Summary
Vi beskriver en letkøbt, hurtig og relativt billig metode for generation af gen-forstyrret Streptococcus mutans stammer; denne teknik kan tilpasses til generation af gen-forstyrret stammer af forskellige arter.
Abstract
Typiske metoder til udredning af funktionen af et bestemt gen indebærer sammenlignende fænotypiske analyser af wild-type belastning og en stamme, hvor gen af interesse har været forstyrret. En gen-forstyrrelser DNA konstruktion der indeholder en egnet antibiotikaresistens-markørgen er nyttige for generation af gen-forstyrret stammer i bakterier. Men konventionelle byggemetoder, der kræver gen kloning trin, involverer komplekse og tidskrævende protokoller. Her, er en relativt letkøbt, hurtig og omkostningseffektiv metode til målrettede gen forstyrrelser i Streptococcus mutans beskrevet. Metoden udnytter en 2-trins fusion Polymerasekædereaktionen (PCR) til at generere forstyrrelser konstruktion og elektroporation for genetiske transformation. Denne metode kræver ikke en enzymatisk reaktion, end PCR, og giver desuden større fleksibilitet med hensyn til udformningen af forstyrrelser konstruktion. Beskæftigelse af elektroporation letter udarbejdelsen af kompetente celler og forbedrer transformation effektivitet. Den nuværende metode kan tilpasses til generation af gen-forstyrret stammer af forskellige arter.
Introduction
Gen funktion analyse involverer typisk en fænotypiske sammenligning mellem en vildtype stamme og en stamme, hvor et bestemt gen af interesse har været forstyrret. Dette gen-forstyrrelser teknik er blevet udnyttet til gen funktion analyser i en bred vifte af taxa, fra bakterier til pattedyr. En gen-forstyrrelser konstruktion er nødvendige for generation af gen-afbrød stammen; denne deoxyribonukleinsyre (DNA) konstruktion består af antibiotikaresistens-markørgen sammenvokset til upstream og downstream flankerende regioner af target-genet, og er indarbejdet i genom via homologe rekombination. Gen-afbrød stammen kan isoleres ved hjælp af selektivt medie, der indeholder antibiotika. Den konventionelle metode anvendes til opførelse af gen-afbrød stammen kræver komplekse trin, som forstærkning af target-genet ved polymerase kæde reaktion (PCR), ligatur af genet ind i en passende plasmid, fordøjelse med begrænsning enzymer, og religation til at indsætte antibiotika-resistens markørgen. Denne proces er tidskrævende, tager flere dage til flere uger, afhængigt af succesen af hvert trin. Desuden, er udformningen af forstyrrelser konstruktioner afhængig af begrænsning enzym websteder af target-genet. For at løse disse problemer, er blevet rapporteret PCR-baseret DNA splejsning metoder1,2 for udformningen af gen-forstyrret mutanter af Dictyostelium discoideum3 og Synechocystis sp. PCC68034 . I den nuværende undersøgelse, blev udviklet en metode til at generere en gen-forstyrret streptokok stamme i en relativt hurtig, letkøbt og billig måde, udnytter en modificeret PCR-baseret metode (udpeget 2-trins fusion PCR) for opførelsen af forstyrrelsen konstruere og elektroporation for genetiske transformation.
2-trins fusion PCR kræver genomisk DNA, antibiotikaresistens-markørgen som PCR skabelon og fire par korrekt designet oligonukleotid primere. I det første trin (1st PCR), en 1-kb opstrøms flankerende region af target-genet, en 1-kb downstream flankerende region af målet forstærkes-genet, og antibiotika-resistens markørgen ved PCR. 5' regionerne i både de omvendte primer og den fremad primer, til forstærkning af upstream og downstream omfatter flankerende regioner, henholdsvis, 15 baser supplement til enderne af markørgen. 5' regionerne i både forward og reverse primere for markør gen amplifikation ligeledes omfatte 15 baser supplement til den nederste ende af upstream flankerende regionen af target-genet og den øverste ende af den downstream flankerende region af genet mål henholdsvis. Derfor, de tre forstærket fragmenter indeholder overlappende 30-basepar områder på webstedet fusion. I det andet trin (2nd PCR) udføres PCR med indlejrede PCR primere ved hjælp af de tre fragmenter forstærkes af de 1st PCR som skabeloner. De supplerende regioner af skabelonerne er desuden forbundet med hinanden via den 2nd PCR. Endelig, konstruere for homologe rekombination er introduceret til vildtype stamme af elektroporation. Vellykket gen forstyrrelser kan bekræftes ved PCR ved hjælp af specifikke primere. Selv om afbrydelse konstruktionen forstærkes ved hjælp af high-fidelity DNA polymerase, er yderligere enzymatiske reaktioner, såsom DNA ligatur eller DNA fordøjelsen, ikke nødvendige for at generere konstruktionen. Derudover kan en slettede eller konserverede region på genomet vælges fleksibelt efter primer design.
I den nuværende arbejde, blev sletning af den hele kodende region af gtfC -genet, som koder glucosyltransferase i Streptococcus mutans, udført for at påvise hurtig og nem gen forstyrrelser metode i en streptokok arter. Derudover en gtfB-forstyrret stamme blev genereret på samme måde. Glucosyltransferases kodet af både gtfC og gtfB bidrage til kariogene dental biofilm udvikling5,6. Wild-type biofilm-dannende evner stamme (S. mutans WT), gtfC-forstyrret stamme (S. mutans ΔgtfC) og gtfB-forstyrret stamme (S. mutans ΔgtfB) blev evalueret for sammenlignende fænotypiske analyser. Denne protokol udvider anvendelsen af en to-trins metode til gen afbrydelse af en yderligere arter og kan ændres til undersøgelser af genfunktioner i en bredere vifte af taxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer Design
- forberede 2-trins fusion PCR og verifikation af genet forstyrrelser primere.
Bemærk: Tabel 1 viser de primer sekvenser bruges i denne protokol. figur 1 viser et skematisk illustration af 2-trins fusion PCR-metoden bruges til at generere S. mutans Δ gtfC.- Design primere for udskiftning af målområde i genom med spectinomycin-resistens gen (spc r) 7. Denne protokol erstatter den hele kodende region af gtfC-genet med spc r.
- Omfatter 15 baser supplement til de øvre og nedre ender af spc r på 5 ' regioner op-reverse og nede-forward primere, henholdsvis. Ligeledes omfatte 15 baser supplement til den nederste ende af gtfC opstrøms flankerende regioner og den øvre ende af gtfC downstream flankerende regioner på 5 ' regioner af spc Rasmussen-frem og spc Rasmussen -vende primere, henholdsvis ( figur 1A).
Bemærk: Sekvenser af up-reverse, nede-forward, spc Rasmussen - frem, og spc Rasmussen - reverse primere bestemmes automatisk afhængigt af stedet for indarbejdelse af forstyrrelser konstruere. - Design op-forward og ned-reverse primere til at omfatte > 1-kb opstrøms og nedstrøms flankerende regioner af genet gtfC henholdsvis. Angiv den smeltende temperatur (T m) op-forward og ned-reverse primere i henhold til smeltepunktet af up-reverse og nede-forward primere, henholdsvis ( figur 1A).
Bemærk: Henvise til den følgende formel til at bestemme T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, hvor * N repræsenterer antallet af primer nukleotider med det angivne identitet (A, T, C eller G). - Design indlejrede primere (N_up-forward og N_up-omvendt) for de 2 nd PCR ( figur 1B).
Bemærk: Selv om den yderste primer par (op-forward og ned-reverse) kan anvendes som primere for de 2 nd PCR, indlejrede primere (N_up-forward og N_up-omvendt) blev udviklet i denne protokol. Indlejrede primere er ofte påkrævet for de 2 nd PCR, som nærmere beskrevet i Repræsentative resultater. - Design primere specifikke for spc Rasmussen. Primere bruges til kolonien PCR til at screene for gtfC forstyrrelser.
- Design primere til verifikation af gtfC forstyrrelser.
Bemærk: PCR produkter forstærkes ved hjælp af disse primere straddle grænsen mellem gtfC eller produktresuméet Rasmussen og opstrøms eller nedstrøms flankerende regioner i gtfC. Primer sæt ' gtfC op-forward og gtfC op-reverse ' og ' gtfC nede-forward og gtfC ned-reverse ' er specifikke for gtfC, og ' gtfC op-forward og spc r 2 -omvendt ' og ' spc r 2-forward og gtfC ned-reverse ' er specifikke for spc r.
2. Genomisk DNA-ekstraktion fra S. mutans
- Streak lager S. mutan s UA159 på en hjerne hjerte infusion (BHI) agar plade. Inkuber plade natten over ved 37 ° C under anaerobe betingelser.
- Afhente en enkelt koloni ved hjælp af en steriliseret tandstikker og podes det til 5 mL af BHI bouillon. Inkuber S. mutan s kultur natten over ved 37 ° C under anaerobe betingelser.
- Bakteriel cellekultur der centrifugeres i 15 min. ved 2.000 × g. celle resuspenderes i 5 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Der centrifugeres i 15 min. ved 2.000 × g. celle resuspenderes i 200 µL af PBS.
- Uddrag genomisk DNA fra suspensionen ved hjælp af en perle-slå-base genomisk DNA udvinding kit ifølge vejledningen fra fabrikanten.
- Overførsel suspension til en 2.0-mL prøve rør indeholdende glasperler (medfølger i sættet). Tilføje 750 µL af lysis løsning (medfølger i sættet) til cellesuspension.
- Cap stramt og placere rør symmetrisk i tube indehaveren af perle-slå forstyrrelser apparater. Proces ved den maksimale hastighed i 5 min. Centrifuge perle-slagne prøver i 1 minut ved 10.000 × g. overføre supernatanten til spin filteret (medfølger i sættet) i en 2,0 mL indsamling rør og centrifugeres i 1 min på 7.000 × g .
- Tilføje 1.200 µL af DNA binding buffer (medfølger i sættet) til filtratet. Overføre 800 µL af blandingen til kolonnen spin (medfølger i sættet) til en 2.0-mL indsamling rør og centrifugeres i 1 minut ved 10.000 × g.
- Kassere flow-through, tilføjes kolonnen spin at vaske matrixen kolonnen og centrifugeres i 1 minut ved 10.000 × g. udsmid gennemstrømnings-, tilføje 500 µL af wash buffer (medfølger i sættet) at spin 200 µL af pre vask buffer (medfølger i sættet) kolonne for at vaske kolonnen matrix, og der centrifugeres i 1 minut ved 10.000 × g.
- Placere kolonnen spin i en ny 1,5 mL microcentrifuge rør og tilsæt 100 µL af eluering buffer (medfølger i sættet) til matrixen kolonne.
- Centrifugeres i 30 s på 10.000 × g at eluere genomisk DNA. Skønne DNA koncentration og renhed af måling af absorbans ved 260 nm og 280 nmusing et spektrofotometer og bekræfte, at A 260 /A 280-forholdet er større end 1,8.
3. PCR-amplifikation
- udføre 1 st PCR ved hjælp af S. mutan s WT genom og syntetiske spc r gen som PCR skabeloner (Se tabel 1). Forstærke den upstream flankerende region af gtfC-genet, downstream flankerende regionen gtfC-genet, og spc r gen ved hjælp af de tre sæt primere beskrevet ovenfor ( figur 1A), som pr. Tabel 2 og tabel 3.
Bemærk: PCR primere, reagenser og forstærkning cyklusser er sammenfattet i tabel 1, tabel 2 og tabel 3, hhv. - Fractionate hver PCR produkt på en 1%-agarosegel og punktafgifter de tilsvarende bands ved hjælp af en gel band cutter.
- Rense hver amplificerede DNA produkt fra geler ved hjælp af en spin kolonne- og silica membran-baseret gel udvinding kit.
- Overførsel gel skiver til en ren microcentrifuge tube og blandes med 500 µL af bindende buffer (medfølger i sættet). Inkuber blanding ved 55 ° C i 15 min, indtil gel skiver er fuldstændig opløst.
- Placere kolonnen spin (medfølger i sættet) i en collection tube (medfølger i sættet), indlæse prøve på kolonnen spin og centrifugeres i 30 s på 11.000 × g. Kassér gennemstrømnings-, tilføje Wash Buffer (medfølger i sættet) 600 µL til kolonnen Spin at vaske silica membran, og der centrifugeres i 30 s på 11.000 × g.
- Kassere gennemstrømning og centrifugeres i 2 min på 11.000 × g tørre silica membran.
- Placere kolonnen spin i en ny 1,5 mL microcentrifuge rør, tilsæt 50 µL eluering Buffer (medfølger i sættet), og der inkuberes ved stuetemperatur i 2 min.
- Centrifugeres i 2 min på 11.000 × g at eluere amplificeret DNA. Skønne DNA koncentration og renhed af måling af absorbans ved 260 nm og 280 nmusing et spektrofotometer og bekræfte, at A 260 /A 280-forholdet er større end 1,8.
- Udføre 2 nd PCR 2-trins fusion PCR ved hjælp af de tre ca equimolar fragmenter som PCR skabeloner, som tabel 2 < /stRong > og tabel 3.
Bemærk: Disse fragmenter blev forstærket og splejset ved hjælp af de indlejrede primere ' N_up-forward og N_down-reverse ' eller de yderste primere ' op-forward og ned-reverse ' ( figur 1B). PCR-primere, reagenser og forstærkning cyklusser er sammenfattet i tabel 1, tabel 2 og tabel 3, hhv. - Indlæses en tiendedel af PCR reaktionsblanding (5 µL) på en 0,8%-agarosegel og sammenligne størrelsen forstærket bandet med den forventede band størrelse til at bekræfte generation af den passende amplikon ( figur 1 c).
- Koncentrere de resterende endelige PCR produkt ved ethanol fældning uden rensning.
- Tilføje 55 µL af ultra rent vand til de resterende PCR-blandingen til at justere det samlede volumen til 100 µL.Add en tiendedel bind 3 M natriumacetat (10 µL), pH 5,2, efterfulgt af 2,5 mængder af 100% ethanol (250 µL). Bland og fryse i 30 min. ved-80 ° C.
- Centrifugeres i 20 min. på 15.000 × g ved 4 ° C, check for træpiller i bunden af røret, og supernatanten. Vaske pellet med 1 mL af 70% ethanol, centrifugeres i 5 min på 15.000 × g ved 4 ° C, og supernatanten. Lufttørre pellet i ca 30 min og opløses med 10 µL af ultra rent vand.
4. Kompetente celle forberedelse og celle Transformation
- Streak lager S. mutan s UA159 på en BHI agar plade. Inkuber plade natten over ved 37 ° C under anaerobe betingelser.
- Afhente en enkelt koloni ved hjælp af en steriliseret tandstikker og podes det til 5 mL af BHI bouillon. Inkuber S. mutan s kultur natten over ved 37 ° C under anaerobe betingelser.
- Overføres 2 mL S. mutan s kultur til 50 mL af BHI bouillon og Inkuber i 6-8 timer ved 37 ° C til en optisk tæthed på 600 nm (OD 600) af 0,2-0,4 under anaerobe betingelser.
- Centrifugeres celler for 15 min på 2.000 × g ved 4 ° C, supernatanten fjernes, og cellerne vaskes to gange med 40 mL iskoldt vand efterfulgt af 40 mL 10% glycerol.
Bemærk: Resterende stoffer påvirker efterfølgende elektroporation. - Opsug supernatanten omhyggeligt med Pasteur pipette som overholdelse af celle toerstoffet i 10% glycerol er reduceret. Resuspend celler i 1 mL frisk 10% glycerol, dispensere 50 µL af suspension i hver 1,5 mL microcentrifuge rør, og opbevares ved-80 ° C indtil umiddelbart før brugen.
- Mix 50 µL alikvot af iskold kompetente celler med 5 µL af forstyrrelsen konstruktion beskrevet ovenfor i afsnit 3. Tilsæt blandingen til elektroporation kuvetter (med 0,2 cm afstand mellem elektroderne). Anvender tilstanden Staphylococcus aureus (1,8 kV, 600 Ω, 10 µF, 1 puls) af elektroporation apparater til electroporate.
- Suspendere celler i 500 µL af BHI bouillon umiddelbart efter elektroporation og tilsæt 50 µL af suspensionen spectinomycin-holdige BHI-agar plader.
Bemærk: Ekstra inkubation tid efter elektroporation ikke er påkrævet. Men inkubation i 1-2 h efter elektroporation kan forbedre transformation effektivitet. - Ruger pladen for 2-6 dage ved 37 ° C under anaerobe betingelser.
Bemærk: S. mutans Δ gtfB er konstrueret som beskrevet ovenfor. Den hele kodende region af gtfB-genet er erstattet med erythromycin resistens gen 8 i S. mutans Δ gtfB. Hver S. mutans stamme er kulturperler i BHI bouillon ved 37 ° C under anaerobe betingelser.
5. Verifikation af genet forstyrrelser og opbevaring
- vælge tilfældige kolonier og podes dem til PCR-blandingen for at udføre koloni PCR pr. tabel 2 og tabel 3. PCR-primere, reagenser og forstærkning cyklusser er sammenfattet i tabel 1, tabel 2 og tabel 3, hhv.
- Indlæses PCR reaktionsblandingen på en 1% agarosegel at bekræfte spc Rasmussen-specifikke DNA band.
- Pluk positive kolonien ved hjælp af en steriliseret tandstikker og subkultur celler i 10 mL spectinomycin-holdige BHI bouillon i 2 dage ved 37 ° C under anaerobe betingelser.
- Kontrollere, generation af S. mutans Δ gtfC.
- Opdele cellesuspension ligeligt. Uddrag genomisk DNA fra de celler, der er beskrevet ovenfor (trin 2.3. til 2.5.5.). Udføre PCR med genomisk DNA som en PCR skabelon, bruger primere for verifikation af gtfC forstyrrelser (tabel 1) pr. tabel 2 og tabel 3.
Bemærk: PCR-primere, reagenser og forstærkning cyklusser er sammenfattet i tabel 1, tabel 2 og tabel 3, hhv. - Indlæse PCR-blandingen på en 2%-agarosegel og sammenligne størrelsen forstærket bandet med den forventede band størrelse til at bekræfte generation af den passende amplikon .
- Centrifugeres den resterende cellesuspension til 15 min på 2.000 × g ved 4 ° C. celle resuspenderes i 5 mL PBS.
- Der centrifugeres i 15 min. ved 2.000 × g på 4 ° C. Resuspend på celle pellet i 1,5 mL BHI bouillon der indeholder 25% glycerol og gemme i-80 ru -20 ° C.
- Opdele cellesuspension ligeligt. Uddrag genomisk DNA fra de celler, der er beskrevet ovenfor (trin 2.3. til 2.5.5.). Udføre PCR med genomisk DNA som en PCR skabelon, bruger primere for verifikation af gtfC forstyrrelser (tabel 1) pr. tabel 2 og tabel 3.
6. Fænotypisk analyse
- stribe hver S. mutan s stamme på en BHI agar plade. Inkuber plade natten over ved 37 ° C under anaerobe betingelser.
- Afhente en enkelt koloni ved hjælp af en steriliseret tandstikker og podes det til 2 mL af BHI bouillon med eller uden en passende antibiotikaet. Der inkuberes natten over ved 37 ° C under anaerobe betingelser.
- Podes 20 µL af overnight kultur suspension til 2 mL af BHI bouillon der indeholder 1% eller 5% saccharose uden antibiotika i et reagensglas, kultur celler med reagensglas i et skråstilling natten over ved 37 ° C under anaerobe betingelser.
- Vortex glasset reagensglas for 10 s og dekanteres kultur suspensioner. Vask reagensglas tre gange med destilleret vand. Der tilsættes 1 mL 0,25% Coomassie brilliant blue (CBB) til at plette biofilm på rørvæggen, og derefter inkuberes i 1 min.
- Dekanteres Farvningsopløsningen, vaske reagensglas tre gange med destilleret vand, og tør reagensglassene.
- Evaluere både farve tæthed og udvidelse af CBB farves-biofilm visuelt til at bestemme den biofilm-dannende evne i en fænotypiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser, at størrelsen af hvert produkt fra den 1st PCR, som observeres på 1%-agarosegel, var i god aftale med den forventede størrelse af ca. 1 kb. Figur 3 viser den gel elektroforese analyse af produkter fra de 2nd PCR. Figur 4 viser S. mutans kolonier omdannet med forstyrrelser konstruktion, og en gel elektroforese analyse af kolonien PCR produkter. Amplikoner fra alle kolonier var af den forventede størrelse. Figur 5 viser de primer-bindingssteder for verifikation af gtfC forstyrrelser og gel elektroforese af PCR-produkter. PCR produkter fremstillet ved forstærkning ved hjælp af gtfC -specifikke primer sæt blev bekræftet i S. mutans WT, men ikke i S. mutans ΔgtfC, hvorimod PCR produkter fremstillet ved hjælp af spcRasmussen-specifikke primer sæt blev bekræftet i S. mutans ΔgtfC, men ikke i S. mutans WT. figur 6 viser de saccharose-afledte biofilm-dannende evne til hver S. mutans stamme. En vedhængende biofilm blev dannet af S. mutans WT i overværelse af saccharose; vedhængende biofilm-dannende evne til S. mutans ΔgtfB var lavere end at af S. mutans WT. S. mutans ΔgtfC udstillet meget lav vedhængende Biofilmdannelse i overværelse af saccharose.
Finde 1:Strategy for 2-trins fusion PCR. En skematisk illustration af S. mutans ΔgtfC konstruktion er vist. Gen længder er ikke til skala. (A) opstrøms og nedstrøms flankerende regioner gtfC og spcr blev loci forstærket af PCR. Primer-bindingssteder i skabelonen er angivet med identiske mønstre. (B) andet trin af PCR blev udført ved hjælp af (som skabeloner) de 3 fragmenter, der blev forstærket i den første PCR trin med indlejrede primere. (C) afbrydelse konstruktion blev opnået for homologe rekombination i de bakterielle stammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative gelelektroforese af produkter fra den 1st PCR. Amplikoner gtfC opstrøms flankerende regionen og downstream flankerende regionen i gtfC og er spcRasmussen er vist. M: Molekylær markør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant gelelektroforese af produkter fra de 2nd PCR. Produkter forstærket med de indlejrede primere og de yderste primere er vist. Solid pilen angiver den forudsagte størrelsen af forstyrrelser konstruktion. M: Molekylær markør.
Figur 4: Screening for gtfC forstyrrelser af kolonien PCR (A). S. mutans kolonier på den spectinomycin-holdige BHI-agar plade; hver cirkel antallet angiver koloni ID. (B) repræsentative gelelektroforese af kolonien PCR produkter; hver cirkel lane nummer angiver den tilsvarende koloni ID i figur 4A. M: Molekylær markør, WT: Wild-type genomisk DNA bruges som skabelon. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kontrol af gtfC forstyrrelser ved PCR. (A) Primer-bindingssteder; genet længde er ikke til skala. PCR blev udført ved hjælp af S. mutans genomisk DNA som en skabelon. Primer sæt: gtfC op-forward og gtfC op-reverse (specifik for gtfC); gtfC nede-forward og gtfC ned-reverse (specifik for gtfC); gtfC op-forward og spcr2-omvendt (specifik for spcr); spcr2-forward og gtfC ned-reverse (specifik for spcRasmussen). (B) repræsentative gelelektroforese af PCR-produkter; hver cirkel lane nummer angiver den tilsvarende primer angivet i figur 5A. En enkelt elektroforese billede er opdelt for at mærke markør bands. M: Molekylær markør (100-basepar stigen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: fænotypiske analyser baseret på udvikling af biofilm. Saccharose-afledte biofilm dannet af hver S. mutans stamme var plettet med Coomassie strålende blå. WT: S. mutans WT, ΔgtfB: S. mutans ΔgtfB, ΔgtfC: S. mutans ΔgtfC. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Primer par | Rækkefølge (5' til 3') | Forventede band størrelse (bp) | |
| 2-trins PCR for gtfC forstyrrelser | |||
| 1. PCR | |||
| op-forward up-reverse |
AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA |
1,036 | |
| SPCRasmussen-frem SPCRasmussen-omvendt |
ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT |
1,188 | |
| nede-forward ned-reverse |
AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
1,059 | |
| 2. PCR | |||
| N_up-frem N_down-reverse |
TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3,132 | |
| Kontrol af gtfC forstyrrelser | |||
| Koloni PCR for screening | |||
| S_spcRasmussen-frem S_spcRasmussen-omvendt |
GGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAG | 535 | |
| Afsluttende verifikation | |||
| gtfC op-forward gtfC up-reverse |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG |
498 | |
| gtfC nede-forward gtfC ned-reverse |
GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
557 | |
| gtfC op-forward spcr2-omvendt |
Beskrevet ovenfor CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
641 | |
| spcr2-frem gtfC ned-reverse |
GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG Beskrevet ovenfor |
623 | |
| Reagens | Koncentrationen af stamopløsninger | Volumen | Endelig koncentration |
| DNA polymerase premix | 2 × | 25 ΜL | 1 × |
| Fremad primer | 5 ΜM | 2 ΜL | 0,2 ΜM |
| Omvendt primer | 5 ΜM | 2 ΜL | 0,2 ΜM |
| DNA-Template | Variabel | Variabel | Variable * ** *** |
| Ionbyttet vand | - | op til 50 μL | - |
Tabel 2: PCR reagenser. * For 1st skridt PCR; 100 ng. ** For 2nd PCR; hver 30-50 ng af 1st skridt PCR-amplikon. For kolonien PCR; direkte tilføjelse af bakterieceller til reaktionsblandingen.
| Cyklus trin | Temperatur | Tid | Antal cyklusser |
| Indledende denaturering | 98 ° C | 2 min | 1 |
| Denaturering Udglødning Udvidelse |
98 ° C 55 ° C 72 ° C |
10 s 5 s Amplikon afhængige (1 min/1 kbp) |
35 |
| Endelige udvidelse | 72 ° C | Amplikon afhængige (1 min/1 kbp) |
1 |
Tabel 3: PCR forstærkning cyklusser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, skal primere for 1st PCR være konstrueret til at forstærke ca 1 kb opstrøms og nedstrøms flankerende regioner i målområde i genomet. Sådanne lange flankerende sekvenser er nødvendige for at forbedre effektiviteten af homologe rekombination.
Sekvenser af primere (op-reverse, nede-forward, spcRasmussen-fremad og spcRasmussen-omvendt) i denne protokol blev automatisk bestemmes baseret på webstedet af indarbejdelse af forstyrrelser konstruktion. Hver primer omfatter 15 baser supplement til slutningen af skabelonen 2nd PCR ved 5' region. En længere bindingssted muliggør mere effektiv produktion af forstyrrelser konstruktion. Optagelse af mindst 10 supplerende baser på 5' region af hver primer anbefales9.
Indlejrede primere (N_up-forward og N_up-omvendt) blev brugt til de 2nd PCR, snarere end de yderste primere (op-forward og ned-reverse). Anvendelse af de yderste primere til de 2nd PCR er gavnligt i nogle tilfælde; vellykket forstærkning af forstyrrelser konstruere for S. mutans ΔgtfB blev opnået ved hjælp af de yderste primere (data ikke vist). Men brugen af de yderste primere til trinnet 2nd PCR ofte resulterer i utilstrækkelig PCR-amplifikation, som vist i figur 3. Brug af indlejrede primere blev fundet til at løse dette problem9. Når forstyrrelse konstruktion ikke er væsentligt forstærket selv ved hjælp af de indlejrede primere, dog kan redesign af primere anvendes i 1. PCR være påkrævet.
Koloni PCR muliggør praktisk screening af gen-afbrød stammen. Primere af kendte sekvenser kan anvendes for generation af gen-forstyrret stammen ved hjælp af spcRasmussen. Elektroporation blev brugt til indførelsen af forstyrrelser konstruktioner i S. mutans WT, som transformation effektivitet opnås ved hjælp af elektroporation er generelt højere end der er aktiveret ved andre procedurer. Transformation med hest serum eller hest serum med kompetence-stimulerende peptider, er bredt accepteret i Streptococcus10,11,12. Selvom et elektroporation apparat påkrævet, er procedurerne, såsom kompetente celle forberedelse, meget enklere end i alternative metoder10,11. Derudover anbefales elektroporation fra dyrevelfærd.
Denne protokol gælder for flere gen forstyrrelser, afhængigt af de antal ofantibiotic markører. At skabe både gtfC- og gtfB-forstyrret S. mutans stammer, for eksempel, DNA konstruktionen for gtfC-forstyrrelser bygget af 2-trins PCR kan omdannes til S. mutans ΔgtfB. Da gtfC og gtfB er tilstødende i dette tilfælde, S. mutans ΔgtfC og S. mutans ΔgtfB genomer skal bruges som skabeloner til 2-trins PCR til at opretholde de homologe sekvenser for homolog rekombination. Faktisk dobbelt gen-forstyrret S. mutans stamme blev tidligere fremstillet af denne protokol9.
Denne protokol for gen forstyrrelser i S. mutans kan tilpasses til generation af gen-forstyrret stammer af forskellige arter. Denne protokol kræver ikke gen kloning trin involveret i konventionelle protokoller. PCR er desuden den eneste nødvendige enzymatisk reaktion; plasmid vektorer, Escherichia coli, ligase og restriktionsenzymer er derfor ikke nødvendigt. Desuden, denne protokol tilbyder større fleksibilitet med hensyn til design af forstyrrelser konstruktion, som konstruktion design er uafhængig af begrænsning enzym websteder af target-genet. Forskere kan bestemme regioner, der er slettet eller bevaret i genom til design den omvendte primer til forstærkning af upstream flankerende regionerne og de fremad primer til forstærkning af de downstream flankerende regioner. Disse flankerende regioner er umiddelbart opstrøms og umiddelbart neden for regionen i DNA ønskede for sletning, henholdsvis. Denne fleksibilitet kan anvendes til at reducere ydre påvirkninger, såsom polar effekter på udtryk for umiddelbare gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Japan-samfund til fremme af videnskab [Grant numre 16 K 15860 til TM og 15 K 15777 til N.H.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
Tags
Genetik spørgsmålet 128 gen forstyrrelser DNA konstruktion polymerase kædereaktion primer design antibiotikaresistens-markørgen Streptococcus mutans elektroporation homologe rekombination View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
