Summary
Vi beskriver en lättköpt, snabba och relativt billig metod för generering av gen-stört Streptococcus mutans stammar; Denna teknik kan anpassas för generering av gen-stört stammar av olika arter.
Abstract
Typiska metoder för förtydligandet av funktionen av en särskild gen innebär jämförande fenotypiska analyser av vildtyps-stammen och en stam där genen av intresse har störts. En gen-störningar DNA konstruktion som innehåller en lämplig markör antibiotikaresistensgen är användbart för generering av gen-stört stammar i bakterier. Dock innebära konventionella byggmetoder, som kräver gen kloning steg, komplexa och tidskrävande protokoll. Här beskrivs en relativt lättköpt, snabb och kostnadseffektiv metod för riktade gene störningar i Streptococcus mutans . Metoden utnyttjar en 2-stegs fusion polymeras-kedjereaktion (PCR) för att generera störningar konstruera och elektroporation för genetisk transformation. Denna metod kräver inte en enzymatisk reaktion, än PCR, och erbjuder dessutom större flexibilitet när det gäller utformningen av den störningar konstruktion. Anställning av elektroporation underlättar utarbetandet av behöriga celler och förbättrar omvandling effektiviteten. Denna metod kan anpassas för generering av gen-stört stammar av olika arter.
Introduction
Gen funktion analys innebär vanligtvis en fenotypisk jämförelse mellan en vildtyp stam och en stam där en särskild gen av intresse har störts. Denna gen-störningar teknik har använts för gen funktion analyser i ett brett utbud av taxa, från bakterier till däggdjur. En gen-störningar konstruktion krävs för generering av den gen-stört stammen; Denna deoxiribonukleinsyra (DNA) konstruktion består av den markörgen för antibiotikaresistens som smält till uppströms och nedströms angränsande regioner av målgenen och införlivas i genomet via homolog rekombination. Gen-stört stammen kan isoleras med selektiva medier som innehåller antibiotika. Den konventionella metoden som används för konstruktion av gen-stört stammen kräver komplexa steg, till exempel förstärkning av målgenen av polymeraskedjereaktion (PCR), ligatur av genen in i en lämplig plasmid, matsmältningen med begränsning enzymer och religation att infoga antibiotika-resistens markörgen. Denna process är tidskrävande, tar flera dagar till flera veckor, beroende på framgången för varje steg. Utformningen av störningar konstruktioner är dessutom beroende av restriktionsenzym webbplatser av målgenen. Lös dessa problem genom har PCR-baserade DNA skarvning metoder1,2 för design av gen-stört mutanter av Dictyostelium discoideum3 och Synechocystis sp. PCC68034 rapporterats. I den aktuella studien utvecklades en metod för att generera en gen-stört streptokocker stam i en relativt snabb, lättköpt och billigt sätt, använda en modifierad PCR-baserade metod (designerat 2-steg fusion PCR) för byggande av störningar konstruera och elektroporation för genetisk transformation.
2-stegs fusion PCR kräver genomiskt DNA, markörgen för antibiotikaresistens som PCR-mall och fyra par lämpligt utformad oligonukleotiden primers. I det första steget (1st PCR), en 1-kb uppströms flankera region av målgenen, en 1-kb nedströms flankera region i målet förökas, och genen de antibiotika-resistens markör med PCR. 5' regionerna både reverse primer och den framtida primern, för förstärkning av uppströms och nedströms inkluderar angränsande regioner, respektive 15 baser komplement till ändarna av genen markör. 5' regionerna av både framåt och bakåt primers för markör gen förstärkning på samma sätt inkluderar 15 baser kompletterar den nedre änden av målgenen uppströms flankera regionen och den övre änden av målgenen, nedströms flankera regionen respektive. Därför innehålla tre förstärkta fragment överlappande 30-baspar regioner på webbplatsen fusion. I det andra steget (2nd PCR) utförs PCR med nästlade PCR primers använder tre fragmenten förstärks av 1st PCR som mallar. De kompletterande regionerna av mallarna är dessutom kopplade till varandra via 2nd PCR. Slutligen introduceras konstruktionen för homolog rekombination till vildtyp stam av elektroporation. Framgångsrik gen störningar kan verifieras genom PCR använder specifika primers. Även om den störningar konstruktionen är förstärkt med HiFi-DNA-polymeras, behövs inte ytterligare enzymatiska reaktioner, såsom DNA-ligering eller DNA matsmältningen, att generera konstruktionen. Dessutom kan en borttagna eller konserverade region på genomet väljas flexibelt enligt primer design.
I den nuvarande arbetet utfördes radering av hela kodande regionen av gtfC -genen, som kodar glukosyltransferas i Streptococcus mutans, för att demonstrera metoden snabb, enkel gen störningar i släktet streptokocker. Dessutom en gtfB-störd stam genererades på samma sätt. De glucosyltransferases som kodas av både gtfC och gtfB bidra till cariogenic dental biofilm utveckling5,6. Biofilm-bilda kapaciteterna av vildtyp stam (S. mutans WT), gtfC-stört stam (S. mutans ΔgtfC) och gtfB-störd stam (S. mutans ΔgtfB) utvärderades för jämförande fenotypiska analyser. Detta protokoll utsträcks tillämpningen av en två-stegs metod för genen avbrott en ytterligare arter och kan ändras för studier av geners funktion i ett bredare utbud av taxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer Design
- förbereda primers för 2-stegs fusion PCR och verifiering av genen störningar.
Obs: Tabell 1 visar de primer sekvenser används i detta protokoll. figur 1 visar en Schematisk illustration av 2-stegs fusion PCR-metoden används för att generera S. mutans Δ gtfC.- Design primers för ersättning av målregionen i genomet med Spektinomycin-motstånd genen (spc r) 7. Detta protokoll ersätter hela kodande regionen av gtfC-genen med spc r.
- Inkluderar 15 baser komplement till spc r övre och nedre ändar på 5 ' regioner i uppåt-bakåt och nedåt-framåt primers, respektive. På samma sätt inkluderar 15 baser kompletterar den nedre änden av gtfC uppströms flankera regioner och den övre änden av gtfC nedströms flankera regioner på 5 ' regioner i spc r-fram och spc r -omvänd primers, respektive ( figur 1A).
Obs: Sekvenser av uppåt-bakåt, nedåt-framåt, spc r - framåt, och spc r - omvänd primers bestäms automatiskt beroende på platsen för införlivandet av den störningar konstruktion. - Design upp-framåt och nedåt-bakåt primers omfatta > 1-kb uppströms och nedströms angränsande regioner av genen gtfC, respektive. Ställa smälttemperatur (T m) av upp och ner-reverse primer enligt smälttemperatur av uppåt-bakåt och nedåt-framåt primers, respektive ( figur 1A).
Obs: Hänvisa till följande formel att avgöra T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, där * N representerar antalet primer nukleotider med den angivna identiteten (A, T, C eller G). - Design kapslade grundfärger (N_up-forward och N_up-reverse) för 2 nd PCR ( figur 1B).
Obs: Även om paret yttersta primer (upp-framåt och nedåt-bakåt) kan användas som grundfärg för 2 nd PCR, utformades kapslade primers (N_up-forward och N_up-reverse) i detta protokoll. Kapslade grundfärger är ofta krävs för 2 nd PCR, som beskrivs i Representativa resultat. - Design primers specifika för spc r. Primers används för kolonin PCR till skärmen för gtfC störningar.
- Design primers för verifiering av gtfC störningar.
Obs: De PCR-produkter som amplifierats använder dessa primers grenslar gränsa mellan gtfC eller spc r och uppströms eller nedströms angränsande regioner av gtfC. De primer uppsättningarna ' gtfC upp-forward och gtfC upp-reverse ' och ' gtfC nedåt-framåt och gtfC ned-vända ' är specifika för gtfC, och ' gtfC upp-forward och spc r 2 -omvänd ' och ' spc r 2-forward och gtfC ned-vända ' är specifika för spc r.
2. Genomiskt DNA-extraktion från S. mutans
- strimma lager S. mutan s UA159 på hjärnan hjärtat infusion (BHI) agar plåt. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C under anaeroba förhållanden.
- Plocka upp en enda koloni med en steriliserad tandpetare och Inokulera det i 5 mL BHI buljong. Inkubera S. mutan s kulturen över natten vid 37 ° C under anaeroba förhållanden.
- Centrifugera bakteriecell kulturen i 15 min på 2 000 × g. Återsuspendera cellpelleten i 5 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Centrifugera under 15 minuter vid 2 000 × g. Återsuspendera cellpelleten i 200 µL av PBS.
- Extraktet genomiskt DNA från fjädringen med en pärla-stryk-base genomisk DNA extraktion enligt anvisningarna från tillverkaren.
- Överföring suspensionen till ett 2.0-mL prov tub innehållande glaspärlor (ingår i satsen). Lägg 750 µL lysis lösning (ingår i satsen) till cellsuspensionen.
- Cap tätt och placera rören symmetriskt i tube innehavaren av pärla-slog störningar apparaten. Processen vid högsta hastighet i 5 min. Centrifugera den pärla-slagen prover för 1 min på 10 000 × g. överför supernatanten till spin filtret (ingår i satsen) i en 2.0 mL samling tub och Centrifugera i 1 minut vid 7 000 × g .
- Lägg till 1 200 µL av DNA-bindning buffert (ingår i satsen) till filtratet. Över 800 µL av blandningen till kolumnen spin (ingår i satsen) i en 2.0 mL samling rör och Centrifugera i 1 minut vid 10 000 × g.
- Släng genomströmmande, lägga till 200 µL före tvätta buffert (ingår i satsen) i kolumnen spin tvätta matrisen kolumn och Centrifugera i 1 minut vid 10 000 × g. Kassera genomströmmande, tillsätt 500 µL tvättlösning (ingår i satsen) i spin kolumn att tvätta matrisen kolumn, och Centrifugera i 1 minut vid 10 000 × g.
- Placera kolumnen spin till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör och tillsätt 100 µL av eluering buffert (ingår i satsen) i kolumnen matrisen.
- Centrifugera i 30 s vid 10 000 × g till eluera genomisk DNA. Uppskatta den DNA-koncentration och renhet genom att mäta absorbansen vid 260 nm och 280 nmusing en spektrofotometer och bekräfta att A 260/a 280 förhållandet är större än 1.8.
3. PCR-amplifiering
- utför 1 st PCR med S. mutan s WT genomet och syntetiska spc r genen som PCR-mallar (se tabell 1). Förstärka den gtfC genen uppströms flankera regionen, nedströms flankera regionen av genen gtfC och spc r genen med hjälp av de tre uppsättningarna av primers som beskrivs ovan ( figur 1A), som per Tabell 2 och tabell 3.
Obs: PCR primers, reagenser och förstärkning cykler sammanfattas i tabell 1, tabell 2 och tabell 3, respektive. - Fractionate varje PCR-produkt på en 1% agarosgel och punktskatt motsvarande banden använder en gel bandet cutter.
- Rena varje amplifierade DNA-produkt från de geler som använder ett spin kolumn- och kiseldioxid membranbaserad gel utvinning kit.
- Överföring gel skivor till en ren mikrocentrifug rör och blanda med 500 µL av bindande buffert (ingår i satsen). Inkubera blandningen vid 55 ° C i 15 min tills gel skivor är helt upplöst.
- Placera kolumnen spin (ingår i satsen) i en samling tube (ingår i satsen), Ladda provet på kolumnen spin och Centrifugera i 30 s vid 11.000 × g. Kassera genomströmmande, tillsätt den 600 µL tvättbuffert (ingår i satsen) i kolumnen Spin att tvätta kiseldioxid membranet och Centrifugera i 30 s vid 11.000 × g.
- Kasta genomflöde och Centrifugera under 2 minuter vid 11.000 × g torka kiseldioxid membranet.
- Placera kolumnen spin till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör, tillsätt 50 µL eluering buffert (ingår i satsen), och inkubera i rumstemperatur i 2 min.
- Centrifugera under 2 minuter vid 11 000 × g till eluera amplifierade DNA. Uppskatta den DNA-koncentration och renhet genom att mäta absorbansen vid 260 nm och 280 nmusing en spektrofotometer och bekräfta att A 260/a 280 förhållandet är större än 1.8.
- Utför 2 nd PCR av 2-stegs fusion PCR med tre ungefärligt equimolar fragment som PCR-mallar, enligt tabell 2 < /stRong > och tabell 3.
Obs: Dessa fragment var förstärkt och skarvas med kapslade primers ' N_up framåt och N_down-reverse ' eller yttersta primers ' upp-framåt och nedåt-bakåt ' ( figur 1B). PCR primers, reagenser och förstärkning cykler sammanfattas i tabell 1, tabell 2 och tabell 3, respektive. - Ladda en tiondel av PCR-reaktionsblandningen (5 µL) på en 0,8% agarosgel och jämföra den förstärkta band storleken med förväntade bandet att bekräfta generationen av lämpliga ospädd ( figur 1 c).
- Koncentrera kvarvarande slutliga PCR-produkten av etanol nederbörd utan rening.
- Lägg till 55 µL av ultrarent vatten till återstående PCR blandningen att justera den totala volymen till 100 µL.Add en en tiondel volym 3 M natriumacetat (10 µL), pH 5.2, följt av 2,5 volymer av 100% etanol (250 µL). Blanda och frysa för 30 min vid -80 ° C.
- Centrifugera under 20 minuter vid 15 000 × g vid 4 ° C, kontrollera om pelleten på undersidan av röret, och kasta bort supernatanten. Tvätta pelleten med 1 mL 70% etanol, Centrifugera under 5 minuter vid 15 000 × g vid 4 ° C, och kasta bort supernatanten. Lufttorka pelleten i ca 30 min och lös upp med 10 µL av ultrarent vatten.
4. Behöriga Cell förberedelse och celltransformation
- strimma lager S. mutan s UA159 på BHI agar plåt. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C under anaeroba förhållanden.
- Plocka upp en enda koloni med en steriliserad tandpetare och Inokulera det i 5 mL BHI buljong. Inkubera S. mutan s kulturen över natten vid 37 ° C under anaeroba förhållanden.
- Överför 2 mL av S. mutan s kultur till 50 mL BHI buljong och inkubera i 6-8 h vid 37 ° C till en optisk densitet på 600 nm (OD 600) av 0,2-0,4 under anaeroba förhållanden.
- Centrifugera cellerna för 15 min vid 2 000 × g vid 4 ° C, avlägsna supernatanten och tvätta cellerna två gånger med 40 mL iskallt vatten följt av 40 mL 10% glycerol.
Obs: Resterande ämnen påverkar efterföljande elektroporation. - Aspirera supernatanten noggrant med en Pasteur-pipett som adherencen av cellpelleten i 10% glycerol förminskas. Att resuspendera cellerna i 1 mL färsk 10% glycerol, fördela 50 µL av suspensionen i varje 1,5 mL mikrocentrifug rör och förvaras vid-80 ° C tills strax före användningen.
- Mix 50 µL alikvot av iskall behöriga celler med 5 µL av störningar-konstruktion som beskrivs ovan i avsnitt 3. Tillsätt blandningen till elektroporation kyvetter (med en 0,2 cm avstånd mellan elektroder). Anställa Staphylococcus aureus funktionsläget (1,8 kV, 600 Ω, 10 µF 1 puls) av elektroporation apparater till electroporate.
- Avbryta cellerna i 500 µL av BHI buljong omedelbart efter elektroporation och tillsätt 50 µL suspensionen i Spektinomycin-innehållande BHI-agarplattor.
Obs: Extra inkubation tid efter elektroporation inte krävs. Dock inkubation för 1-2 h efter elektroporation kan effektivisera omvandling. - Inkubera plattan i 2-6 dagar vid 37 ° C under anaeroba förhållanden.
Obs: S. mutans Δ gtfB är konstruerad enligt ovan. Hela kodande regionen av gtfB gen ersätts med erytromycin resistance gen 8 i S. mutans Δ gtfB. Varje S. mutans stam är odlade i BHI buljong vid 37 ° C under anaeroba förhållanden.
5. Verifiering av genen störningar och lagring
- plocka slumpmässiga kolonier och Inokulera dem i PCR-blandningen att utföra kolonin PCR enligt tabell 2 och tabell 3. PCR primers, reagenser och förstärkning cykler sammanfattas i tabell 1, tabell 2 och tabell 3, respektive.
- Ladda PCR-reaktionsblandningen på en 1% agarosgel att bekräfta spc r-specifika DNA band.
- Plocka positiva kolonin med en steriliserad tandpetare och subkultur celler i 10 mL spectinomycin-innehållande BHI buljong för 2 dagar vid 37 ° C under anaeroba förhållanden.
- Kontrollera generering av S. mutans Δ gtfC.
- Dela cellsuspensionen lika. Extrahera genomiskt DNA från de celler som beskrivs ovan (steg 2.3. till 2.5.5.). Utföra PCR med genomiskt DNA som PCR-mallen, med primers för verifiering av gtfC störningar (tabell 1) enligt tabell 2 och tabell 3.
Obs: Den PCR primers, reagenser och förstärkning cykler sammanfattas i tabell 1, tabell 2 och tabell 3, respektive. - Ladda PCR blandningen på en 2% agarosgel och jämföra den förstärkta band storleken med förväntade bandet att bekräfta generationen av lämpliga ospädd .
- Centrifugera återstående cellsuspensionen i 15 min på 2 000 × g vid 4 ° C. Återsuspendera cellpelleten i 5 mL PBS.
- Centrifugera under 15 minuter vid 2 000 × g vid 4 ° C. Omsuspendera cellen pellet i 1,5 mL BHI buljong som innehåller 25% glycerol och lagra i-80 ° ReK -20 ° C.
- Dela cellsuspensionen lika. Extrahera genomiskt DNA från de celler som beskrivs ovan (steg 2.3. till 2.5.5.). Utföra PCR med genomiskt DNA som PCR-mallen, med primers för verifiering av gtfC störningar (tabell 1) enligt tabell 2 och tabell 3.
6. Fenotypiska analys
- strimma varje S. mutan s stam på BHI agar plåt. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C under anaeroba förhållanden.
- Plocka upp en enda koloni med en steriliserad tandpetare och Inokulera det in 2 mL BHI buljong med eller utan ett lämpligt antibiotikum. Inkubera över natten vid 37 ° C under anaeroba förhållanden.
- Inokulera 20 µL av övernattning kultur suspensionen i 2 mL BHI buljong som innehåller 1% eller 5% sackaros utan antibiotika i ett glas provrör; odla cellerna med provröret i en lutande ställning över natten vid 37 ° C under anaeroba förhållanden.
- Vortex glas provrör för 10 s och Dekantera kultur suspensioner. Tvätta rören tre gånger med destillerat vatten. Tillsätt 1 mL av 0,25% Coomassie brilliant blue (CBB) att färga biofilmer på rörväggen, och sedan Inkubera i 1 min.
- Häll färglösningen, tvätta rören tre gånger med destillerat vatten och torka provrören.
- Utvärdera både färgdensitet och tillägget av den CBB målat-biofilmen visuellt att bestämma biofilm-bilda förmågan i en fenotypisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar att storleken på varje produkt från 1st PCR, som observerats på 1% agarosgel, var bra överens med den förväntade storleken av ungefär 1 kb. Figur 3 visar gelelektrofores analysen av produkterna av 2nd PCR. Figur 4 visar S. mutans kolonier omvandlas med den störning konstruktionen och en gelelektrofores analys av kolonin PCR-produkter. Amplikoner från alla kolonier var av den förutspådda storleken. Figur 5 visar vilka primer-bindande platser för verifiering av gtfC störningar och gel elektrofores av PCR-produkter. PCR-produkter som erhållits genom förstärkning med hjälp av den gtfC -specifik primer bekräftades i S. mutans WT, men inte i S. mutans ΔgtfC, PCR-produkter som erhållits med hjälp av spcr-specifika primer som bekräftades i S. mutans ΔgtfC, men inte i S. mutans WT figur 6 visar sackaros-derived biofilm-bilda förmåga varje S. mutans stam. En vidhäftande biofilm bildades av S. mutans WT i närvaro av sackaros; vidhäftande biofilm-bilda förmågan hos S. mutans ΔgtfB var lägre än att S. mutans ΔgtfC av S. mutans WT uppvisade mycket låg vidhäftande biofilm bildning i närvaro av sackaros.
Diagram 1:Strategy för 2-stegs fusion PCR. En Schematisk illustration av S. mutans ΔgtfC konstruktion visas. Gen längderna är inte skalenlig. (A) uppströms och nedströms angränsande regioner av gtfC och spcr var loci förökas med PCR. De primer bindningsställen i mallen anges med identiska mönster. (B) det andra PCR-steget utfördes med (som mallar) 3 fragment som var förstärkt i första PCR steg med kapslade grundfärger. (C) den störningar bygga erhölls för homolog rekombination i bakteriestammar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa gel-elektrofores av produkter från 1st PCR. Amplikoner uppströms flankera regionen av gtfC och nedströms flankera regionen gtfC och spcr visas. M: molekylär markör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa gelelektrofores produkter från 2nd PCR. Produkter förstärks med kapslade primers och yttersta primers visas. Fast pilen anger förväntade storleken på den störningar konstruktion. M: molekylär markör.
Figur 4: Screening för gtfC störningar av kolonin PCR (A),. S. mutans kolonier på Spektinomycin-innehållande BHI-agar plåten; varje inringad siffran anger koloni-ID. (B) representativa gel-elektrofores av kolonin PCR-produkter. varje inringad lane nummer anger motsvarande koloni-ID i figur 4A. M: molekylär markör, WT: Wild-type genomiskt DNA används som mall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kontroll av gtfC störningar av PCR. (A) Primer-bindande platser; genen längd inte är skalenlig. PCR utfördes med hjälp av S. mutans genomiskt DNA som mall. Primer uppsättningar: gtfC upp-forward och gtfC upp-reverse (specifik för gtfC); gtfC nedåt-framåt och gtfC down-reverse (specifik för gtfC); gtfC upp-forward och spcr2-omvänd (specifik för spcr); spcr2-forward och gtfC down-reverse (specifik för spcr). (B) representativa gel-elektrofores av PCR-produkter. varje inringad lane siffran anger motsvarande primern i figur 5A. En enda elektroforetiska bild delas etikettera banden markör. M: molekylär markör (100-baspar stege). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: fenotypisk analys baserat på biofilm utveckling. Sackaros-derived biofilmer bildas av varje S. mutans stam var fläckade Coomassie brilliant blue. WT: S. mutans WT, ΔgtfB: S. mutans ΔgtfB, ΔgtfC: S. mutans ΔgtfC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Primer par | Sekvens (5' till 3') | Förväntade bandstorlek (bp) | |
| 2-stegs PCR för gtfC störningar | |||
| 1ST PCR | |||
| uppåt-framåt upp-reverse |
AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA |
1 036 | |
| SPCr-framåt SPCr-omvänd |
ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT |
1 188 | |
| nedåt-framåt Down-reverse |
AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
1 059 | |
| 2: A PCR | |||
| N_up-forward N_down-reverse |
TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3,132 | |
| Verifiering av gtfC störningar | |||
| Kolonin PCR för screening | |||
| S_spcr-framåt S_spcr-omvänd |
|||
| gtfC upp-forward gtfC upp-reverse |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG |
498 | |
| gtfC ned-framåt gtfC ned-vända |
GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
557 | |
| gtfC upp-forward spcr2-omvänd |
Beskrivs ovan CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
641 | |
| spcr2-forward gtfC ned-vända |
GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG Beskrivs ovan |
623 | |
| Reagens | Koncentration av stamlösningar | Volym | Slutlig koncentration |
| DNA-polymeras premix | 2 × | 25 ΜL | 1 × |
| Forward primer | 5 ΜM | 2 ΜL | 0,2 ΜM |
| Reverse primer | 5 ΜM | 2 ΜL | 0,2 ΜM |
| Templat-DNA | Variabel | Variabel | Variabla * ** *** |
| Avjoniserat vatten | - | upp till 50 μL | - |
Tabell 2: PCR reagens. * För 1st steg PCR. 100 ng. ** För 2nd PCR. varje 30-50 ng av 1st steg PCR-amplikon. För kolonin PCR. direkta tillägg av bakteriecellerna reaktionsblandningen.
| Cykel steg | Temperatur | Tid | Antal cykler |
| Inledande denaturering | 98 ° C | 2 min | 1 |
| Denaturering Glödgning Förlängning |
98 ° C 55 ° C 72 ° C |
10 s 5 s Amplikon beroende (1 min/1 kbp) |
35 |
| Slutliga förlängning | 72 ° C | Amplikon beroende (1 min/1 kbp) |
1 |
Tabell 3: PCR-amplifiering cykler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, måste primers för 1st PCR utformas för att förstärka ungefär 1 kb uppströms och nedströms angränsande regioner i målregionen i genomet. Sådana länge flankera sekvenser är nödvändigt att förbättra effektiviteten i homolog rekombination.
Sekvenserna av primers (uppåt-bakåt, nedåt-framåt, spcr-framåt, och spcr-omvänd) i detta protokoll var bestäms automatiskt baserat på platsen för införlivandet av den störningar konstruktion. Varje primer innehåller 15 baser komplement till slutet av mallen 2nd PCR på regionen 5'. En längre bindningsställe möjliggör effektivare produktion av den störningar konstruktion. Införandet av minst 10 kompletterande baser på regionen i 5' av varje grundfärg rekommenderas9.
Kapslade primers (N_up-forward och N_up-reverse) användes för 2nd PCR, i stället för yttersta primers (upp-framåt och nedåt-bakåt). Användning av yttersta primers för 2nd PCR är fördelaktigt i vissa fall. framgångsrika förstärkning för de störningar construct för S. mutans ΔgtfB uppnås med hjälp av yttersta primers (inga data anges). Dock resulterar användningen av yttersta primers för steget PCR 2nd ofta i otillräcklig PCR-amplifiering, som visas i figur 3. Användningen av kapslade grundfärger konstaterades för att lösa detta problem9. När den störningar bygga inte förstärks väsentligt ens använda kapslade primers, kan omdesign av primers används i 1st PCR dock krävas.
Kolonin PCR möjliggör bekväm screening av gen-stört stammen. Grundfärg av kända sekvenser får tillämpas för generering av gen-stört stammen med spcr. Elektroporation användes för införandet av störningar konstruktioner i S. mutans WT, förvandling effektivitet uppnås med elektroporation är generellt högre än som aktiverats genom andra förfaranden. Transformation med häst serum eller häst serum med kompetens-stimulerande peptider, är allmänt accepterat i Streptococcus10,11,12. Även om det krävs en elektroporation apparat, är förfarandena, såsom behöriga cell förberedelse, mycket enklare än de alternativa metoder10,11. Dessutom rekommenderas elektroporation från synpunkt av djurskydd.
Detta protokoll är tillämpligt på flera gen störningar, beroende på antalet ofantibiotic markörer. Att generera både gtfC- och gtfB-stört S. mutans stammar, till exempel den DNA konstruktionen för gtfC-störningar som konstruerats av 2-stegs PCR kan omvandlas till S. mutans ΔgtfB. Eftersom gtfC och gtfB är intilliggande i det här fallet, S. mutans ΔgtfC och S. mutans ΔgtfB genomen måste användas som mallar för 2-stegs PCR för att upprätthålla de homologa sekvenserna för homologa rekombination. I själva verket dubbel gen-stört S. mutans stam byggdes tidigare av detta protokoll9.
Detta protokoll för genen störningar i S. mutans kan anpassas för generering av gen-stört stammar av olika arter. Detta protokoll kräver inte det genen kloning steget involverade i konventionella protokoll. PCR är dessutom den enda krävs enzymatisk reaktionen; plasmid vektorer, Escherichia coli, ligase och restriktionsenzym är därför inte nödvändiga. Dessutom erbjuder protokolls större flexibilitet när det gäller design av den störningar bygga, konstruera designen är oberoende av restriktionsenzym platser av målgenen. Forskare kan fastställa regioner som tas bort eller bevaras i genomet att utforma reverse primer för amplifiering av Regionkommittén uppströms flankera och framåt primer för amplifiering av Regionkommittén nedströms flankera. Dessa kompletterande regioner är omedelbart uppströms och omedelbart nedströms i regionen i DNA önskas för radering, respektive. Sådan flexibilitet kan användas för att minska yttre påverkan, såsom polar effekter, på uttrycket av proximate gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Japan Society för främjande av vetenskap [Grant nummer 16 K 15860 till T.M. och 15 K 15777 till N.H.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
Tags
Genetik fråga 128 Gene störningar DNA konstruera polymeras-kedjereaktion primer design markörgen för antibiotikaresistens Streptococcus mutans elektroporation homolog rekombination View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
