Vi beskriver en letkøbt, hurtig og relativt billig metode for generation af gen-forstyrret Streptococcus mutans stammer; denne teknik kan tilpasses til generation af gen-forstyrret stammer af forskellige arter.
Typiske metoder til udredning af funktionen af et bestemt gen indebærer sammenlignende fænotypiske analyser af wild-type belastning og en stamme, hvor gen af interesse har været forstyrret. En gen-forstyrrelser DNA konstruktion der indeholder en egnet antibiotikaresistens-markørgen er nyttige for generation af gen-forstyrret stammer i bakterier. Men konventionelle byggemetoder, der kræver gen kloning trin, involverer komplekse og tidskrævende protokoller. Her, er en relativt letkøbt, hurtig og omkostningseffektiv metode til målrettede gen forstyrrelser i Streptococcus mutans beskrevet. Metoden udnytter en 2-trins fusion Polymerasekædereaktionen (PCR) til at generere forstyrrelser konstruktion og elektroporation for genetiske transformation. Denne metode kræver ikke en enzymatisk reaktion, end PCR, og giver desuden større fleksibilitet med hensyn til udformningen af forstyrrelser konstruktion. Beskæftigelse af elektroporation letter udarbejdelsen af kompetente celler og forbedrer transformation effektivitet. Den nuværende metode kan tilpasses til generation af gen-forstyrret stammer af forskellige arter.
Gen funktion analyse involverer typisk en fænotypiske sammenligning mellem en vildtype stamme og en stamme, hvor et bestemt gen af interesse har været forstyrret. Dette gen-forstyrrelser teknik er blevet udnyttet til gen funktion analyser i en bred vifte af taxa, fra bakterier til pattedyr. En gen-forstyrrelser konstruktion er nødvendige for generation af gen-afbrød stammen; denne deoxyribonukleinsyre (DNA) konstruktion består af antibiotikaresistens-markørgen sammenvokset til upstream og downstream flankerende regioner af target-genet, og er indarbejdet i genom via homologe rekombination. Gen-afbrød stammen kan isoleres ved hjælp af selektivt medie, der indeholder antibiotika. Den konventionelle metode anvendes til opførelse af gen-afbrød stammen kræver komplekse trin, som forstærkning af target-genet ved polymerase kæde reaktion (PCR), ligatur af genet ind i en passende plasmid, fordøjelse med begrænsning enzymer, og religation til at indsætte antibiotika-resistens markørgen. Denne proces er tidskrævende, tager flere dage til flere uger, afhængigt af succesen af hvert trin. Desuden, er udformningen af forstyrrelser konstruktioner afhængig af begrænsning enzym websteder af target-genet. For at løse disse problemer, er blevet rapporteret PCR-baseret DNA splejsning metoder1,2 for udformningen af gen-forstyrret mutanter af Dictyostelium discoideum3 og Synechocystis sp. PCC68034 . I den nuværende undersøgelse, blev udviklet en metode til at generere en gen-forstyrret streptokok stamme i en relativt hurtig, letkøbt og billig måde, udnytter en modificeret PCR-baseret metode (udpeget 2-trins fusion PCR) for opførelsen af forstyrrelsen konstruere og elektroporation for genetiske transformation.
2-trins fusion PCR kræver genomisk DNA, antibiotikaresistens-markørgen som PCR skabelon og fire par korrekt designet oligonukleotid primere. I det første trin (1st PCR), en 1-kb opstrøms flankerende region af target-genet, en 1-kb downstream flankerende region af målet forstærkes-genet, og antibiotika-resistens markørgen ved PCR. 5′ regionerne i både de omvendte primer og den fremad primer, til forstærkning af upstream og downstream omfatter flankerende regioner, henholdsvis, 15 baser supplement til enderne af markørgen. 5′ regionerne i både forward og reverse primere for markør gen amplifikation ligeledes omfatte 15 baser supplement til den nederste ende af upstream flankerende regionen af target-genet og den øverste ende af den downstream flankerende region af genet mål henholdsvis. Derfor, de tre forstærket fragmenter indeholder overlappende 30-basepar områder på webstedet fusion. I det andet trin (2nd PCR) udføres PCR med indlejrede PCR primere ved hjælp af de tre fragmenter forstærkes af de 1st PCR som skabeloner. De supplerende regioner af skabelonerne er desuden forbundet med hinanden via den 2nd PCR. Endelig, konstruere for homologe rekombination er introduceret til vildtype stamme af elektroporation. Vellykket gen forstyrrelser kan bekræftes ved PCR ved hjælp af specifikke primere. Selv om afbrydelse konstruktionen forstærkes ved hjælp af high-fidelity DNA polymerase, er yderligere enzymatiske reaktioner, såsom DNA ligatur eller DNA fordøjelsen, ikke nødvendige for at generere konstruktionen. Derudover kan en slettede eller konserverede region på genomet vælges fleksibelt efter primer design.
I den nuværende arbejde, blev sletning af den hele kodende region af gtfC -genet, som koder glucosyltransferase i Streptococcus mutans, udført for at påvise hurtig og nem gen forstyrrelser metode i en streptokok arter. Derudover en gtfB-forstyrret stamme blev genereret på samme måde. Glucosyltransferases kodet af både gtfC og gtfB bidrage til kariogene dental biofilm udvikling5,6. Wild-type biofilm-dannende evner stamme (S. mutans WT), gtfC-forstyrret stamme (S. mutans ΔgtfC) og gtfB-forstyrret stamme (S. mutans ΔgtfB) blev evalueret for sammenlignende fænotypiske analyser. Denne protokol udvider anvendelsen af en to-trins metode til gen afbrydelse af en yderligere arter og kan ændres til undersøgelser af genfunktioner i en bredere vifte af taxa.
I denne protokol, skal primere for 1st PCR være konstrueret til at forstærke ca 1 kb opstrøms og nedstrøms flankerende regioner i målområde i genomet. Sådanne lange flankerende sekvenser er nødvendige for at forbedre effektiviteten af homologe rekombination.
Sekvenser af primere (op-reverse, nede-forward, spcRasmussen-fremad og spcRasmussen-omvendt) i denne protokol blev automatisk bestemmes baseret på webstedet af indarbejdelse af fo…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Japan-samfund til fremme af videnskab [Grant numre 16 K 15860 til TM og 15 K 15777 til N.H.].
Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |