. I Diana et al. (2017) ¹³ udelukkelse-fil består af en binær tabel med ' 0 ' til rette og ' 1 ' for forkert celle identifikation. Antallet af rækker i tabellen er lig med antallet af orme afbildet med en kolonne for hver celle afbildet (i.e ASI, ADF og NSM).
2. Generere filen FED:
   1. køre bash script " gen_data + tid " til at generere celle-specifikke filer kombinerer udtryk værdier opnået fra hver orm afbildet filtreret ved hjælp af filen udstødelse. For hver mappe genereret af billedbehandling software, bash script læser filen anmærkning < folderprefix > _EXP.txt til at udtrække de eksperimentelle betingelser og udstødelse fil < folderprefix > _X.csv til at vælge kun korrekt identificeret neuroner. Udtrykket værdier læses fra filer < folderprefix > _data_ < neuron > .csv.
   2. Sammenkæde alle filer i " FED_split.dat " og sortere det efter eksperiment batch kode, ormen etiket og celle identitet.
   3. Køre " form " (C++ program, skik:. / sort FED_split.dat FED_merged.dat) til at vælge poster med nul fluorescens for hver celle og kombinere dem til én rækker i FED_merged.dat.

11. Estimering af oplysninger kodet

Bemærk: den følgende procedure beskriver, hvordan at kvantificere oplysninger om specifikke miljøforhold, kodet af genet udtryk sæt. I Diana et al. (2017) ¹³, oplysningerne kodet om mad overflod i miljøet blev undersøgt, men selve metoden er gældende til enhver diskret antal miljømæssige stater. Den vigtigste ingrediens at kvantificere oplysninger teoretiske variabler såsom oplysninger entropies eller redundans er fælles sandsynlighedsfordeling neurale svar under de sæt miljømæssige stimuli betragtes som. For at udføre sådanne skøn, er det afgørende at have en tilstrækkelig prøveudtagning af respons på tværs af populationer af orme. Gaussisk distributioner kan estimeres ud fra relativt små prøver; Det er dog vigtigt at have en idé om den forventede form af udtryk distribution at kvantificere den passende stikprøvestørrelse for en pålidelig tæthed skøn. På grund af den uundgåelige variation på tværs af forskellige forsøg, er det vigtigt at kontrollere, at de centrale værdier af distributioner opnået fra forskellige gentagelser af de samme eksperiment ikke er systematisk flyttet eller at nogen af de statistiske funktioner i den udtrykket distribution er ikke væsentligt ændret på tværs af forsøg. I tilfælde af retssag til retssag variabilitet er kompatibel med variabiliteten inden for hvert forsøg, er det afgørende at skabe balance mellem antallet af forsøg versus antallet af orme i forsøg til gennemsnitlig ud disse miljømæssige/biologiske faktorer, der påvirker retssag til retssag variation. Undersampling disse faktorer kunne stærkt skævhed de oplysninger-teoretisk analyse.

1. Som R script " code3D.R " giver en skabelon for at generere tredimensionelle tætheder baseret på filen " FED_merged.dat ", ændre denne skabelon efter specifikke FED headerformat. Listen " HeaderNames " repræsenterer navnene på hvert felt i filen FED mens " RONames " er listen over udlæsninger. Scriptet bruger pakken R ' ks ' ^{28 , 29} til at anslå multivariat distributioner inden for et hypercubic gitter med GS placeringer i hver dimension underopdele området mellem minimum og maksimum værdier i datasættet for hver udlæsning. Når den interne variable " gruppe " er sat til 0 alle data anvendes til tæthed skøn. Når den " gruppe " etiket er mellem 1 til 5 datasættet er opdelt i 5 disjunkte sæt, og udtrykket tætheder er anslået fra 80% af data som følge af udelukkelse af et af de fem sæt. Denne funktion bruges senere til at vurdere usikkerhedsmomenter.
   Bemærk: Brug af code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < mad > < GS > < outfolder > < etiket > < gruppen > < frac > hvor GT repræsenterer genotype, maden er den miljømæssige tilstand, outfolder er den eksisterende mappe, hvor distributioner vil blive gemt, etiket er et filnavn præfiks og frac er brøkdel af datasæt anvendes.
2. For hver miljømæssig stand generere de flerdimensionale fordelinger med forskellige gitter størrelser GS (f.eks. 20,30,40 placeringer). For at reducere beregningsmæssige belastning, er mindre værdier af GS at foretrække, når finere resolutioner ikke ændrer væsentligt at anslå den information. Genekspression distribution er skrevet i mappen < outfolder > angivet når du kører code3D.R som enkelt kolonne tekstfiler med filnavn struktur < etiket > _ < GT > _ < mad > _GS < GS > _group < gruppe >. dat.
   Bemærk: de forrige trin skoen betingede sandsynlighed distributioner hvor g angiver vektor af alle udlæsning og f er den miljømæssige tilstand. Dog til at beregne den gensidige information mellem genekspression og miljø ^{30 , 31}.
   
   vi har brug for fordelingen af input som også bestemmer (input-) i gennemsnit genekspression < img alt = "Ligning 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. Når input fordelingen ikke er direkte tilgængelig, en meningsfuld mængde til at karakterisere de kodning funktioner er kanal kapacitet, som kan fås ved at maksimere den gensidige information på tværs af alle mulige input distributioner.
3. Ved hjælp af genekspression distribution, anvende Arimoto-Blahut ³² algoritme til at anslå kanal kapaciteten af systemet og fordelingen af de miljømæssige input, der maksimerer oplysninger. Et eksempel på gennemførelsen af algoritmen, der kan findes i C++-program " Ccap3D.cpp " for de tre-dimensionelle genekspression kode analyseret i Diana et al. (2017) ¹³. Eksempel: Hvis udlodninger fra genotype GT123 er fremstillet af 80% af data (gruppe 3) med gitterstørrelse lig 30 og gemt i mappen ". /pdf/ " ved hjælp af et præfiks label = " PDF ". Er kommandoen til at beregne de oplysninger, der er kodet i GT123 baggrunden. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
   Bemærk: vurdering af de oplysninger, der er kodet af systemet er påvirket af flere kilder til usikkerhed, herunder valg af tæthed estimering algoritme og prøve størrelse bias. Trin 11.1-11.2 bør gentages ved hjælp af forskellige tæthed estimeringsmetoder til at vurdere størrelsen af systematiske bias indført ved hver algoritme.
4. Til at anslå usikkerheden, der skyldes stikprøvestørrelse, genberegne oplysninger fra trin 11.1-11.2 med grupper mellem 1 til 5. Variation på tværs af disse fem uafhængige prøveudtagninger i 80% af dataene vil afspejle virkningerne af stikprøvestørrelse på oplysninger estimering.
5. Beregn oplysninger ved hjælp af trin 11.1-11.2 over stigende brøkdel af data (som i trin 5) at korrigere for stikprøvestørrelse bias (Jack-knife metode) ³³.

12. Beregning af redundans, støj og Signal korrelation

1. Brug den optimale input distributioner fremstillet af skøn over den maksimal oplysninger til at beregne den gensidige information mellem input og gen expression svar af hvert neuron Nielsen. C++ source fil " GetMI1D.c " er et eksempelprogram at få marginal gensidig information fra fælles sandsynlighedsfordelinger.
2. Beregne redundans idet summen af de gensidige oplysninger for hvert neuron fremstillet ovenfor og derefter trække kanal kapaciteten.
3. Beregn den " shuffle " oplysninger sigt ^{13 , 34}. En skabelon C++ source fil kan findes i " GetShuffle.c ".
4. Brug den " shuffle " udtryk til at beregne signal og støj korrelation. For signal sammenhæng har vi og for den støj sammenhæng har vi .
5. Usikkerhed om redundans, opnå støj og signal korrelation med hensyn til de samlede oplysninger (trin 11.3 i forrige afsnit) fra flere prøveudtagninger i 80% af dataene og tager standardafvigelsen.

Representative Results

Ved at foretage levetid eksperimenter på mutanter af gener af interesse sammen med vildtype N2 stamme, kan man fastslå, om disse gener har en rolle i mad svaret til bred vifte DR. Vildtype reaktion bør være sammenlignelig med den ene afbildet i figur 1A. Enhver graduering af dette svar af mutanter, afspejles af en uensartet effekt på tværs af mad betingelser, angiver, at disse gener påvirker ormen evne til korrekt reagerer på ændringer i mad overflod, på hvilket punkt yderligere undersøgelse af de udtrykket svar af disse gener til bred vifte DR er berettiget. Hvis levetiden svar af mutanter ikke er dog signifikant forskellig fra vildtype derefter har generne ingen rolle i transducing virkningerne af bred vifte DR, i hvert fald på niveauet af gennemsnitlige levetid. Hvis mutationerne forårsager en ensartet skift af hele levetid svar har generne en mad-uafhængig effekt på lang levetid. Dette udelukker ikke muligheden for, at udtrykket af gener af interesse er mad-responderende, i hvilket tilfælde oplysningerne båret af disse gener er ikke overføres til levetid.

Den næste fase af protokollen er at bestemme, hvordan udtrykket niveauer ændre under bred vifte DR for generne af interesse. I figur 1Billustrere vi dette gennem udtryk niveauer af en transcriptional reporter fra daf-7, som viser en reaktion på ændringer i mad plan i ASI sensoriske neuroner. I en daf-7(-) mutant, er transcriptional reporter udtryk reaktion ændret. Hvis gener af interesse er virkelig fødevarer-responderende på niveau med levetid kan man forvente, at deres udtryk ændres også med mad. Tilsvarende, en transcriptional reporter i mutant baggrunden bør have en ændret udtryk profil svar til bred vifte DR. Det er dog også muligt at gen af interesse i en vildtype baggrund transcriptional reporter ikke viser nogen mad-responderende ændringer i udtryk. I denne situation, kan det indikere et post-transcriptional regulerende virkning, der falder uden for anvendelsesområdet for denne protokol.

I Diana et al. (2017)¹³, vi udtrak udtryk værdier for daf-7 i ASI og tph-1 i ADF'EN og NSM. I figur 2Aillustrere vi estimering af udtryk distribution i ASI og ADF for en given mad plan. At have flere udlæsninger fra enkelt orm billeder tillader os at analysere ikke kun mængden af oplysninger kodet uafhængigt af hvert neuron, men også de kombinatoriske oplysninger af den hele neurale kredsløb (figur 2B-2 C). Kombinere disse to oplysninger-teoretisk foranstaltninger gør det muligt at karakterisere system med hensyn til strategiens kodning ansat af neuroner til at formidle oplysninger om mad. Af redundansmængden i kredsløbet kan opnås ved at tage summen af de gensidige oplysninger for hvert neuron og fratrække den fælles gensidig information (kanal kapacitet) opnås ved at betragte de kombinatorisk udlæsninger af kredsløbet. En positiv værdi af sådanne forskel betegner en overflødige karakter af den kodning strategi, fordi den kumulative oplysninger blandt delene er større end den faktiske oplysninger kodet af hele kredsløbet. Omvendt afspejler en negativ værdi en synergistisk strategi, fordi den sande oplysninger kodet er større end summen af dens komponenter (figur 2B). Oplysninger og redundans kan sammenlignes på tværs af forskellige genotyper at udforske mulige højere orden roller af genregulering, for eksempel i Diana et al. (2017) ¹³ effekten af daf-7 mutation skifter den kodning strategi fra overflødige til synergistiske (figur 2C-2D).

Figur 1 : Svar af levetid og gen udtryk under bred vifte DR. (A) gennemsnitlige levetid for vildtype N2 stamme (sort streg) viser en kompleks reaktion på bred vifte DR. Omfanget af dette svar er svækket i en null mutant af daf-7 gen (rød linje). Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien, poolede data fra Entchev et al. (2015) ¹². (B) gennemsnitlige udtryk niveauer af transcriptional reporter for daf-7 genet i vildtype baggrund (sort streg) også vise en kompleks ikke-monotone svar til bred vifte DR. I daf-7(-) genetiske baggrund udtryk for denne transcriptional reporter er stærkt svækket og viser lidt svar på ændringer i mad plan. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien, data fra en enkelt retssag i Entchev et al. (2015) ¹². venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Beregningsmæssige metoder. (A) Illustration af to-dimensionelle tæthed estimering af tph-1 udtryk i ADF'EN og daf-7 udtryk i ASI som fremstillet af den 'ks' R pakke ved hjælp af et gitter dimension 30 x 30. (B) visualisering af de oplysninger, der er kodet ved det fælles udtryk for tph-1 og daf-7 (hele) og individuelt (summen af dele) for ADF'EN, ASI og NSM neuroner. Redundante og synergistiske tegn af kodningen er repræsenteret af forskellen mellem højden af de stablede søjler i ret og de oplysninger, der er kodet ved fuld circuit. (C) sammenligning mellem fødevareinformation kodet af vildtype dyr og daf-7(-) mutanter. (D) reduktion af gensidig information observeret i mutanter er ledsaget af et skifte mod synergistiske kodning. Paneler B-D er tilpasset fra Diana et al. (2017) ¹³. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Bakteriel koncentration (celler/ml)	Optisk densitet (600nm)	Fortyndingsfaktor (fra tidligere)
1.12E + 10	56.000	0,00
2.00E + 09	10.000	5,60
6.32E + 08	3.160	3.16
6.32E + 07	0.316	10.00
2.00E + 07	0,100	3.16
0 (S basal)	0.000	NA

Tabel 1: mad niveauer og fortynding faktorer bruges i bred vifte DR. Bakterierl koncentrationer (celler/mL) anvendes i bred vifte DR protokol, sammen med deres respektive OD₆₀₀ målinger og fortyndingsfaktoren kræves for at opnå hver koncentration fra den foregående.

	Eksperimentelle temperatur af levetid
Dag	12,5 ° C	15° C	17,5 ° C	20° C	22,5 ° C	25° C	27,5 ° C
-12	Luns alle stammer til frisk NGM plader og vedligeholde ved 20° C
-11
-10	Konfigurere P0 generation af daf-7(-) stammer og vedligeholde ved 20° C (1 L4 pr. plade, 5 plader)
-9	Konfigurere P0 generation af vildtype stammer og vedligeholde ved 20° C (1 L4 pr. plade, 5 plader)
-8
-7
-6
-5	Konfigurere F1 generation af daf-7(-) stammer og vedligeholde ved 20° C (1 L4 pr. plade, 90 plader)
-4	Konfigurere F1 generation af vildtype stammer og vedligeholde ved 20° C (1 L4 pr. plade, 30 plader)
-3
-2
-1
0	Vælge F2 L4 larver til > æg-5 RNAi plader og vedligeholde ved 20° C (15 L4 pr. plade, 24 plader)
1	Flytte 1 - dag gamle voksne til NSC plader med 2.0E + 9 celler/ml mad niveau og bevare ved 20 ° C
2	Flytte 2 - døgn gammel voksne NSC plader med eksperimenterende mad betingelser og eksperimenterende temperatur
3	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel
4
5	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel
6
7	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel
8
9	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel
10
11	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel
12
13
14	Overførsel	Overførsel	Overførsel	Overførsel
15
16
17
18	Overførsel	Overførsel
19
20
21
22	Overførsel

Tabel 2: tidsplan for levetid gennemført ved forskellige temperaturer. Skematisk oversigt over de trin, der er nødvendige for at etablere bred vifte DR levetid eksperimenter med forskellige temperaturer ved hjælp af daf-7(-) og vildtype stammer som eksempler. Antallet af overførsler til frisk plader af hver eksperimenterende mad falder med stigende temperatur. Dette er at tage højde for, at dyr ved højere temperaturer aging hurtigere og så en mere udsat for fysiske skader pr. overførsel.

Dage

IMA

Ging Pipeline -14 Luns reporter stammer i daf(-) baggrund. Vedligeholde ved 20 ° C. -13 Luns reporter stammer i naturen type baggrund. Vedligeholde ved 20 ° C. -12 Oprette P0 generation af daf-7(-) reporter stammer. Bruge 3 L4 larver pr. 10cm NGM plade. Bruge 2 plader og vedligeholde ved 20 ° C. -11 -10 Oprette P0 generation af vildtype reporter stammer. Bruge 3 L4 larver pr. 10cm NGM plade. Bruge 2 plader og vedligeholde ved 20 ° C. -9 -8 Opsætning af F1 generation af daf-7(-) reporter stammer. Bruge 3 L4 larver pr. 10cm NGM plade. Bruge 12 plader og vedligeholde ved 20 ° C. -7 -6 Opsætning af F1 generation af vildtype reporter stammer. Bruge 3 L4 larver pr. 10cm NGM plade. Bruge 4 plader og vedligeholde ved 20 ° C. -5 -4 -3 Blegemiddel daf-7(-) reporter stammer i eftermiddag (~ 5 pm) og deponere æg på 3 10cm NGM plader og vedligeholde ved 20 ° C. -2 Blegemiddel vildtype reporter stammer i morgen (~ 10 am) og depositum æg på 3 10 cm NGM plader og vedligeholde ved 20 ° C. -1 0 Vask L4 til 10 cm æg-5 RNAi plader. Bruge 3 plader pr. stamme og bibeholde ved 20 ° C. 1 Vask 1-dags voksne til NSC plader med 2.0E + 9 celler / ml. bruger 3 plader pr. stamme og bibeholde ved 20 ° C. 2 Vask 2 dag voksne til NSC plader seedede med eksperimenterende mad niveauer. Bruge 3 plader pr. stamme og Skift til eksperimentelle temperatur. 3 Overførsel til frisk NSC plader. Bruge 3 plader pr. stamme og vedligeholde ved eksperimentel temperatur. 4 5 Overførsel til frisk NSC plader. Bruge 3 plader pr. stamme og vedligeholde ved eksperimentel temperatur. 6 Vælge dyr fra plader og forberede billeddannelse.

Tabel 3: tidsplan for imaging pipeline. Skematisk oversigt over de trin, der er nødvendige for at etablere bred vifte DR imaging eksperimenter med fluorescerende transcriptional reporter stammer i daf-7(-) og vildtype baggrunde ved forskellige temperaturer som eksempler.

Discussion

Vi præsenterer her, en ny metode til kosten restriktioner, der indkapsler en langt bredere vifte af fødevarer koncentrationer end tidligere publicerede protokoller. Denne metode knytter to tidligere separate fænomener set i C. elegans DR litteratur, bakteriel afsavn og klassisk kosten begrænsning, så begge kosten effekter at være studerede under en protokol. Ved hjælp af den nye bred vifte DR paradigme, præsenterer vi en generel ramme for behandlingen af enkelt celle genekspression i svar på en bestemt miljømæssig cue og bestemme, hvordan denne celle koder oplysninger. Vores ramme består af to eksperimentelle protokoller, der illustrerer, hvordan du udfører levetid og kvantitative imaging, henholdsvis, under bred vifte DR. Data fra disse eksperimentelle protokoller kan derefter undersøges med de beregningsmæssige analyser i denne ramme at kvantificere de oplysninger, der er kodet ved ændringer i gen expression niveauer eller levetid på tværs af forskellige fødevarer betingelser.

Levetid eksperimenter ved hjælp af bred vifte DR paradigme involverer seks forskellige fødevarer niveauer (tabel 1). Dette nødvendiggør en mere arbejdskrævende tilgang end undersøge levetid under færre fødevarer niveauer, såsom diætprodukter afsavn^10,11 eller ved hjælp af spise-2 genetiske baggrund³⁵. Behandlingen på levetid på en enkelt betingelse kan dog begrænse fortolkningerne af et gen rolle i DR. For eksempel, viste vi for nylig, at daf-7 mutanter har et tovejs dæmpning af reaktion på fødevarer koncentration sammenlignet med vildtype dyr¹² (figur 1A). I mangel af mad vise daf-7 mutanter en afkortning af deres levetid i forhold til vildtype dyr. Hvis vi havde kun anset for kosten afsavn, vi ville have fortolket som daf-7 genet som værende nødvendige for kun levetid forlængelse, , når faktisk daf-7 rolle er mere kompleks. Det kritiske resultat af denne del af protokollen er derfor, at fastslå, om et gen af interesse er involveret i modulerende levetid samlede reaktion på ændringer i mad overflod.

En væsentlig fordel ved denne protokol, sammenlignet med andre metoder er, at det bruger en ny metode til at fjerne afkom produktion i dyr undergår levetid analyse. De fleste undersøgelser bruger narkotika FuDR til at hæmme spredningen af kønscelleoverførsel i voksne gør dem sterile. Nylige undersøgelser har dog vist, FuDR behandling kan have tilstand - og gen-specifikke virkninger på levetid^{17,18,19,20,21}, at anløbe spørgsmålstegn ved dens generelle anvendelighed. I denne protokol, afskaffelse af afkom produktion er opnået gennem en 24 timer behandling af dyr med RNAi målretning æg-5 -gen, som hæmmer dannelsen af chitin æggeskal af befrugtet C. elegans oocyter resulterer i deres død^22,23. Fordelen ved denne metode er, at det er meget sent-handler og så ikke forstyrrer den germline, som er en væsentlig regulator af levetiden i C. elegans.

En potentiel advarsel af bred vifte DR protokol er dens afhængighed af brugen af antibiotika til at kontrollere bakteriel spredning for at sikre en stram kontrol af bakteriel koncentration. Bakteriel spredning i tarmen af ormen er kendt for at være en væsentlig årsag til død i C. elegans¹⁶. Således brug af bakteriostatisk antibiotika, såsom carbenicillin, i NGM agar forhindrer bakteriel spredning og øger levetiden af orme i forhold til ikke-antibiotisk kontrol¹⁶. Visse typer af antibiotika, såsom rifampicin³⁶ og medlemmer af tetracyclin familie^37,38, har vist sig at udvide levetiden i C. elegans uafhængigt af deres effekt på bakteriel spredning. Der er imidlertid ingen beviser i litteraturen at enten carbenicillin eller streptomycin kan øge levetiden uafhængigt af deres effekt på bakteriel spredning.

Levetid kan ses som output af en kompleks beregning hvor miljøoplysninger, dirigeres af genekspression i neuronal netværk, overføres til fysiologi. Vores protokol indeholder en metode til at forstå, hvordan specifikke gener påvirker denne strøm af miljøoplysninger. For at løse dette spørgsmål, vi har brug for pålidelige billedbehandling for at bestemme fordelingen af gen expression svar på én celle-niveau. At kunne vurdere ikke blot den gennemsnitlige svar af genekspression til ændringer i mad overflod men fuld statistiske fordeling fra store befolkningsgrupper udgør også et vigtigt krav for anvendelse af vores metode. Denne præcise beskrivelse af gene expression svar til mad overflod tillader anvendelse af oplysninger teori til at kvantificere de oplysninger, der er kodet af de specifikke neuroner samt kodning strategien ansat af det neurale kredsløb.

De billeddiagnostiske og beregningsmæssige aspekter af de metoder, der er skitseret i denne protokol finder anvendelse på et større sæt af biologiske sammenhænge. I vores arbejde fokuserer vi på en lille neurale netværk involveret i fødevarer sensing, men analyser af informationsbehandling funktioner er ikke begrænset til en bestemt celletype eller specifikke miljømæssige stikord. Fremover, blive disse metodologier potentielt udvidet til en større vifte af input variabler, der påvirker enhver fysiologiske output. Disse tiltag vil bidrage til en større forståelse af hvordan gen regulerende net indkode, proces og videregive oplysninger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbenicillin di-Sodium salt	Sigma-Aldrich	C1389-5G	Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt	Sigma-Aldrich	S6501-50G	Antibiotic
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758-10G	Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	71380-1KG-M	Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4)	Sigma-Aldrich	1.05104.1000	Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791-1KG	Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M2643-1KG	Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G	Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	71687-500G	Used for bleaching
Pluronic-F127	Sigma-Aldrich	P2443-1KG	Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO)	Sigma-Aldrich	1.05614.2500	Used for bleaching
LB Broth	Invitrogen	12780052	Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates	Greiner Bio-One	628960	Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates	Greiner Bio-One	664160	Plates for imaging
Low Retention P200 tips	Brandt	732832	Tips for handling worms in liquid
Agar	BD	214510	Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone	BD	211820	Peptone for NGM, RNAi and NSC plates