Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación

Published: October 23, 2017 doi: 10.3791/56319
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Endowed Department of International Oral Health Science (affiliated with Department of Translational Research), Tsurumi University School of Dental Medicine, 3Cariology and Operative Dentistry, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Summary

Se describe un método fácil, rápido y relativamente barato para la generación de gene-disrupted Streptococcus mutans cepas; Esta técnica puede ser adaptada para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies.

Abstract

Métodos típicos para la aclaración de la función de un gen en particular implican Analisis comparativo fenotípicas de la cepa de tipo salvaje y una cepa en la que el gen de interés se ha visto alterado. Una construcción de DNA gen-interrupción que contiene un gen marcador de resistencia antibiótica adecuada es útil para la generación de cepas alterado por la gen en la bacteria. Sin embargo, métodos de construcción convencionales, que requieren medidas clonaje de genes, implican protocolos complejo y desperdiciador de tiempo. Aquí, se describe un método relativamente fácil, rápido y rentable para la interrupción de genes específicos en Streptococcus mutans . El método utiliza una fusión de paso 2 reacción en cadena polimerasa (PCR) para generar el concepto de interrupción y electroporación para transformación genética. Este método no requiere de una reacción enzimática, que no sea de la polimerización en cadena y además ofrece una mayor flexibilidad en cuanto al diseño de la construcción de la interrupción. Empleo de la electroporación facilita la preparación de células competentes y mejora la eficiencia de transformación. El presente método puede adaptarse para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies.

Introduction

Análisis de la función génica implica típicamente una comparación fenotípica entre una cepa de tipo salvaje y una cepa en la que un determinado gen de interés se ha visto alterado. Esta técnica de interrupción génica se ha utilizado para el análisis de la función del gene en una amplia gama de especies, desde bacterias hasta mamíferos. Un constructo gene-interrupción es necesario para la generación de la cepa gen interrumpido; Esta construcción de ácido desoxirribonucleico (ADN) consiste en el gen marcador de resistencia a los antibióticos sobre el upstream y downstream flanqueando las regiones del gen blanco y se incorpora en el genoma por recombinación homóloga. La cepa gen interrumpido puede ser aislada usando medios selectivos que contienen el antibiótico. El método convencional utilizado para la construcción de la cepa gen interrumpido requiere medidas complejas, como la amplificación del gen por reacción en cadena de polimerasa (PCR), la ligadura del gen en un plásmido adecuado, digestión con restricción de destino enzimas y religación para insertar el gen marcador de resistencia a antibióticos. Este proceso es lento, tomando varios días a varias semanas, dependiendo el éxito de cada paso. Además, el diseño de construcciones de la interrupción depende de los sitios de la enzima de la restricción del gene blanco. Para resolver estos problemas, se han reportado DNA Polimerización en cadena-basado que empalma métodos1,2 para el diseño de mutantes gene-disrupted de Dictyostelium discoideum3 y Synechocystis SP. PCC68034 . En el presente estudio, se desarrolló un método para generar una cepa estreptocócica gen interrumpido de una manera relativamente rápida, fácil y de bajo costo, utilizando un método modificado basado en PCR (señalado paso 2 fusión PCR) para la construcción de la interrupción construcción y electroporación para transformación genética.

La fusión de 2-step que PCR requiere de ADN genómico, el gen marcador de resistencia a los antibióticos como una plantilla PCR y cuatro pares de apropiadamente diseñado cartillas del oligonucleótido. En el primer paso (1st de PCR), una región que flanqueaba aguas arriba de 1 kb del gene del destino, una región que flanqueaba aguas abajo de 1 kb del objetivo gen y el gen marcador de resistencia a antibióticos se amplifican por PCR. Las regiones 5' de la cartilla reversa y la cartilla hacia adelante, para la amplificación de la aguas arriba y aguas abajo que flanquean regiones, respectivamente, incluyen 15 bases complementarios a los extremos del gen marcador. Las 5' regiones de avance y retroceso primers para la amplificación del gen marcador igualmente incluyen 15 bases complementarias a la parte inferior de la región que flanqueaba por aguas arriba de la gene de la blanco y el extremo superior de la región que flanqueaba corriente abajo del gen blanco, respectivamente. Por lo tanto, los tres fragmentos amplificados contienen regiones de 30-pares superpuestos en el sitio de fusión. En el segundo paso (2nd PCR), PCR se realiza con las cartillas PCR anidadas utilizando los tres fragmentos amplificados por la 1st PCR como plantillas. Las regiones complementarias de las plantillas están además vinculadas entre sí a través de la 2nd PCR. Por último, la construcción para la recombinación homóloga es introducida a la cepa de tipo salvaje por electroporación. Interrupción génica exitosa puede ser verificada por PCR usando las cartillas específicas. Aunque el concepto de interrupción se amplifica utilizando la DNA polimerasa de alta fidelidad, reacciones enzimáticas adicionales, tales como la ligadura de la DNA o digestión de DNA, no son necesarias para generar la construcción. Además, una región eliminada o conservada en el genoma puede ser elegida fexiblemente según primer diseño.

En el presente trabajo, canceladura de la región entera de la codificación del gene gtfC , que codifica la glucosiltransferasa de Streptococcus mutans, se realizó para demostrar el método de interrupción del gene rápido, fácil en una especie estreptocócica. Además, un gtfB-alteración de la tensión se generó de la misma manera. Glucosiltransferasas codificados por gtfB y gtfC contribuyen a cariogénicas biofilm dental desarrollo5,6. Las capacidades de formación de biofilm del tipo tensión (S. mutans WT), gtfC-interrumpió cepa (S. mutans ΔgtfC) y gtfB-tensión interrumpida (S. mutans ΔgtfB) se evaluaron análisis fenotípico comparativo. Este protocolo extiende la aplicación de un método de dos etapas para la interrupción del gene de una especie adicional y puede ser modificado para los estudios de función del gen en una amplia gama de taxa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. primer diseño

  1. preparar iniciadores para polimerización en cadena de la fusión de 2 pasos y verificación de la interrupción del gene.
    Nota: La tabla 1 muestra las secuencias de la cartilla utilizadas en el presente Protocolo. la figura 1 muestra una ilustración esquemática del método PCR de fusión de 2 pasos para generar Δ de S. mutans gtfC.
    1. Cartillas de diseño para el reemplazo de la región de destino en el genoma con la resistencia a la espectinomicina gene (spc r) 7. Este protocolo sustituye a la región entera de la codificación del gene gtfC spc r.
    2. Son 15 bases complementarios a los extremos superiores e inferiores de spc r en el 5 ' regiones para arriba-atrás y abajo hacia delante cartillas, respectivamente. Asimismo, incluyen 15 bases complementarias para el extremo inferior de las regiones que flanquean arriba de gtfC y el extremo superior de las regiones que flanquean aguas abajo de la gtfC en el 5 ' regiones de spc r-hacia adelante y spc r -reversa cartillas, respectivamente ( figura 1A).
      Nota: Las secuencias de arriba-atrás, abajo-adelante, spc r - adelante y spc r - invierta cartillas se determinan automáticamente dependiendo del sitio de incorporación de la construcción de interrupción.
    3. Diseño de los cebadores para arriba-hacia adelante y hacia abajo-atrás para abarcar > kb 1 aguas arriba y aguas abajo que flanquean regiones del gen gtfC, respectivamente. Ajustar la temperatura de fusión (T m) de arriba hacia delante y abajo-inversa cartillas de acuerdo con la temperatura de fusión de los primers para arriba-atrás y abajo hacia delante, respectivamente ( figura 1A).
      Nota: Refiérase a la siguiente fórmula para determinar T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, donde * N representa el número de nucleótidos de la cartilla con la identidad especificada (A, T, C o G).
    4. Diseño de iniciadores anidados (N_up adelante y N_up-reversa) para la 2 nd PCR ( figura 1B).
      Nota: Aunque el par exterior cartilla (arriba-adelante y atrás abajo) puede usarse como iniciadores para la 2 nd PCR, cebadores anidados (N_up adelante y N_up-reversa) fueron diseñados en el presente Protocolo. Cebadores anidados son con frecuencia necesarios para 2 nd PCR, como se indica en los Resultados de representante.
    5. Cartillas de diseño específicas para spc r. Las imprimaciones se utilizan para Colonia PCR para detectar interrupción gtfC.
      6. Interrupción
    6. cartillas de diseño para la verificación de gtfC.
      Nota: Los productos PCR amplificados con estos iniciadores unen la frontera entre gtfC o spc r y aguas arriba o aguas abajo que flanquean regiones de gtfC. Los conjuntos de primer ' gtfC arriba-adelante y gtfC arriba-atrás ' y ' gtfC abajo-adelante y gtfC down-marcha ' específicos para gtfC, y ' gtfC arriba-adelante y spc r 2 -inversa ' y ' spc r 2-avance y gtfC down-marcha ' específicos para spc r.

2. La extracción de ADN genómico de S. mutans

s
  1. stock de racha mutan S. UA159 sobre una placa de agar cerebro corazón infusión (BHI). Incube la placa durante la noche a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
  2. Recoger una colonia solo usando un palillo esterilizado e inocular en 5 mL de caldo BHI. Incubar la cultura durante la noche a 37 ° C en condiciones anaerobias S. mutan.
  3. Centrifugar el cultivo celular bacteriana durante 15 min a 2.000 x g. Resuspender el precipitado de células en 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  4. Centrifugar 15 min a 2.000 x g. Resuspender el precipitado de células en 200 μL de PBS.
  5. Extraer la DNA de genomic de la suspensión mediante un kit de extracción DNA genómico grano-paliza-base según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
    1. Transferencia de la suspensión a una muestra de 2,0 mL del tubo que contiene perlas de vidrio (incluidos en el kit). Añadir 750 μl de solución de lisis (incluido en el kit) a la suspensión celular.
    2. La tapa firmemente y colocar los tubos simétricamente en el soporte del tubo del aparato de interrupción del talón-golpes. Proceso a la velocidad máxima durante 5 minutos. Centrifugar el grano golpeado las muestras durante 1 min a 10.000 x g. transferir el sobrenadante al filtro de centrifugado (incluido en el kit) en un tubo de la colección de 2,0 mL y centrifugar durante 1 min a 7.000 g × .
      3. Buffer de
    3. 1.200 añadir μl de DNA obligatorio (incluido en el kit) para el filtrado. Transferir 800 μl de la mezcla a la columna de spin (incluida en el kit) a un tubo de la colección de 2.0 mL y centrifugue durante 1 min a 10.000 x g.
    4. Descartar el flujo a través, añadir 200 μL de tampón de prelavado (incluido en el kit) a la columna de vuelta para lavar la matriz de la columna y centrifugue durante 1 min a 10.000 x g. descarte el flujo a través, Añadir 500 μl de tampón de lavado (incluido en el kit) a la vuelta columna a la matriz columna de lavado y centrifugue durante 1 min a 10.000 x g.
    5. Colocar la columna de spin a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL y añadir 100 μl de tampón de elución (incluido en el kit) a la matriz columna.
    6. Centrifugar por 30 s a 10.000 x g para eluir el ADN genómico. Estimar la concentración de ADN y la pureza midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nmusing un espectrofotómetro y confirmar que el un /A 260 280 ratio es mayor que 1.8.

3. Amplificación de la polimerización en cadena

  1. realizar la 1 st polimerización en cadena usando el genoma de S. mutan s WT y el gen sintético spc r como plantillas PCR (ver cuadro 1). Amplificar la región que flanqueaba río arriba del gen gtfC, la región que flanqueaba aguas abajo del gen gtfC y el gen de spc r utilizando los tres tipos de cebadores descritas anteriormente ( figura 1A), como por La tabla 2 y tabla 3.
    Nota: Cartillas, reactivos y ciclos de amplificación de PCR se resumen en la tabla 1, tabla 2 y tabla 3, respectivamente.
  2. Fraccionar cada producto PCR en un gel de agarosa 1% y suprimir las bandas correspondientes usando un cortador de banda gel.
  3. Purificar cada producto amplificado de DNA de los geles con un spin columna y sílice gel de membrana kit de extracción de.
    1. Transferencia las rodajas de gel a una microcentrífuga limpiarla del tubo y mezclan con 500 μl de binding buffer (incluido en el kit). Incubar la mezcla a 55 ° C durante 15 minutos hasta que las rodajas de gel se disuelvan completamente.
    2. Coloque la columna de spin (incluida en el kit) en un tubo de recogida (incluido en el kit), cargar la muestra en la columna de vuelta y centrifugar por 30 s en 11.000 × g. Descartar el flujo a través, añadir 600 μl de tampón de lavado (incluido en el kit) a la columna de la vuelta a lavar la membrana de silicona y centrifugar por 30 s en 11.000 × g.
    3. Descartar el flujo y centrifugar durante 2 min a 11.000 × g secar la membrana de silicona.
    4. Coloque la columna de vuelta en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, añadir 50 μl de tampón de elución (incluido en el kit) e incubar a temperatura ambiente durante 2 min
    5. Centrifugar durante 2 min a 11.000 × g a fin de eluir el ADN amplificado. Estimar la concentración de ADN y la pureza midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nmusing un espectrofotómetro y confirmar que el un /A 260 280 ratio es mayor que 1.8.
  4. Realizar los 2 nd polimerización en cadena de la fusión de 2-step PCR utilizando los tres fragmentos aproximadamente equimolares como plantillas de PCR, según tabla 2 < /stRong > y tabla 3.
    Nota: Estos fragmentos fueron amplificados y empalmar usando los cebadores anidados ' N_up adelante y atrás N_down ' o los iniciadores exteriores ' arriba-hacia adelante y hacia abajo-atrás ' ( figura 1B). Cebadores PCR, reactivos y ciclos de amplificación se resumen en la tabla 1, tabla 2 y tabla 3, respectivamente.
  5. Una décima parte de la mezcla de reacción de PCR (5 μl) en un gel de agarosa al 0,8% de la carga y comparar el tamaño de banda amplificado con el tamaño esperado de la banda para confirmar la generación de los productos apropiados ( figura 1).
  6. Concentran el restante producto final de PCR por la precipitación del etanol sin purificación.
    1. Añadir 55 μl de ultra pura agua a la mezcla restante de la polimerización en cadena para ajustar el volumen total de 100 µL.Add un volumen de una décima parte de 3 M acetato de sodio (10 μl), pH 5.2, seguido de 2,5 volúmenes de etanol al 100% (250 μL). Mezclar y congele durante 30 min a -80 ° C.
    2. Centrifugar 20 min a 15.000 × g a 4 ° C, busque el sedimento en el fondo del tubo y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet con 1 mL de etanol al 70%, centrifugar durante 5 min a 15.000 × g a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Secar el pellet por aproximadamente 30 min y disolver con 10 μl de agua ultra pura.

4. Competente preparación celular y transformación celular

s
  1. stock de racha mutan S. UA159 sobre una placa de agar BHI. Incube la placa durante la noche a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
  2. Recoger una colonia solo usando un palillo esterilizado e inocular en 5 mL de caldo BHI. Incubar la cultura durante la noche a 37 ° C en condiciones anaerobias S. mutan.
  3. Transfiera 2 mL de la cultura S. mutan a 50 mL de caldo BHI e incubar durante 6-8 h a 37 ° C a una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de 0.2-0.4 bajo condiciones anaeróbicas.
  4. Centrifugar las células durante 15 min a 2.000 × g a 4 ° C, eliminar el sobrenadante y lavan las células dos veces con 40 mL de agua helada seguida por 40 mL de glicerol al 10%.
    Nota: Las sustancias residuales afectan posterior electroporación.
  5. Aspire el sobrenadante con una pipeta Pasteur, se reduce la adherencia del precipitado de células en glicerol al 10%. Resuspender las células en 1 mL de glicerol al 10% fresco, añada 50 μl de la suspensión en cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a-80 ° C hasta justo antes del uso.
  6. Mezcle la alícuota de 50 μl de células competentes heladas con 5 μl de la construcción de la interrupción descrita en la sección 3. Añadir la mezcla a cubetas de electroporación (con un 0,2 cm de distancia entre electrodos). Emplear el modo de Staphylococcus aureus (1,8 kV, 10 μF, Ω 600, 1 pulso) del aparato de electroporación para electroporate.
  7. Suspender las células en 500 μl de caldo BHI inmediatamente después de la electroporación y añadir 50 μl de la suspensión a las placas de BHI agar que contiene espectinomicina.
    Nota: Incubación de Extra tiempo después de la electroporación no es necesaria. Sin embargo, incubación de 1-2 h después de la electroporación puede mejorar la eficiencia de transformación.
  8. Incube la placa durante 2-6 días a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
    Nota: S. mutans Δ gtfB es construido como se describe anteriormente. La región entera de la codificación de los genes gtfB se sustituye por eritromicina resistencia gene 8 en Δ de S. mutans gtfB. Cada cepa de S. mutans se cultiva en caldo BHI a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.

5. Verificación de la interrupción del Gene y almacenamiento

  1. elegir colonias al azar e inocular en la mezcla de PCR para llevar a cabo colony PCR según la tabla 2 y tabla 3. Cebadores PCR, reactivos y ciclos de amplificación se resumen en la tabla 1, tabla 2 y tabla 3, respectivamente.
  2. Carga la mezcla de reacción de PCR en gel de agarosa al 1% para confirmar el proceso estadístico r-banda de DNA específico.
  3. Elegir la Colonia positiva utilizando un palillo esterilizado y subcultura células en 10 mL de BHI que contiene espectinomicina caldo durante 2 días a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
  4. Verificar la generación de S. mutans Δ gtfC.
    1. La suspensión de células se dividen igualmente. Extracto de ADN genómico de las células descritas anteriormente (pasos 2.3. a 2.5.5.). Realizar PCR con ADN genómico como la plantilla de la polimerización en cadena usando las cartillas para la verificación de la interrupción de la gtfC (tabla 1) según la tabla 2 y tabla 3.
      Nota: Las cartillas PCR, reactivos y ciclos de amplificación se resumen en la tabla 1, tabla 2 y tabla 3, respectivamente.
    2. La mezcla PCR en gel de agarosa al 2% de la carga y comparar el tamaño de banda amplificado con el tamaño esperado de la banda para confirmar la generación de los productos adecuados .
    3. Centrifugar la suspensión de células restantes durante 15 min a 2.000 × g a 4 ° C. Resuspender el precipitado de células en 5 mL de PBS.
    4. Centrifugar 15 min a 2.000 x g a 4 ° C. Resuspender la celda de pellets en 1,5 mL de caldo BHI con 25% de glicerol y almacenar de-80 ° Cor -20 ° C.

6. Análisis fenotípico

  1. racha de cada cepa de s de S. mutan en una placa de agar BHI. Incube la placa durante la noche a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
  2. Recoger una colonia solo usando un palillo esterilizado e inocular en 2 mL de caldo BHI con o sin un antibiótico apropiado. Incubar durante una noche a 37 ° C bajo condiciones anaeróbicas.
  3. Inocular 20 μl de la suspensión durante la noche de la cultura en 2 mL de caldo BHI con sacarosa 1% o 5% sin antibióticos en un tubo de vidrio, las células con el tubo de ensayo en posición inclinada durante la noche a 37 ° C en condiciones anaerobias de la cultura.
    4. Tubos de ensayo
  4. vortex el vidrio para 10 s y decantar suspensiones de cultura. Lavar los tubos de prueba tres veces con agua destilada. Añadir 1 mL de 0.25% Coomassie brilliant blue (CBB) a los biofilms la mancha en la pared del tubo y luego incubar 1 minuto
  5. Decantar la solución de tinción, lavar los tubos de prueba tres veces con agua destilada y secar los tubos de ensayo.
  6. Evaluar la densidad de color y extensión del CBB manchado-biofilm visualmente para determinar la capacidad de formar biofilm en un análisis fenotípico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La figura 2 muestra el tamaño de cada producto desde la 1st PCR, como se observa en el gel de agarosa al 1%, fue en buen acuerdo con el tamaño previsto de aproximadamente 1 kb. La figura 3 muestra el análisis de electroforesis de gel de los productos de la 2y PCR. La figura 4 muestra las colonias de S. mutans transformadas con la construcción de la interrupción y un análisis de electroforesis de gel de los productos PCR de Colonia. Los amplicones de todas las colonias fueron del tamaño previsto. La figura 5 muestra los sitios de unión de la cartilla para la verificación de la gtfC interrupción y gel de electroforesis de los productos PCR. Productos PCR obtenidos por amplificación utilizando la gtfC -primer específico fueron confirmados en S. mutans WT, pero no en S. mutans ΔgtfC, mientras que los productos de PCR obtienen mediante el proceso estadísticor-específicas primer set fueron confirmados en Δ de S. mutans gtfC, pero no en S. mutans pesos figura 6 muestra la capacidad de formar biofilm derivados de sacarosa de cada cepa de S. mutans . Una biopelícula adherente formado por S. mutans WT en presencia de sacarosa; la capacidad adherente de formación de biofilm de S. mutans ΔgtfB fue menor que de S. mutans pesos S. mutans ΔgtfC exhibió formación de biopelículas adherentes muy bajo en presencia de sacarosa.

Figure 1
Figura 1:Strategy para la fusión de 2-step PCR. Ilustración esquemática de S. construcción degtfC Δ mutans se muestra. La longitud del gene no es a escala. (A) aguas arriba y aguas abajo que flanquean regiones gtfC y spcr loci fueron amplificados por PCR. Los sitios de unión de la cartilla de la plantilla se indican mediante patrones idénticos. (B) el segundo paso de la PCR fue realizado usando (como plantillas) los 3 fragmentos que fueron amplificados en el primer paso de la PCR con cebadores anidados. (C) la construcción de la interrupción fue obtenida por recombinación homóloga en las cepas bacterianas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Electroforesis del gel del representante de productos de la 1st PCR. Se muestran los amplicones de la región que flanqueaba por aguas arriba de la gtfC y región que flanqueaba aguas abajo de la gtfC y spcr . M: marcador molecular de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: electroforesis del gel del representante de productos de 2nd PCR. Productos amplificaron con los iniciadores anidados y los iniciadores exteriores aparecen. La flecha sólida indica el tamaño previsto de la construcción de la interrupción. M: marcador molecular de.

Figure 4
Figura 4: Detección de interrupción de gtfC Colonia PCR (A). Colonias de S. mutans en la placa de agar BHI que contiene espectinomicina; cada círculo indica Colonia ID. (B) representante de electroforesis de los productos PCR de Colonia; cada número de carriles dentro de un círculo indica el identificador correspondiente de Colonia en la Figura 4A. M: marcador molecular de, WT: tipo de ADN genómico utilizado como plantilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Verificación de la interrupción de la gtfC por PCR. Sitios de unión a Primer (A) ; longitud de gene no está a escala. PCR fue realizada usando la DNA genomic de S. mutans como plantilla. Primer sets: gtfC arriba-adelante y gtfC arriba-atrás (específico para gtfC); gtfC abajo-adelante y gtfC abajo-atrás (específico para gtfC); gtfC arriba-adelante y spcr2-reverso (específico para spcr); spcr2-avance y gtfC abajo-atrás (específico para spcr). (B) representante de electroforesis de los productos PCR; cada número de carriles dentro de un círculo indica la cartilla correspondiente establecida en la figura 5A. Una sola imagen electroforética se divide para las bandas del marcador de la etiqueta. M: marcador molecular de (escala 100-par). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: análisis fenotípico basan en el desarrollo de biofilm. Derivados de sacarosa biofilms formados por cada cepa de S. mutans fueron teñidos con azul brillante de Coomassie. PESO: S. mutans WT, ΔgtfB: S. mutans ΔgtfB, ΔgtfC: S. mutans ΔgtfC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

CAGCCACTGCATTTCCCGCAATATCTTTTGGTATG

Tabla 1: Primers utilizan en el presente Protocolo. Las secuencias subrayadas de ' arriba-atrás y spcr-adelante ' y 'spcr-atrás y abajo hacia delante ' son complementarios. Las secuencias en negrilla-mecanografiado de ' arriba-atrás y spcr-adelante ' y'spcr- r y abajo-adelante' son complementarios.

Par de la cartilla Secuencia (5' a 3') Tamaño de banda esperado (bp)
2-step PCR para interrupción gtfC
PCR 1
arriba-adelante
para arriba-atrás		 AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC
CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA		 1.036
SPCr-adelante
SPCr-inversa		 ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT
CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT		 1.188
abajo-adelante
abajo-atrás		 AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG
TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC		 1.059
2 PCR
N_up-avance
N_down-reverso		 TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC
GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG		 3.132
Verificación de la interrupción de la gtfC
Colony PCR para la detección
S_spcr-adelante
S_spcr-inversa		 535
Verificación final
gtfC arriba-adelante
gtfC arriba-atrás		 TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG
GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG		 498
gtfC abajo-adelante
gtfC down-marcha atrás		 GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG
TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG		 557
gtfC arriba-adelante
spcr2-reverso		 Descrito anteriormente
CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC		 641
spcr2-avance
gtfC down-marcha atrás		 GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG
Descrito anteriormente		 623
Reactivo de Concentración de las soluciones madre Volumen Concentración final
Premezcla de polimerasa de la DNA 2 × 25 ΜL 1 ×
Primer avance 5 ΜM 2 ΜL 0.2 ΜM
Primer revés 5 ΜM 2 ΜL 0.2 ΜM
Plantilla de ADN Variable Variable Variable * ** ***
Agua desionizada - hasta 50 μL -

Tabla 2: Reactivos de PCR. Para el 1 paso dest PCR; 100 ng. ** Para 2nd PCR; cada 30-50 ng de 1st paso PCR amplicón. Para Colonia PCR; adición directa de las células bacterianas a la mezcla de reacción.

Paso de ciclo Temperatura Tiempo Número de ciclos de
Desnaturalización inicial 98 ° C 2 min 1
Desnaturalización
De recocido
Extensión		 98 ° C
55 ° C
72 ° C		 10 s
5 s
Dependiente de productos
(1 min/1 kbp)		 35
Extensión final 72 ° C Dependiente de productos
(1 min/1 kbp)		 1

Tabla 3: Ciclos de amplificación PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En el presente Protocolo, deberán diseñarse los iniciadores 1st PCR para amplificar 1 kb aproximadamente aguas arriba y aguas abajo flanqueando las regiones de la región de destino en el genoma. Tales secuencias largas que flanquean son necesarios para mejorar la eficacia de la recombinación homóloga.

Las secuencias de los cebadores (arriba-atrás, abajo-adelante, spcr-adelante y spcr-reversa) en el presente Protocolo se determina automáticamente basado en el sitio de la incorporación de la construcción de la interrupción. Cada cartilla incluye 15 bases complementarias al final de la plantilla PCR de 2nd en la región 5'. Un sitio obligatorio más largo permite una producción más eficiente de la construcción de la interrupción. Inclusión de al menos 10 bases complementarias en la región 5' de cada primer recomienda9.

Cebadores anidados (N_up-forward y reversa N_up) fueron utilizados para los 2nd polimerización en cadena, en lugar de los iniciadores más exteriores (arriba-adelante y hacia abajo-atrás). El uso de los iniciadores más externos para la 2nd PCR es beneficioso en algunos casos; exitosa amplificación del constructo de perturbaciones para S. mutans ΔgtfB fue alcanzada usando los cebadores más externos (datos no mostrados). Sin embargo, el uso de los iniciadores más externos parala 2da PCR con frecuencia resulta en suficiente amplificación por PCR, como se muestra en la figura 3. El uso de cebadores anidados se encontró para resolver este problema9. Cuando la construcción de la interrupción no es amplificada de sustancialmente incluso usando los cebadores anidados, sin embargo, el rediseño de los cebadores utilizados en la PCR 1 puede requerir.

Colony PCR permite conveniente proyección de la cepa gen interrumpido. Iniciadores de secuencias conocidas pueden ser aplicadas para la generación de la cepa gene-disrupted spcr. Electroporación fue utilizada para la introducción de construcciones interrupción en S. mutans WT, como la eficiencia de transformación alcanzada usando electroporación es generalmente más alta que el permitido por otros procedimientos. Transformación con suero de caballo o suero de caballo, péptidos estimulantes de la competencia, es ampliamente aceptado en el estreptococo10,11,12. Aunque se requiere de un aparato de electroporación, los procedimientos, tales como la preparación de células competentes, son mucho más simples que los métodos alternativos10,11. Además, la electroporación es recomendable desde el punto de vista del bienestar animal.

El presente Protocolo es aplicable a la interrupción de genes múltiples, dependiendo de los marcadores deantibiótico número. Generar gtfC- y gtfB-interrumpió las cepas de S. mutans , por ejemplo, el constructo de ADN para gtfC-interrupción construida por PCR 2 pasos puede transformarse en Δ de S. mutans gtfB. Porque en este caso son adyacentes la gtfC y gtfB , S. mutans ΔgtfC y S. mutans ΔgtfB genomas deben utilizarse como plantillas para PCR de 2 pasos para mantener las secuencias homólogas de homólogo recombinación. De hecho, doble alterado por la gen S. mutans cepa previamente construida por este protocolo9.

El presente Protocolo para la interrupción del gene de S. mutans puede ser adaptado para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies. Este protocolo no requiere el paso de clonación de genes implicado en los protocolos convencionales. Además, la PCR es la única reacción enzimática necesaria; por lo tanto, los vectores del plasmid, Escherichia coli, ligasa y enzimas de restricción no son necesarias. Además, el presente Protocolo ofrece una mayor flexibilidad en términos de diseño de la construcción de la interrupción, como el diseño de construcción es independiente de sitios de la enzima de la restricción del gene de la blanco. Los investigadores pueden determinar las regiones que son eliminadas o conservadas en el genoma para diseñar el primer revés para la amplificación de las regiones que flanquean por aguas arriba y el primer avance para la amplificación de las regiones que flanquean aguas abajo. Flanqueando las regiones son inmediatamente antes e inmediatamente aguas abajo de la región del DNA deseado para su borrado, respectivamente. Esta flexibilidad puede utilizarse para disminuir las influencias externas, tales como efectos polares, en la expresión de genes próximos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia [números de concesión 16 K 15860 T.M. y 15 K 15777 N.H.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptococus mutans Stock strain in the lab. Wild-type strain (Strain UA159)
Genomic DNA extraction kit Zymo Research D6005
Bead-beating disruption apparatus Taitec GM-01
Synthetic genes Eurofins Genomics Custom-ordered Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene
Thermal cycler Astec PC-708
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered 35 bases in length
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Spectrophotometer Beckman Coulter DU 800
Electroporator Bio-rad 1652100
Electroporation cuvette Bio-rad 1652086 0.2-cm gap
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture media
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics
Erythromycin Wako 057-07151 Antibiotics
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  2. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  3. Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
  4. Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
  5. Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
  9. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
  10. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
  11. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  12. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).

Tags

Genética número 128 interrupción del Gene construcción de ADN reacción en cadena de polimerasa primer diseño gen marcador de resistencia a los antibióticos Streptococcus mutans electroporación recombinación homóloga
Generación de un gen interrumpido <em>Streptococcus mutans</em> cepa sin gen clonación
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murata, T., Okada, A., Matin, K.,… More

Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning. J. Vis. Exp. (128), e56319, doi:10.3791/56319 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter