Summary
Α-hydroksylering av kreftfremkallende nitrosaminer ved cytochrome P450s er akseptert metabolske veien som produserer DNA-skade mellomprodukter, som føre til mutasjoner. Imidlertid viser nye data ytterligere oksidasjon til nitrosamides kan oppstå. Vi beskriver en generell metode for påvisning av nitrosamides produsert i vitro cytochrome P450-katalysert metabolismen av nitrosaminer.
Abstract
N-nitrosaminer er en veletablert gruppe av miljømessige kreftfremkallende, som krever cytochrome P450 oksidasjon viser aktivitet. Den aksepterte mekanismen av metabolske aktivering innebærer dannelsen av α-hydroxynitrosamines som spontant bryte ned til DNA alkylating agenter. Akkumulering av DNA skade og den resulterende mutasjoner kan til slutt føre til kreft. Nye bevis indikerer at α-hydroxynitrosamines kan videre oksideres å nitrosamides processively av cytochrome P450s. Fordi nitrosamides er vanligvis mer stabile enn α-hydroxynitrosamines og kan også alkylate DNA, kan nitrosamides spille en rolle i kreft. I denne rapporten beskriver vi en generell protokoll for å vurdere nitrosamide produksjon fra i vitro cytochrome P450-katalysert metabolisme av nitrosaminer. Denne protokollen bruker en generell tilnærming til syntesen av den relevante nitrosamides og i vitro cytochrome P450 metabolisme analysen ved hjelp av flytende kromatografi-nanospray ionization høy oppløsning tandem massespektrometri for gjenkjenning. Denne metoden oppdaget N′- nitrosonorcotinine som en mindre metabolitt av N′- nitrosonornicotine i eksempel studien. Metoden har høy følsomhet og selektivt grunn til nøyaktig masse gjenkjenning. Bruk av denne metoden på en rekke nitrosamine-cytochrome P450 systemer vil avgjøre omfanget til denne transformasjonen. Fordi cytochrome P450s polymorfe og varierer i aktivitet, kan bedre forståelse av nitrosamide formasjon hjelpe individuelle kreft risikovurdering.
Introduction
N-nitrosaminer er en stor klasse av kreftfremkallende faktorer i kosten, tobakksprodukter og generelle miljøet. de kan også dannes endogenously i menneskekroppen1. Mer enn 300 N -nitroso forbindelser har blitt testet og > 90% ble vurdert som kreftfremkallende i dyr modeller2,3. Å stille ut sine kreftfremkallende, må disse forbindelsene først aktiveres ved cytochrome P450s1,2,3. Forskning viser at cytochrome P450s lett oksidere nitrosaminer til α-hydroxynitrosamines (figur 1), som er svært reaktive stoffer med halv-liv ~ 5 før spontant separasjon til alkyldiazohydroxides. Sistnevnte kan alkylate DNA etter tapet av H2O og N2. Den resulterende DNA-addukter, hvis unrepaired, kan føre til mutasjoner som, hvis du er i kritisk onco- eller tumor suppressor gener, føre til kreft utvikling1. Av denne grunn store anstrengelser er brukt for å få en full forståelse av metabolske veier, DNA-addukter, og nedstrøms metabolitter av cytochrome P450 oksidasjon av kreftfremkallende nitrosaminer. Denne kunnskapen har potensiell program i individuelle kreft risiko vurdering4.
Figur 1: General og foreslåtte metabolismen av nitrosaminer.
Nitrosaminer (1) er oksidert av P450s til α-hydroxynitrosamines (2) som spontant bryte ned til alkyldiazohydroxides (3). Forbindelsene kan binde til DNA skjemaet DNA-addukter. Det er en teori om at 2 er ytterligere oksidert av P450s til nitrosamides 4. Dette kan direkte binde DNA til skjemaet romanen DNA-addukter eller være hydrolyzed 3 form kjent DNA-addukter. R1 og R2 representerer noen alkyl gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Selv om α-hydroxynitrosamine hypotesen er solid støttes av omfattende, er det noen inkonsekvenser; en stor en er den korte halveringstiden α-hydroxynitrosamines5,6. Det er kjent at disse forbindelsene er produsert på endoplasmatiske retikulum membranen og senere alkylate kjernefysiske DNA. Gitt livet av noen sekunder, er det rart hvordan disse mellomprodukter overleve ønsket reiser skjønt stoffer. En hypotese er at en del av α-hydroxynitrosamines er processively oksidert til nitrosamides7,8, som er ganske stabile i sammenligning9. Dette vil trolig skje via oppbevaring av α-hydroxynitrosamines i det cytochrome P450 aktive området. Presedens for denne typen oksidasjon har blitt sett med nikotin10, alkoholer11og enkel alkylnitrosamines12,13. Dessuten er nitrosamides direkte-fungerende kreftfremkallende2,3. Basert på deres reaktivitet9, antas disse forbindelsene å produsere DNA-addukter identisk med de som følge av α-hydroxynitrosamines sammen med nye, ukjente DNA-addukter (figur 1). Derfor denne hypotesen ikke bare forklarer transport gjennom stoffer, men også dannelsen av DNA skade produkter.
En generell protokoll for å vurdere i vitro cytochrome P450-mediert konvertering av nitrosaminer til nitrosamides er beskrevet i dette dokumentet. Tidligere rapportert konvertering av N′- nitrosonornicotine (NNN) til N′- nitrosonorcotinine (NNC) ved cytochrome P450 2A6 er vist som en eksempel14. Bruk av denne protokollen til en rekke substrat-enzym systemer vil avgjøre betydningen av nitrosamides i totale nitrosamine metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. materialer og generelle prosedyrer
- syntetisere NNN som tidligere beskrevet 15. Få norcotinine P450 2A6 Baculosomes, NADPH gjenfødelse systemet, 0,5 x reaksjon buffer og alle andre kjemikalier eller løsemidler fra kommersielle kilder i reagens klasse.
- Post NMR spekter på en 500 MHz spectrometer. Rapporten kjemiske Skift som deler per million (ppm). Bruke gjenværende løsemiddel topper som interne referanser for 1 H-NMR (7.26 ppm CDCl 3) og 13 C-NMR (77.2 ppm CDCl 3).
Merk: Peak deling brukes følgende forkortelser: s = singlet, d = doublet, dd = doublet av doublets, dt = doublet med trillinger, dq = doublet i kvartetter, ddd = doublet av doublet doublets og m = multiplet. - Utføre høyoppløselig massespektrometri (HRMS) for valgte forbindelser LTQ Orbitrap Velos og rapportdata som m/z.
- Bruk bandet pre-belagt silica gel TLC plater (40 mm x 80 mm, 0.2 mm tykk) med 254 nm fluorescerende indikator for tynne lag kromatografi (TLC). Visualisere TLC plater av UV lampen bestråling.
- Utføre flash Ture på en 60 Å, 70-150 mesh silica gel bruker en 1,5 cm x 15 cm glass kolonne.
2. Utarbeidelse av nitrosamide positive kontroll (N ′-nitrosonorcotinine, NNC)
- tørr, i en ovn natten (16 h, ~ 140 ° C), en 25 mL, runde bunn kolbe som inneholder en magnetic røre bar. I morgen, kule kolbe under en strøm av N 2 mens du bruker en olje bubbler for å holde N 2 flyten rate under en boble per sekund.
Merk: Etter avkjøling, ingen forholdsregler for å holde flasken under N 2 kreves. - i avtrekksvifte, legge til norcotinine (31,8 mg, 0.196 mmol), eddiksyre (5 mL) og eddiksyre (1 mL) avkjølt kolbe. Rør denne blandingen kontinuerlig mens nedkjøling 0 ° c med vann-is bad.
Forsiktig: Eddiksyre og eddiksyre er korrosiv. - Legge til NaNO 2 (33.3 mg, 0.483 mmol) i en del og kontinuerlig rør blandingen for 2,5 h. overvåke reaksjon utviklingen av TLC (100% EtOAc, R f = 0,19, se trinn 1.4).
Merk: Over denne gangen blandingen blir stadig gul med sporadiske boblende. - Slukke reaksjonen ved å helle blandingen i iskalde H 2 O (18 mL). Umiddelbart trekke vandig løsningen med 18 mL lm 2 Cl 2 i en 100 mL separatory trakt. Ekstra vandig laget minst 2 ganger med lm 2 Cl 2 (9 mL hver).
- Tørt det grupperte organiske over ~ 100 mg av MgSO 4 2 min. Filter og konsentrere løsningen av roterende fordampning å gi en rå, gul olje. Varme vannbad 30 ° c i løpet av fordampning å fjerne de gjenværende eddiksyre.
Merk: Protokollen kan pauses her hvis sammensatt er oppløst i lm 2 Cl 2 og løsningen lagret i mørket på 2-8 ° C. - Renser råolje sammensatt av kolonnen kromatografi (se trinn 1.5) med silica gel som stasjonære fase og 100% EtOAc eluent 16.
Forsiktig: NNC og relaterte nitrosamides bør håndteres med forsiktighet som de antas for å være menneskelig kreftfremkallende. - Løses ren sammensatte i CDCl 3 og bruke NMR (se trinn 1.2) å bekrefte strukturen og finne ut molarity av denne løsningen 17. Lagre denne løsningen i mørket på 2-8 ° C inntil.
Merk: Denne løsningen vil bli brukt som positive kontrollen i analysen i vitro (trinn 3,5). NMR spekter og kjemiske Skift finnes i støtte informasjonen. - Med en ren NNC løsning, bekrefte den nøyaktige foreldre masse og bestemme produkt ion massene av direkte infusjon på en høyoppløselig masse spectrometer (HRMS) under parameterne som beskrives i trinn 1.3 og 4.3.
Merk: Fabrikat massene skal brukes for å oppdage dette sammensatte i i vitro metabolisme analysen (trinn 4.3).
3. Et eksempel nitrosamine-P450 i vitro inkubasjon
- ta P450 2A6 Baculosomes, livlig-NADPH-regenerering System og 10 mM NADP + lager løsning fra-80 ° C fryser og la dem tine på is. Når tint, fortynne den Baculosomes og NADPH-regenerering System 1:10 og 1:50, henholdsvis i en enkelt 1 mL tube med 0,5 X reaksjon Buffer. Tilsvarende legge 3 μL NADP + lager løsning å 97 μL 0.5 X reaksjon Buffer.
Merk: NADP + er lysfølsom. Holde denne løsningen beskyttet av innpakning beholderen i aluminiumsfolie. Enzym løsninger er følsom å fryse-Tin sykluser; begrense dette til mer enn 2 sykluser. Forberede dele nødvendig for senere eksperimenter. - For hver inkubasjon legge 50 μL av enzymet løsning (inneholder 5 pmol P450) til en 1 mL tube inneholder 40 μL 4 μM NNN løsning med reaksjon Buffer. Pre ruge denne ny blanding i 2 minutter på 37 ° C ved hjelp av et vannbad, og deretter legge 10 μL utvannet NADP + løsning. Inkuber hele systemet for 1-30 min på 37 ° C.
Merk: Bruke 5 minutters intervaller for inkubasjon ganger (f.eks 5, 10, 15 min, etc.) vil gi en tilstrekkelig nitrosamide formasjon tid kurs. - Etter den ønskede inkubasjon tid, slukke ved første legge 10 µL 3.0 N ZnSO 4 og deretter 10 μL 3.0 N Ba(OH) 2. Vortex denne løsningen og en hvit bunnfall vil danne. Sentrifuge prøven 8000 x g for 4 min til pellets bunnfall.
Merk: Prosedyren må ikke stoppe på dette trinnet som dannet nitrosamides har begrenset stabilitet i vandige løsninger. Lange pauser kan medføre feilaktige negativer. - Umiddelbart Pipetter nedbryting og analysere 2 μL av flytende kromatografi positiv nanoelectrospray-ionisering høyoppløselig tandem massespektrometri (LC-NSI +-HRMS/MS, trinn 4.1-4.3).
- For positiv kontroll incubations, fordampe en aliquot som inneholder 100 fmol syntetisert NNC løsning i en 1 mL tube under en strøm av N 2. Til denne hetteglass, legge den full enzymsystemet fra trinn 3.2 og fortsette som trinn 3.3-3.4.
- For negativ kontroll incubations, utføre eksperimentet som beskrevet (trinn 3.2-3.4) unntatt Erstatt 50 μL enzym løsning med 0.5 X reaksjon buffer.
4. Eksempel parametere for nitrosamide oppdagelsen av LC-NSI +-HRMS/MS
- For LC komponent, gjelder følgende flertrinns forløpningen i trinn 4.2 for et UPLC system som bruker en kommersiell, hånd-pakket 18 C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, 15 μm orifice kapillær kolonne.
- Bruker 5 mM NH 4 OAc som løsemiddel A og MeCN som løsemiddel B, laste utvalget på kolonnen ved å kjøre på 5% B på 1 μL/min 0 - 5 min, og så bremse infusjonshastigheten til 0,3 μL/min etterpå. Deretter kjører en gradient fra 5 til 20% B over 4 min, etterfulgt av en rampe til 55% B over 10 min og deretter re balanse 5% B.
- Utføre Langbane-NSI +-HRMS/MS på en LTQ-Orbitrap. Skjermen for NNC både i sin helhet avsøke og MS 2 fragmentering. Utføre fullstendig skanning med en oppløsning på 60.000 og ekstra nøyaktig overordnede massen (192.07670) på en masse toleranse for 5 ppm. Bruk MS 2 fragmentering å isolere overordnede ioner (2.0 amu) og fragment av kollisjon-indusert dissosiasjon (CID) med en kollisjon energi av 25 eV, oppløsning på 15.000, og skanne tiden 30 ms. trekke ut nøyaktig massene for produktet ioner av NNC (m/z 192 m/z 134.04739 og 162.07874) på en masse toleranse for 5 ppm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Basert på arbeidet til hvit et al. 19, norcotinine var nitrosated til NNC rent og høykapasitets (80-92%) å produsere en standard for eksperimentet i vitro . Strukturelle bevis for en vellykket reaksjon ble Hentet fra spectroscopic analyser inkludert 1H-NMR, 13C-NMR, koselig og HSQC (støtte informasjon) sammen med HRMS som bekreftet overordnede massen [M + H]+ innen 5 ppm i teoretisk verdi (figur 2). MS2 fragmentering av NNC ble brukt til å bestemme rikeste produktet ion massene. Bestemt nøyaktig overordnede masse og produkt ion massene ble brukt i metoden LC-NSI+- HRMS/MS i vitro analysen. Hvis lagret i mørket på 2-8 ° C, er den NNC løsningen stabil i minst 3 måneder. Dette er en veldig generell reaksjon, har programmet noen 2° amid.
Figur 2: HRMS og HRMS2 spekteret av NNC.
A) nøyaktig overordnede masse NNC med en masse toleranse for 5 ppm: beregnet: [M + H]+ = 192.07675, grunnlegge: 192.07670. B) MS2 fragmentering av m/z 192 med en isolasjon bredde 2.0 AMU. De to vanligste produkt ionene er 134.04739 og 162.07875. Gjengitt med tillatelse fra kjemiske disponible Toxicol., 2016, 29, pp 2194-2205. Copyright 2016 American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Syntetisk NNC ble benyttet som standard for i vitro P450 metabolisme analysen. Cytochrome P450 2A6 ble brukt fordi det er kjent for å være en effektiv katalysator NNN oksidasjon20. Likeledes ble NNN konsentrasjonen satt til 2 μM som den beregner Km for α-hydroksylering21. Under de brukt kromatografiske forholdene beskrevet, elutes syntetisk NNC ~17.5 minutter med godt løst topper i både overordnede ion og produkt ion kanaler. I samsvar med den positive kontrollen, ble dannelsen av NNC nevnt i 1, 5 og 10 min incubations.
Figur 3: LC-NSI-HRMS chromatograms fra NNN-cytochrome P450 2A6 incubations.
For alle deler er den beste chromatogram nøyaktig overordnet masse Hentet fra fullstendig skanning for NNC. Chromatograms midten og bunnen er to nøyaktige produktdata ion massene utvunnet fra MS2 fragmentering for NNC. Delene er som følger: NNC standard (A), NNC-cytochrome P450 2A6 incubations som inneholder alle relevante enzymer og kofaktorer med inkubering ganger 1 min (B), 5 min (C) og 10 min (D). RT = tiden; MA = masse området. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
NNC nivåer var maksimalt 5 minutter og redusert på senere tidspunkt. Relativ kvantifisering bruke syntetisk NNC som en standard anslått maksimal NNC nivåer for å være 10 nM. Den negative kontroll mangler P450 systemet, ingen NNC formasjon var oppdaget (data ikke vist), dermed indikerer enzymatisk konvertering var nødvendig. Sammen, denne protokollen viser direkte bevis for konvertering av NNN til NNC av P450 2A6, selv om omfanget av formasjonen er mindre enn α-hydroksylering av NNN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klargjørende metabolismen av nitrosaminer er en kritisk komponent å forstå deres kreftfremkallende. Siden den involvert cytochrome P450s og andre metabolsk enzymer polymorfe, kan ytterligere anvendelse av denne kunnskapen potensielt identifisere høy risiko individer1,4. Nye data indikerer at ytterligere oksidasjon av α-hydroxynitrosamines, de antatte store metabolitter av nitrosaminer involvert i DNA binding, nitrosamides er mulig; men er dette ikke robust testet over en rekke underlag. Vi har beskrevet en protokoll for å bestemme omfanget av processive oksidasjon av nitrosaminer til nitrosamides i vitro. Bredt program med denne metoden vil avgjøre generelle betydningen av denne ruten av stoffskiftet.
Metoden starter ved forbereder en standard nitrosamide rundt. I eksempel studien er det NNC, en hypotetisk gjennomsnitt metabolitten av tobakk kreftfremkallende NNN, et karsinogen i tobakk produkter14,22. Som beskrevet, gikk nitrosation av norcotinine jevnt med ingen synlig siden produkter. Råolje produktet ble forurenset av bare Start amid og eddiksyre, som var lett fjernes ved kolonnen kromatografi. Dette ble etterfulgt av bekreftelse av strukturen av NMR og HRMS. En fordel med denne metoden er at det er egnet for nesten alle amid, som tillater flere nitrosamine/nitrosamide systemer undersøkes. I tillegg gir bruk av NMR for kvantifisering en direkte måling av molarity for standardløsning17. Dette tillater lagring av sammensatt under inert forhold i stedet for krever måling av destruktive teknikker som reverse-fase HPLC. Deretter gjøres ulike fortynninger som passer i eksperimentet.
Med en positiv kontroll og en vel preget masse fragmentering, svært sensitive og selektiv LC-NSI+- HRMS/MS metoden gjør det påvisning av nitrosamides i en relativt kompleks matrise. Som vist, anslått metoden en NNC konsentrasjon av 1-10 nM eller 2 – 20 fmol på kolonne til tross for 1000-fold overflødig starter nitrosamine, enzym og andre kofaktorer. Følsomhet og selektivitet av metoden er på grunn av bruk av høy oppløsning masse overvåking, der standard LC-MS systemer mangel. Overordnede ion utvalg med en 5 ppm masse toleranse sikrer at bare forbindelser med ønsket molekylære formel er isolert. Likeledes, nøyaktig masse påvisning av de to rikeste produkt ionene sammen med deres tiden gir ekstra analytt bekreftelse. Derfor krever massespektrometri metoden at mange parametre optimalisert inkludert isolasjon bredde, kollisjon energi og skanning. LC graderingen kan også endres for å forbedre følsomhet som co elueringsrør med andre stoffer vil begrense fylle ion fellen med målet nitrosamide.
I eksempel studie14var NNC formasjon mindre. Basert på masse området, NNC var ~ 4000 ganger mindre rikelig enn hydrolyzed produktene α-hydroxyNNN21. Selv om dette angir NNC er en veldig liten metabolitt av NNN, kan andre systemer variere. Chowdhury et al. funnet betydelige, processive oksidasjon av dimethylnitrosamine og diethylnitrosamine; men var det nitrosamide mellomliggende undetectable under deres forhold12. Det er mulig at reanalysering deres system av teknikken beskrevet her kunne avsløre nitrosamide formasjon. Uansett deres dannelse indikerer høyere stabilitet nitrosamides forhold til α-hydroxynitrosamines at disse forbindelsene har biologisk betydning som de bør lettere transport cellen.
Selv om denne metoden blir gjelder for de fleste nitrosamine-enzym systemer, er det noen begrensninger. Det viktigste er at metoden ikke er kvantitativ. I eksempel eksperimentet, ble dannelse anslått fra masse spectrometric peak området en positiv kontroll prøven. For en mer nøyaktig måling, kunne en isotop-fortynning metoden bruker en isotopically merket nitrosamide utvikles. En annen tilnærming ville være implementere en overlapping strategi med forbindelser som N- acetyllysine eller N- acetylcysteine, men dette var mislykket hittil i våre hender14.
En annen begrensning er tendensen til nitrosamides til hydrolyze lett9; Dermed må prøver behandles individuelt. Dette bremser arbeidsflyten hindrer prøver sendes til samarbeidspartnere for analyse. Til slutt, bør det bemerkes at selv om cytochrome P450 2A6 og mange andre er kommersielt tilgjengelig, noen krever protein uttrykk og rensing å få. For eksempel denne analysen ble brukt til cytochrome P450 2A1314, men den er bare tilgjengelig etter en streng isolasjon prosess23.
I sammendraget, har vi beskrevet en protokoll for å oppdage nitrosamides som følge av cytochrome P450-katalysert oksidasjon av nitrosaminer i vitro. Protokollen inneholder en generell syntese for en nitrosamide standard som en positiv kontroll og i vitro cytochrome P450 metabolisme analysen ved hjelp av LC-NSI+- HRMS/MS for gjenkjenning. I eksempel studien, ble NNC oppdaget på alle inkubasjon ganger spenner fra 1-10 min, men bare som en mindre metabolitt av NNN. Bruk av denne protokollen til andre nitrosaminer vil vurdere sin generalitet og potensielle rollen som nitrosamides i nitrosamine kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av grant ingen. CA-81301 fra National Cancer Institute. Vi takker Bob Carlson for redaksjonell bistand, Dr. Peter Villalta og Xun Ming massespektrometri hjelp i analytisk biokjemi delt ressurs av Masonic Cancer Center, og Dr. Adam T. Zarth og Dr. Anna K. Michel for deres verdifulle diskusjoner og innspill. Analytiske biokjemi delte ressursen er delvis støttet av National Cancer Institute Cancer Center støtte Grant CA-77598
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
References
- Rom, W. N., Markowitz, S. Environmental and Occupational Medicine. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).
- Preussmann, R., Stewart, B. W. Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).
- Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R. Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. Searle, C. E. , American Chemical Society. 491-625 (1976).
- Zhu, A. Z., et al. Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation. Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).
- Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions. J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).
- Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation. Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).
- Guttenplan, J. B. Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine. Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).
- Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens. Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).
- Chow, Y. L. ACS Symposium Series. 101, American Chemical Society. 13-37 (1979).
- von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion. J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).
- Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde. J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1. Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps. J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).
- Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines. Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).
- Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays. Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).
- Clark, A. G., Wong, S. T. A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding. Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).
- Pauli, G. F., et al. Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay. J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).
- van der Heeft, E., et al. A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules. Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).
- White, E. H. The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation. J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).
- Patten, C., et al. Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes. Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).
- Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine. Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).
- Hecht, S. S. Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines. Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).
- von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13. Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).
