Her præsenterer vi en ramme for at relatere bred vifte kosten restriktioner til genekspression og levetid. Vi beskriver protokoller for bred vifte kosten restriktioner og kvantitative billeddannelse af genekspression under dette paradigme. Vi skitsere yderligere beregningsmæssige analyser for at afsløre underliggende information processing funktioner af de genetiske kredsløb involveret i mad-sensing.
Sensoriske systemer tillader dyr at opdage, behandle og reagere på deres miljø. Mad overflod er en miljømæssig cue, som har dybtgående virkninger på dyrs fysiologi og adfærd. For nylig, viste vi, at graduering af levetiden i nematode Caenorhabditis elegans af mad overflod er mere kompleks end tidligere anerkendt. Lydhørhed af levetid til ændringer i mad niveau bestemmes af specifikke gener, der fungerer ved at kontrollere information behandling inden for en neurale kredsløb. Vores rammer kombinerer genetisk analyse, høj overførselshastighed kvantitative imaging og informationsteori. Her beskriver vi, hvordan disse teknikker kan bruges til at karakterisere et gen, der har en fysiologisk relevans for bred vifte kosten restriktioner. Specifikt, er denne arbejdsproces designet til at afsløre, hvordan et gen af interesse regulerer levetid under bred vifte kosten restriktioner; derefter at fastslå, hvordan udtryk af genet varierer med mad plan; og endelig, at give en objektiv kvantificering af mængden af oplysninger formidles af genekspression om mad overflod i miljøet. Når flere gener undersøges samtidigt i forbindelse med en neurale kredsløb, kan denne arbejdsproces afsløre den kodning strategi ansat af kredsløbet.
Alle organismer har brug at føle og reagere på ændringer i miljøet for at sikre deres overlevelse. I dyr, nervesystemet er den primære detektor og transducer oplysninger om miljøet og koordinerer den fysiologiske respons til enhver ændring, der kan påvirke den organisme overlevelse1. Mad overflod er en miljømæssige stikord, der er godt undersøgt i flere sammenhænge, at ikke kun regulerer fødevare-relaterede adfærd, såsom fouragering2, men også påvirker levetiden af et dyr. Graduering af levetiden af ændringer i mad overflod er et fænomen kendt som kosten restriktioner (DR), og har brede evolutionær bevarelse3.
Nematode Caenorhabditis elegans er en kraftfuld modelsystem for grundlæggende biologiske spørgsmål. Har udviklet et utal af teknikker, der giver mulighed for manipulation af ormen genom, såsom RNAi og i vivo gen redigering teknikker. Den lille fysiske størrelse-ormen og dens optisk gennemsigtighed også egner sig til i vivo billeddannelse af både transcriptional og translationel fluorescerende journalister og nytte af høj overførselshastighed teknologier såsom mikrofluidik4. Sammen, kan disse værktøjer udnyttes for at undersøge hvordan neurale kredsløb direkte dyrs adfærd.
C. elegans er en bacterivore og flere metoder har været offentliggjort, giver mulighed for præcis kontrol af fødevarer overflod ved at manipulere bakteriel koncentration5,6,7,8 . Inden for forskningsverdenen C. elegans er DR blevet undersøgt i to forskellige sammenhænge. Først kan betegnes ‘klassisk DR’, så det afspejler de ændringer som reaktion på faldende mad niveauer i andre organismer. I denne sammenhæng, faldende mad overflod fra ad libitum niveauer resulterer i en stigende levetid indtil en optimal er nået, efter dette punkt levetid falder med yderligere reduktion af mad6,7, 9. Den anden sammenhæng under som DR har været studeret i C. elegans er kosten afsavn, hvor levetiden af orme er øget ved fuldstændig fjernelse af enhver bakteriel mad kilde10,11. I Entchev et al. (2015)12, viste vi, at kompleksiteten i DR som følge af disse to forskellige paradigmer kan undersøges samtidigt i en kontekst, vi kalder ‘bred vifte DR’. Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet nedenfor, vi identificeret en ny klasse af gener involveret i DR at begge veje modulere levetid reaktion på fødevarer overflod og er involveret i neurale kredsløb, der fornemmer mad12 (figur 1).
Svar af et dyr på ændringer i miljøet integrerer en sekvens af biologiske processer, der knytter den sensoriske system til komplekse regulerende interaktioner formidle miljøoplysninger til fysiologi. Selv om de mekanistiske detaljer af sådanne “informationsflow” er ofte ukendt, kan genetiske værktøjer bruges til at erhverve et indblik i hvordan dette kompleks beregning er organiseret blandt forskellige biologisk komponenter. I vores seneste arbejde viste vi at daf-7 og tph-1 er involveret i overførsel af miljøoplysninger om mad overflod gennem en mad-sensing neurale kredsløb, der modulerer levetid i C. elegans12 , 13. ved at anvende matematiske rammerne af informationsteori14, vi var i stand til at kvantificere mængden af miljøoplysninger, i form af bits, der er repræsenteret ved gen expression ændringer i daf-7 og tph-1 i specifikke neuroner på tværs af forskellige fødevarer niveauer. Fra dette har vi så kunnet afdække den kodning strategi af denne neurale kredsløb, og hvordan det er genetisk kontrolleret (figur 2).
I den følgende protokol skitsere vi de nødvendige skridt til at forstå virkningerne af gener af interesse udtryk i specifikke neuroner og hvordan de deltager i strømmen af fødevareinformation fra miljø til levetid. Bredt, vores rammer er opdelt i to eksperimentelle protokoller og en beregningsmæssige arbejdsproces. For de eksperimentelle aspekter, er det afgørende at have mutanter af gener af interesse, som kan undersøges under bred vifte DR. Faithful transcriptional reportere er også nødvendigt at kvantificere niveauet udtryk af gener på forskellige fødevarer niveauer. For at kunne gennemføre den beregningsmæssige analyse drøftet i vores metode, skal datasættet være af tilstrækkelig størrelse til at give meningsfulde skøn over udtryk distributioner. Selvom vi give skabelon kildekoder for analyserne, skal som brugeren være bekendt med sproget i informationsteori, som er flittigt brugt i hele vores beregningsmæssige ramme. Kildekoder er skrevet i R og C++. Derfor er en vis grad af programmering færdigheder også forpligtet til at anvende dem på en meningsfuld måde.
Vi præsenterer her, en ny metode til kosten restriktioner, der indkapsler en langt bredere vifte af fødevarer koncentrationer end tidligere publicerede protokoller. Denne metode knytter to tidligere separate fænomener set i C. elegans DR litteratur, bakteriel afsavn og klassisk kosten begrænsning, så begge kosten effekter at være studerede under en protokol. Ved hjælp af den nye bred vifte DR paradigme, præsenterer vi en generel ramme for behandlingen af enkelt celle genekspression i svar på en bestemt miljømæssig cue og bestemme, hvordan denne celle koder oplysninger. Vores ramme består af to eksperimentelle protokoller, der illustrerer, hvordan du udfører levetid og kvantitative imaging, henholdsvis, under bred vifte DR. Data fra disse eksperimentelle protokoller kan derefter undersøges med de beregningsmæssige analyser i denne ramme at kvantificere de oplysninger, der er kodet ved ændringer i gen expression niveauer eller levetid på tværs af forskellige fødevarer betingelser.
Levetid eksperimenter ved hjælp af bred vifte DR paradigme involverer seks forskellige fødevarer niveauer (tabel 1). Dette nødvendiggør en mere arbejdskrævende tilgang end undersøge levetid under færre fødevarer niveauer, såsom diætprodukter afsavn10,11 eller ved hjælp af spise-2 genetiske baggrund35. Behandlingen på levetid på en enkelt betingelse kan dog begrænse fortolkningerne af et gen rolle i DR. For eksempel, viste vi for nylig, at daf-7 mutanter har et tovejs dæmpning af reaktion på fødevarer koncentration sammenlignet med vildtype dyr12 (figur 1A). I mangel af mad vise daf-7 mutanter en afkortning af deres levetid i forhold til vildtype dyr. Hvis vi havde kun anset for kosten afsavn, vi ville have fortolket som daf-7 genet som værende nødvendige for kun levetid forlængelse, , når faktisk daf-7 rolle er mere kompleks. Det kritiske resultat af denne del af protokollen er derfor, at fastslå, om et gen af interesse er involveret i modulerende levetid samlede reaktion på ændringer i mad overflod.
En væsentlig fordel ved denne protokol, sammenlignet med andre metoder er, at det bruger en ny metode til at fjerne afkom produktion i dyr undergår levetid analyse. De fleste undersøgelser bruger narkotika FuDR til at hæmme spredningen af kønscelleoverførsel i voksne gør dem sterile. Nylige undersøgelser har dog vist, FuDR behandling kan have tilstand – og gen-specifikke virkninger på levetid17,18,19,20,21, at anløbe spørgsmålstegn ved dens generelle anvendelighed. I denne protokol, afskaffelse af afkom produktion er opnået gennem en 24 timer behandling af dyr med RNAi målretning æg-5 -gen, som hæmmer dannelsen af chitin æggeskal af befrugtet C. elegans oocyter resulterer i deres død22,23. Fordelen ved denne metode er, at det er meget sent-handler og så ikke forstyrrer den germline, som er en væsentlig regulator af levetiden i C. elegans.
En potentiel advarsel af bred vifte DR protokol er dens afhængighed af brugen af antibiotika til at kontrollere bakteriel spredning for at sikre en stram kontrol af bakteriel koncentration. Bakteriel spredning i tarmen af ormen er kendt for at være en væsentlig årsag til død i C. elegans16. Således brug af bakteriostatisk antibiotika, såsom carbenicillin, i NGM agar forhindrer bakteriel spredning og øger levetiden af orme i forhold til ikke-antibiotisk kontrol16. Visse typer af antibiotika, såsom rifampicin36 og medlemmer af tetracyclin familie37,38, har vist sig at udvide levetiden i C. elegans uafhængigt af deres effekt på bakteriel spredning. Der er imidlertid ingen beviser i litteraturen at enten carbenicillin eller streptomycin kan øge levetiden uafhængigt af deres effekt på bakteriel spredning.
Levetid kan ses som output af en kompleks beregning hvor miljøoplysninger, dirigeres af genekspression i neuronal netværk, overføres til fysiologi. Vores protokol indeholder en metode til at forstå, hvordan specifikke gener påvirker denne strøm af miljøoplysninger. For at løse dette spørgsmål, vi har brug for pålidelige billedbehandling for at bestemme fordelingen af gen expression svar på én celle-niveau. At kunne vurdere ikke blot den gennemsnitlige svar af genekspression til ændringer i mad overflod men fuld statistiske fordeling fra store befolkningsgrupper udgør også et vigtigt krav for anvendelse af vores metode. Denne præcise beskrivelse af gene expression svar til mad overflod tillader anvendelse af oplysninger teori til at kvantificere de oplysninger, der er kodet af de specifikke neuroner samt kodning strategien ansat af det neurale kredsløb.
De billeddiagnostiske og beregningsmæssige aspekter af de metoder, der er skitseret i denne protokol finder anvendelse på et større sæt af biologiske sammenhænge. I vores arbejde fokuserer vi på en lille neurale netværk involveret i fødevarer sensing, men analyser af informationsbehandling funktioner er ikke begrænset til en bestemt celletype eller specifikke miljømæssige stikord. Fremover, blive disse metodologier potentielt udvidet til en større vifte af input variabler, der påvirker enhver fysiologiske output. Disse tiltag vil bidrage til en større forståelse af hvordan gen regulerende net indkode, proces og videregive oplysninger.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Bargmann og Horvitz labs for reagenser. Nogle stammer blev leveret af CGC-udvalg, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Vi takker også M. Lipovsek for kommentarer til manuskriptet. Denne forskning blev støttet af Wellcome Trust (Project Grant 087146 til Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 og BB/M00757X/1 til Q.C.), European Research Council (NeuroAge 242666 til Q.C.), os National Institutes of Health (R01AG035317 og R01GM088333 til H.L.) og USA National Science Foundation (0954578 til H.L., 0946809 GRFP til M.Z.).
Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |