Her presenterer vi en ramme å relatere bredt kosttilskudd restriksjon genuttrykk og levetid. Vi beskriver protokoller for bredt kosttilskudd restriksjon og kvantitative bildebehandling av genuttrykk under dette paradigmet. Vi ytterligere skissere beregningsformelen analyser for å vise underliggende informasjon behandling funksjoner av genetisk kretser involvert i mat-sensing.
Sensorisk systemer tillater dyr å oppdage, behandle og svare på miljøet. Mat overflod er en miljømessig stikkordet som har dyptgripende virkninger på dyr fysiologi og atferd. Nylig viste vi at modulering av levetid i Rundormer Caenorhabditis elegans av mat overflod er mer kompleks enn tidligere inntektsført. Responsen til levetiden til endringer i mat nivå bestemmes av bestemte gener som fungerer ved å kontrollere informasjonsbehandling i en neural krets. Vårt rammeverk kombinerer genetisk analyse, høy gjennomstrømming kvantitative bildebehandling og informasjon teori. Her beskriver vi hvordan disse teknikkene kan brukes til å karakterisere alle genet som har en fysiologisk relevans til bredt kosttilskudd restriksjon. Spesielt er denne arbeidsflyten utformet for å avdekke hvordan en genet av interesse regulerer levetid under bredt kosttilskudd restriksjon; så å etablere hvordan uttrykket av genet varierer med mat nivå; og til slutt å gi en objektiv kvantifisering av mengden informasjon som formidles av genuttrykk om mat overflod i miljøet. Når flere gener undersøkes samtidig i forbindelse med en neural krets, kan denne arbeidsflyten avdekke koding strategi ansatt av kretsen.
Alle organismer må kunne forstand og svare på endringer i miljøet for å sikre deres overlevelse. I dyr, nervesystemet er den primære detektoren og svinger av informasjon om miljøet og koordinerer endringer som kan påvirke den organismes overlevelse1fysiologiske svaret. Mat overflod er en miljømessig indikator som er godt studert i flere sammenhenger som ikke bare regulerer mat-relaterte atferd, som foraging2, men også påvirker levetiden til et dyr. Modulering av levetid av endringer i mat overflod er et fenomen kjent som kosttilskudd restriksjon (DR), og har bred evolusjonære bevaring3.
Rundormer Caenorhabditis elegans er en effektiv modell for adressering grunnleggende biologisk spørsmål. En mengde teknikker har blitt utviklet som tillater manipulering av ormen genomet, som RNAi og i vivo genet redigering teknikker. Den fysiske størrelsen av ormen og dens optisk gjennomsiktighet egner seg også til i vivo avbildning av både transcriptional og translasjonsforskning fluorescerende journalister og nytten av høy gjennomstrømming teknologier som microfluidics4. Sammen kan disse verktøyene bli brukt for å undersøke hvordan nevrale kretser direkte dyr oppførsel.
C. elegans er en bacterivore og flere metoder har blitt publisert som tillater presis kontroll av mat overflod ved å manipulere bakteriell konsentrasjon5,6,7,8 . I C. elegans forskning samfunnet, har DR vært studert i to forskjellige sammenhenger. Først kan kalles ‘klassisk DR’, som det gjenspeiler endringene sett Svar å redusere mat nivåer i andre organismer. I denne sammenheng, redusere mat overflod fra ad libitum nivåer resulterer i en økt levetid frem til en optimal nås, etter dette punktet levetid reduseres med ytterligere reduksjon av mat6,7, 9. Andre sammenheng som DR har vært studert i C. elegans er kosttilskudd deprivasjon som lang av ormer økes med fullstendig fjerning av noen bakteriell mat kilde10,11. I Entchev et al. (2015)12, vi viste at kompleksiteten i DR som følge av disse to ulike paradigmer kan undersøkes samtidig under en sammenheng vi term ‘bredt DR’. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet nedenfor, vi identifisert en ny klasse av gener involvert i DR at bidirectionally modulerer levetid svaret mat overflod og er involvert i nevrale kretser som forstand mat12 (figur 1).
Responsen av et dyr endringer i miljøet integrerer en rekke biologiske prosesser som kobler Sanseorganer til komplekse juridiske interaksjoner formidle miljøinformasjon til fysiologi. Selv om mekanistisk detaljer om slike «informasjonsflyt”er ofte ukjente kan genetisk verktøy brukes å skaffe seg innblikk i hvordan denne komplekse beregningen er organisert blant ulike biologiske komponenter. I vårt siste arbeid viste vi at daf-7 og tph-1 er involvert i overføring av miljøinformasjon om mat overflod gjennom en mat-sensing nevrale krets som modulerer levetid i C. elegans12 , 13. ved å bruke matematiske rammen av Informasjonsteori14, kunne vi kvantifisere mengden miljøinformasjon, i biter, som representeres av gene expression endringene i daf-7 og tph-1 i bestemte neurons over annen mat nivåer. Fra dette var vi så kunne avdekke koding strategi ansatt av denne nevrale kretsen og hvordan er det genetisk kontrollert (figur 2).
I følgende protokollen skissere vi trinnene som kreves for å forstå hva effekten av gener av interesse uttrykt i bestemte neurons er og hvordan de delta på informasjonsflyten mat fra miljøet til levetid. Forstand, vårt rammeverk er delt i to eksperimentell protokoller og en beregningsformelen arbeidsflyt. For eksperimentelle aspekter, er det avgjørende å ha mutanter av genene severdigheter som kan undersøkes under bredt DR. Faithful transcriptional journalister er også nødvendig å kvantifisere hvilket uttrykk genene på forskjellig mat nivåer. For å kunne utføre beregningsorientert analyse i vår metode, må dataset være av tilstrekkelig størrelse å gi meningsfylt anslag over uttrykk distribusjoner. Selv om vi gir malen kildekoder for analysene, må brukeren være fortrolig med språket av Informasjonsteori som brukes mye i hele vårt beregningsorientert rammeverk. Kildesporene er skrevet i C++ og R. Derfor er en viss programmering ferdigheter også nødvendig for å bruke dem på en meningsfylt måte.
Her presenterer vi en ny metode for kosttilskudd restriksjon som omslutter et mye bredere utvalg for mat enn tidligere publiserte protokoller. Denne metoden linker to tidligere separate fenomener i C. elegans DR litteratur, bakteriell deprivasjon og klassisk kosttilskudd restriksjon, slik at begge kosttilskudd effekter å bli studert under ett protokollen. Bruker det nye bredt DR paradigmet, presenterer vi et generelt rammeverk for å undersøke enkeltcelle genuttrykk svar på et bestemt miljø stikkord og bestemme hvordan denne cellen koder informasjonen. Vårt rammeverk består av to eksperimentell protokoller som illustrerer hvordan å utføre lifespans og kvantitative bildebehandling, henholdsvis, under bredt DR. Data fra disse eksperimentelle protokollene kan deretter undersøkes med de beregningsformelen analysene i denne rammen å kvantifisere informasjonen kodet av endringer i gene expression nivåer eller lifespans over annen mat forhold.
Levetid eksperimenter bruker bredt DR paradigmet innebære seks forskjellige mat nivåer (tabell 1). Dette nødvendiggjør en mer arbeidskrevende tilnærming enn å undersøke levetid under færre mat nivåer, for eksempel kosttilskudd deprivasjon10,11 eller bruke de spise-2 genetiske bakgrunn35. Imidlertid kan undersøke på levetid under én betingelse begrense tolkninger av et gen rolle i DR. For eksempel viste vi nylig at daf-7 mutanter har en toveis demping av responsen på mat konsentrasjon sammenlignet med vill type dyr12 (figur 1A). I fravær av mat vise daf-7 mutanter en forkortelse av deres levetid sammenlignet med vill type dyr. Hvis vi hadde bare vurdert kosttilskudd deprivasjon, vi ville har tolket som daf-7 genet som livslengden utvidelse, bare når daf-7 rolle er faktisk mer komplisert. Kritisk utfallet av denne delen av protokollen er derfor å etablere om en genet av interesse er involvert i modulerende den generelle responsen levetid endringer i mat overflod.
En stor fordel med denne protokollen sammenliknet med annen metoder er at den bruker en ny metode for å eliminere avkom produksjon i dyr gjennomgår levetid analyse. De fleste studier bruker stoffet FuDR for å hindre spredning av germline hos voksne gjør dem sterile. Men har nyere studier vist FuDR behandling kan ha tilstand – og gen-spesifikke effekter på levetid17,18,19,20,21, ringer til spørsmålet brukbarheten generelt. I denne protokollen, eliminering av avkom produksjon er oppnådd gjennom en 24-timers behandling av dyr med RNAi målretting egg-5 genet, som hemmer chitin eggeskall av befruktet C. elegans oocytes resulterer i deres død22,23. Fordelen med denne metoden er at det er veldig sent-fungerende og så ikke påvirke germline, som er en viktig regulator av levetid i C. elegans.
En potensiell påminnelse bredt DR protokollen er sin avhengighet av bruk av antibiotika å kontrollere bakteriell spredning slik stram kontroll over bakteriell konsentrasjon. Bakteriell spredning i tarmen av ormen er kjent som en viktig dødsårsak i C. elegans16. Dermed bruk av bakteriostatisk antibiotika, som carbenicillin, i NGM agar hindrer bakteriell spredning og øker levetiden av ormer sammenlignet med ikke-antibiotikaresistens kontroller16. Visse typer antibiotika, som og36 og medlemmer av tetracycline familie37,38, vist seg å forlenge levetid i C. elegans uavhengig av deres effekt på bakteriell spredning. Men er det ingen bevis i litteraturen at enten carbenicillin eller streptomycin kan øke levetid uavhengig av deres effekt på bakteriell spredning.
Levetid kan vises som resultatet av en kompleks beregning der miljøinformasjon, rutes av genuttrykk i nevrale nettverk, overføres til fysiologi. Våre protokollen gir en metode for å forstå hvordan bestemte gener påvirker denne flyten av miljøinformasjon. For å løse dette spørsmålet, må vi pålitelig bildebehandling for å fastslå fordelingen av gene expression svar på encellede nivå. Å kunne anslå ikke bare til gjennomsnittlig svartid av genuttrykk til endringer i mat overflod, men også full statistisk distribusjon fra store befolkningsgrupper representerer en viktig forutsetning for anvendelsen av vår metode. Dette nøyaktig beskrivelse av gene expression svar til mat overflod kan anvendelsen av Informasjonsteori til kvantifisere informasjonen kodet av bestemte neurons samt koding strategi ansatt av nevrale krets.
De tenkelig og beregningsorientert aspektene av metodene beskrevet i denne protokollen gjelder for et større sett med biologiske sammenhenger. I vårt arbeid fokuserte vi på et lite nettverk involvert i mat sensing, men analyser av informasjonsbehandling funksjoner er ikke begrenset til en bestemt celle type eller bestemte miljømessige signaler. I fremtiden, kan disse metodene potensielt utvides til en større variasjon av input variabler, påvirker fysiologiske utdata. Disse vil bidra til en større forståelse av hvordan genet regulatoriske nettverk kode, prosess og overføre informasjon.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Bargmann og Horvitz labs for reagenser. Noen stammer ble levert av CGC, som finansieres av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Vi takker også M. Lipovsek for kommentarer på manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av Wellcome Trust (Project Grant 087146 til Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 og BB/M00757X/1 Q.C.), European Research Council (NeuroAge 242666 til Q.C.), oss National Institutes of Health (R01AG035317 og R01GM088333 til H.L.) og amerikanske National Science Foundation (0954578 til hl, 0946809 GRFP til M.Z.).
Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |