Generering av en gen-forstyrret Streptococcus mutans belastning uten Gene kloning

Summary

Vi beskriver en lettvinte, rask og relativt rimelig metode for generering av gen-forstyrret Streptococcus mutans stammer; Denne teknikken kan tilpasses for generering av gen-forstyrret stammer av ulike arter.

Abstract

Typisk metoder for forklaring av funksjonen av et bestemt gen innebære sammenlignende fenotypiske analyser av vill-type belastning og en belastning som genet av interesse er blitt avbrutt. En gen-avbrudd DNA konstruksjon som inneholder et passende antibiotikumet motstand markør gen er nyttig for generering av gen-forstyrret stammer i bakterier. Men innebære konvensjonelle konstruksjonsmetoder, som krever genet kloning trinn, kompleks og tidkrevende. Her, er en relativt lettvinte, rask og kostnadseffektiv metode for målrettet genet avbrudd i Streptococcus mutans beskrevet. Metoden benytter en 2-trinns fusion polymerasekjedereaksjons (PCR) å generere avbrudd konstruksjon og electroporation for genetisk transformasjon. Denne metoden krever ikke en enzymatisk reaksjon, enn PCR, og i tillegg gir større fleksibilitet i utformingen av den avbrudd konstruere. Sysselsetting av electroporation Letter utarbeidelse av kompetente celler og forbedrer effektiviteten transformasjon. Metoden finnes kan tilpasses for generering av gen-forstyrret stammer av ulike arter.

Introduction

Gene funksjon analyse innebærer vanligvis en fenotypiske sammenligning mellom en vill-type stamme og en belastning som en bestemte genet av interesse er blitt avbrutt. Denne gen-avbrudd teknikken har vært utnyttet for gen funksjon analyser i en rekke taxa, fra bakterier for pattedyr. En gen-avbrudd konstruksjon er nødvendig for generering av gen-forstyrret belastningen; Denne deoksyribonukleinsyre (DNA) konstruksjonen består av antibiotikaresistens markør genet smeltet til oppstrøms og nedstrøms flankert regioner av målet genet, og er innlemmet i genomet via homologe rekombinasjon. Gen-forstyrret belastningen kan isoleres bruke selektiv medier som inneholder antibiotikaet. Det tradisjonelle metoden brukes for bygging av gen-forstyrret belastningen krever kompleks trinn, som forsterkning av målet genet av polymerasekjedereaksjons (PCR), ligation av genet til en egnet plasmider, fordøyelsen med begrensning enzymer og religation sette inn antibiotika-motstand markør genet. Denne prosessen er tidkrevende, ta flere dager til flere uker, avhengig av suksessen til hvert trinn. I tillegg er utformingen av avbrudd konstruksjoner avhengig av begrensning enzym nettstedene til målet genet. For å løse disse problemene, er PCR-baserte DNA skjøting metode^1,2 for design av gen-forstyrret mutanter av Dictyostelium discoideum³ og Synechocystis sp. PCC6803⁴ rapportert. Studien, ble en metode utviklet for å generere en gen-forstyrret streptokokk belastning i en relativt rask, lettvint og billig måte, utnytte en endret PCR-basert metode (betegnet 2-trinns fusion PCR) for bygging av avbrudd konstruere og electroporation for genetisk transformasjon.

2-trinns fusion PCR krever genomisk DNA, antibiotikaresistens markør genet som PCR mal og fire par hensiktsmessig utformet oligonucleotide primere. I første trinn (1^st PCR), en 1-kb oppstrøms flankemanøveren region av målet genet, en 1-kb nedstrøms flankemanøveren region av målet er genet og antibiotika-motstand markør genet forsterket av PCR. 5′ regionene i både omvendt primer og videresende primer, for forsterkning av oppstrøms og nedstrøms inkluderer flankert regioner, henholdsvis 15 baser utfyllende til endene av markør genet. 5′ regionene i både forover og bakover grunning for markør gene forsterkning tilsvarende inkluderer 15 baser utfyllende til den nedre enden av oppstrøms flankemanøveren regionen målet genet og den øvre enden av nedstrøms flankemanøveren regionen målet genet, henholdsvis. Derfor inneholder tre forsterket fragmenter overlappende 30-base par områder på webområdet fusion. I det andre trinnet (2^nd PCR) utføres PCR med nestede PCR primere med tre fragmenter forsterket av 1^st PCR som maler. Utfyllende regionene malene er i tillegg koblet til hverandre via 2^nd PCR. Til slutt, konstruere for homologe rekombinasjon er introdusert til vill-type belastning ved electroporation. Vellykket genet avbrudd kan verifiseres ved PCR bruker bestemte primere. Selv om avbrudd Konstruer forsterkes med Hi-Fi-DNA polymerase, er ekstra enzymatiske reaksjoner, som DNA hemorroider eller DNA fordøyelsen, ikke nødvendig å generere Konstruer. I tillegg bli et slettet eller bevarte område på genomet fleksibelt valgt etter primer design.

I den nåværende arbeidet, ble sletting av hele koding regionen av gtfC genet, som koder glucosyltransferase i Streptococcus mutans, utført for å demonstrere metoden rask, enkel genet avbrudd i streptokokk art. I tillegg en gtfB-forstyrret belastningen ble generert på samme måte. Glucosyltransferases kodet av både gtfC og gtfB bidra til cariogenic dental biofilm utvikling^5,6. Biofilm-forming evner av vill-type belastning (S. mutans WT), gtfC-forstyrret belastning (S. mutans ΔgtfC), og gtfB-forstyrret belastning (S. mutans ΔgtfB) ble evaluert for sammenlignende fenotypiske analyser. Dette utvider anvendelsen av en to-trinns metode for genet avbrudd i en ekstra arter og kan endres for studier av gen funksjon i et bredere spekter av taxa.

Protocol

1. primer Design forberede primere for 2-trinns fusion PCR og verifisering av genet avbrudd. Merk: Tabell 1 viser primer sekvenser i denne protokollen. figur 1 viser en skjematisk illustrasjon av 2-trinns fusion PCR metoden som brukes til å generere S. mutans Δ gtfC. Design primere for utskifting av målregion i genomet med spectinomycin-motstand genet (spc r) 7. Den…

Representative Results

Figur 2 viser at størrelsen på hvert produkt i 1st PCR, som observert på 1% agarose gel, var bra avtale med anslått størrelse på ca 1 kb. Figur 3 viser gel geleelektroforese analyse av 2nd PCR. Figur 4 viser S. mutans kolonier forvandlet med avbrudd Konstruer og en gel geleelektroforese analyse av kolonien PCR produktene. Amplicons fra alle koloniene var spådd st…

Discussion

I stede protokollen, må primere for 1^st PCR være utformet å forsterke ca 1 kb oppstrøms og nedstrøms flankert regioner målregion i genomet. Så lenge flankemanøveren sekvenser er nødvendig for å forbedre effektiviteten av homologe rekombinasjon.

Sekvenser av primerne (opp-revers, ned-fremover, spc^r-fremover, og spc^r-omvendt) i denne protokollen var bestemmes på grunnlag av området av inkorporering av avbrudd Konstruer. Hver primer i…

Materials

Streptococus mutans	Stock strain in the lab.		Wild-type strain (Strain UA159)
Genomic DNA extraction kit	Zymo Research	D6005
Bead-beating disruption apparatus	Taitec	GM-01
Synthetic genes	Eurofins Genomics	Custom-ordered	Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene
Thermal cycler	Astec	PC-708
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered	35 bases in length
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Spectrophotometer	Beckman Coulter	DU 800
Electroporator	Bio-rad	1652100
Electroporation cuvette	Bio-rad	1652086	0.2-cm gap
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture media
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics
Erythromycin	Wako	057-07151	Antibiotics
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining