Summary
Vi beskriver en lettvinte, rask og relativt rimelig metode for generering av gen-forstyrret Streptococcus mutans stammer; Denne teknikken kan tilpasses for generering av gen-forstyrret stammer av ulike arter.
Abstract
Typisk metoder for forklaring av funksjonen av et bestemt gen innebære sammenlignende fenotypiske analyser av vill-type belastning og en belastning som genet av interesse er blitt avbrutt. En gen-avbrudd DNA konstruksjon som inneholder et passende antibiotikumet motstand markør gen er nyttig for generering av gen-forstyrret stammer i bakterier. Men innebære konvensjonelle konstruksjonsmetoder, som krever genet kloning trinn, kompleks og tidkrevende. Her, er en relativt lettvinte, rask og kostnadseffektiv metode for målrettet genet avbrudd i Streptococcus mutans beskrevet. Metoden benytter en 2-trinns fusion polymerasekjedereaksjons (PCR) å generere avbrudd konstruksjon og electroporation for genetisk transformasjon. Denne metoden krever ikke en enzymatisk reaksjon, enn PCR, og i tillegg gir større fleksibilitet i utformingen av den avbrudd konstruere. Sysselsetting av electroporation Letter utarbeidelse av kompetente celler og forbedrer effektiviteten transformasjon. Metoden finnes kan tilpasses for generering av gen-forstyrret stammer av ulike arter.
Introduction
Gene funksjon analyse innebærer vanligvis en fenotypiske sammenligning mellom en vill-type stamme og en belastning som en bestemte genet av interesse er blitt avbrutt. Denne gen-avbrudd teknikken har vært utnyttet for gen funksjon analyser i en rekke taxa, fra bakterier for pattedyr. En gen-avbrudd konstruksjon er nødvendig for generering av gen-forstyrret belastningen; Denne deoksyribonukleinsyre (DNA) konstruksjonen består av antibiotikaresistens markør genet smeltet til oppstrøms og nedstrøms flankert regioner av målet genet, og er innlemmet i genomet via homologe rekombinasjon. Gen-forstyrret belastningen kan isoleres bruke selektiv medier som inneholder antibiotikaet. Det tradisjonelle metoden brukes for bygging av gen-forstyrret belastningen krever kompleks trinn, som forsterkning av målet genet av polymerasekjedereaksjons (PCR), ligation av genet til en egnet plasmider, fordøyelsen med begrensning enzymer og religation sette inn antibiotika-motstand markør genet. Denne prosessen er tidkrevende, ta flere dager til flere uker, avhengig av suksessen til hvert trinn. I tillegg er utformingen av avbrudd konstruksjoner avhengig av begrensning enzym nettstedene til målet genet. For å løse disse problemene, er PCR-baserte DNA skjøting metode1,2 for design av gen-forstyrret mutanter av Dictyostelium discoideum3 og Synechocystis sp. PCC68034 rapportert. Studien, ble en metode utviklet for å generere en gen-forstyrret streptokokk belastning i en relativt rask, lettvint og billig måte, utnytte en endret PCR-basert metode (betegnet 2-trinns fusion PCR) for bygging av avbrudd konstruere og electroporation for genetisk transformasjon.
2-trinns fusion PCR krever genomisk DNA, antibiotikaresistens markør genet som PCR mal og fire par hensiktsmessig utformet oligonucleotide primere. I første trinn (1st PCR), en 1-kb oppstrøms flankemanøveren region av målet genet, en 1-kb nedstrøms flankemanøveren region av målet er genet og antibiotika-motstand markør genet forsterket av PCR. 5' regionene i både omvendt primer og videresende primer, for forsterkning av oppstrøms og nedstrøms inkluderer flankert regioner, henholdsvis 15 baser utfyllende til endene av markør genet. 5' regionene i både forover og bakover grunning for markør gene forsterkning tilsvarende inkluderer 15 baser utfyllende til den nedre enden av oppstrøms flankemanøveren regionen målet genet og den øvre enden av nedstrøms flankemanøveren regionen målet genet, henholdsvis. Derfor inneholder tre forsterket fragmenter overlappende 30-base par områder på webområdet fusion. I det andre trinnet (2nd PCR) utføres PCR med nestede PCR primere med tre fragmenter forsterket av 1st PCR som maler. Utfyllende regionene malene er i tillegg koblet til hverandre via 2nd PCR. Til slutt, konstruere for homologe rekombinasjon er introdusert til vill-type belastning ved electroporation. Vellykket genet avbrudd kan verifiseres ved PCR bruker bestemte primere. Selv om avbrudd Konstruer forsterkes med Hi-Fi-DNA polymerase, er ekstra enzymatiske reaksjoner, som DNA hemorroider eller DNA fordøyelsen, ikke nødvendig å generere Konstruer. I tillegg bli et slettet eller bevarte område på genomet fleksibelt valgt etter primer design.
I den nåværende arbeidet, ble sletting av hele koding regionen av gtfC genet, som koder glucosyltransferase i Streptococcus mutans, utført for å demonstrere metoden rask, enkel genet avbrudd i streptokokk art. I tillegg en gtfB-forstyrret belastningen ble generert på samme måte. Glucosyltransferases kodet av både gtfC og gtfB bidra til cariogenic dental biofilm utvikling5,6. Biofilm-forming evner av vill-type belastning (S. mutans WT), gtfC-forstyrret belastning (S. mutans ΔgtfC), og gtfB-forstyrret belastning (S. mutans ΔgtfB) ble evaluert for sammenlignende fenotypiske analyser. Dette utvider anvendelsen av en to-trinns metode for genet avbrudd i en ekstra arter og kan endres for studier av gen funksjon i et bredere spekter av taxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer Design
- forberede primere for 2-trinns fusion PCR og verifisering av genet avbrudd.
Merk: Tabell 1 viser primer sekvenser i denne protokollen. figur 1 viser en skjematisk illustrasjon av 2-trinns fusion PCR metoden som brukes til å generere S. mutans Δ gtfC.- Design primere for utskifting av målregion i genomet med spectinomycin-motstand genet (spc r) 7. Denne protokollen erstatter hele koding regionen av gtfC genet med spc r.
- Inkluderer 15 baser komplementær til øvre og nedre ender spc r på 5 ' regioner i opp-revers og ned fram primere, henholdsvis. Tilsvarende inkluderer 15 baser utfyllende til den nedre enden av oppstrøms flankemanøveren regionene gtfC og den øvre enden av nedstrøms flankemanøveren regionene gtfC på 5 ' regioner av spc r-frem og spc r -reversere primere, henholdsvis ( figur 1A).
Merk: Sekvenser av opp-revers, ned-fremover, spc r - fremover, og spc r - reversere primere bestemmes automatisk avhengig av stedet for inkorporering av avbrudd Konstruer. - Design opp-forover og ned-revers primerne til å omfatte > 1 kb oppstrøms og nedstrøms flankert regioner av gtfC genet, henholdsvis. Angi Smeltetemperaturen (T m) opp-forover og ned-revers primere i samsvar med Smeltetemperaturen for opp-revers og ned fram primere, henholdsvis ( figur 1A).
Merk: Se følgende formel til å bestemme T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, hvor * N representerer antall primer nukleotider med den angitte identiteten (A, T, C eller G). - Design nestede primere (N_up fram og N_up-revers) for 2 nd PCR ( figur 1B).
Merk: Selv om ytterste primer paret (opp-fremover og ned-revers) kan brukes som primere for 2 nd PCR, nestede primere (N_up fram og N_up-revers) ble designet i denne protokollen. Nestede primere er ofte nødvendig for 2 nd PCR, som beskrevet i Representant resultater. - Design primere spesifikke for preparatomtalen r. Primerne brukes for kolonien PCR til skjermen for gtfC avbrudd.
- Design primere for verifisering av gtfC forstyrrelser.
Merk: PCR produktene forsterket bruker disse veiledningene skreve grensen mellom gtfC eller spc r og oppstrømshastighet eller nedstrøms flankert regioner i gtfC. Primer sett ' gtfC opp-forward og gtfC opp-revers ' og ' gtfC ned fram og gtfC ned-revers ' er spesifikke for gtfC, og ' gtfC opp-fremover og spc r 2 -omvendt ' og ' spc r 2-forward og gtfC ned-revers ' er spesifikke for preparatomtalen r.
2. Genomic DNA utvinning fra S. mutans
- strek lager S. mutan s UA159 på en hjerne hjertet infusjon (BHI) agar tallerken. Inkuber platen overnatting på 37 ° C under anaerob forhold.
- Plukke opp en enkelt koloni bruker en sterilisert tannpirker og vaksinere det i 5 mL av BHI kjøttkraft. Inkuber S. mutan s kulturen overnatting på 37 ° C under anaerob forhold.
- Sentrifuge bakteriell cellekultur i 15 min på 2000 × g. Resuspend celle pellet i 5 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS).
- Sentrifuger i 15 min på 2000 × g. Resuspend celle pellet i 200 µL av PBS.
- Ekstra genomisk DNA fra suspensjon bruker en perle-slo-base genomisk DNA utvinning utstyr i henhold til instruksjonene fra produsenten.
- Overføre suspensjon et 2.0-mL utvalg rør som inneholder glassperler (inkludert i pakken). Legge til 750 µL lysis løsning (inkludert i pakken) i celle suspensjon.
- Cap tett og plassere rør symmetrisk i rør innehaveren av perle-juling avbrudd apparatet. Prosessen for topphastigheten i 5 min. Sentrifuger perle-banket prøver for 1 min på 10.000 × g. overføre nedbryting spinn filteret (inkludert i pakken) 2.0-mL samling rør og sentrifuge for 1 min 7000 × g .
- Legge til 1200 µL av DNA bindende buffer (inkludert i pakken) til filtratet. Overføre 800 µL av blandingen til kolonnen spinn (inkludert i pakken) 2.0-mL samling rør og sentrifuge for 1 min på 10.000 × g.
- Forkast gjennomflytsenhet, legge til 200 µL forvask bufferen (inkludert i pakken) i kolonnen spin å vaske kolonnen matrise, og sentrifuge for 1 min på 10.000 × g. kast gjennomflytsenhet, legge til 500 µL av vaskebuffer (inkludert i pakken) spinn kolonnen vaske kolonnen matrix og sentrifuge for 1 min på 10.000 × g.
- Plasser kolonnen spinn i en ny 1.5-mL microcentrifuge tube og legge 100 µL av elueringsbufferen (inkludert i pakken) til kolonne matrix.
- Sentrifuge for 30 s 10.000 × g til elute genomisk DNA. Beregne DNA konsentrasjon og renhet av måler absorbansen på 260 nm og 280 nmusing et spektrofotometer og bekrefte at A 260 /A 280 forholdet er større enn 1,8.
3. PCR forsterkning
- utføre 1 st PCR med S. mutan s WT genomet og syntetisk spc r genet som PCR maler (se tabell 1). Forsterke oppstrøms flankemanøveren regionen av gtfC genet, nedstrøms flankemanøveren regionen gtfC genet, og spc r genet bruker de tre settene med primere beskrevet ovenfor ( figur 1A), som per Tabell 2 og tabell 3.
Merk: PCR primere, reagenser og forsterkning sykluser oppsummeres i tabell 1 og tabell 2 tabell 3, henholdsvis. - Smuldre vekk hvert PCR-produkt på en 1% agarose gel og avgiftsdirektoratet tilsvarende band med en gel bandet kutter.
- Rense hvert forsterket DNA produkt fra geléer bruker en spinn kolonne- og silika membranbasert gel utvinning kit.
- Overføre gel skiver til en ren microcentrifuge rør og bland med 500 µL av bindende buffer (inkludert i pakken). Inkuber blandingen ved 55 ° C i 15 min før gel sektorene er fullstendig oppløst.
- Plasser kolonnen spinn (inkludert i pakken) i en samling rør (inkludert i pakken), laste utvalget på kolonnen spinn og sentrifuge for 30 s 11.000 × g. Forkaste gjennomflytsenhet, legge til 600 µL av vaskebuffer (inkludert i pakken) til kolonnen Spin å vaske silica membranen og sentrifuge for 30 s 11.000 × g.
- Kaste gjennomflytsenhet og sentrifuge for 2 min 11.000 × g tørke silica membranen.
- Sted kolonnen spinn i en ny 1.5-mL microcentrifuge tube, Legg 50 µL elueringsbufferen (inkludert i pakken), og Inkuber ved romtemperatur for 2 min.
- Sentrifuger i 2 minutter på 11.000 × g til elute forsterket DNA. Beregne DNA konsentrasjon og renhet av måler absorbansen på 260 nm og 280 nmusing et spektrofotometer og bekrefte at A 260 /A 280 forholdet er større enn 1,8.
- Utføre 2 nd PCR 2-trinns Fusion PCR bruker tre ca ekvimolare fragmenter som PCR maler, som tabell 2 < /stRong > og tabell 3.
Merk: Disse fragmentene ble forsterket og skjøtes bruker nestede primerne ' N_up-forward og N_down-revers ' eller ytterste primerne ' opp-forover og ned-revers ' ( figur 1B). PCR primere, reagenser og forsterkning sykluser oppsummeres i tabell 1 og tabell 2 tabell 3, henholdsvis. - Laste en tidel av PCR reaksjonsblandingen (5 µL) på en 0,8% agarose gel og sammenligne forsterket bandet størrelsen av forventet bandet størrelse bekrefte generering av den aktuelle amplicon ( figur 1 c).
- Konsentrere gjenværende PCR sluttproduktet av etanol nedbør uten rensing.
- Legge til 55 µL av ultra ren vann til gjenværende PCR blanding å justere det totale volumet til 100 µL.Add et en tidel volum av 3 M natrium acetate (10 µL), pH 5.2, etterfulgt av 2,5 mengder 100% etanol (250 µL). Bland og fryse i 30 min på-80 ° C.
- Sentrifuge for 20 min 15.000 × g på 4 ° C, se etter pellet på bunnen av røret, og forkaste nedbryting. Vask pellets med 1 mL av 70% etanol, sentrifuge for 5 min på 15.000 × g på 4 ° C, og forkaste nedbryting. Air-Dry pellets i ca 30 min og oppløse med 10 µL ultra rent vann.
4. Kompetente celle forberedelse og celle transformasjon
- strek lager S. mutan s UA159 på en BHI agar tallerken. Inkuber platen overnatting på 37 ° C under anaerob forhold.
- Plukke opp en enkelt koloni bruker en sterilisert tannpirker og vaksinere det i 5 mL av BHI kjøttkraft. Inkuber S. mutan s kulturen overnatting på 37 ° C under anaerob forhold.
- Overføre 2 mL S. mutan s kulturen til 50 mL av BHI buljong og ruge for 6-8 h på 37 ° C til en optisk tetthet på 600 nm (OD 600) av 0,2-0,4 under anaerob forhold.
- Sentrifuge cellene i 15 min 2000 × g på 4 ° C, forkaste nedbryting og vaske cellene to ganger med 40 mL iskaldt vann etterfulgt av 40 mL 10% glyserol.
Merk: Gjenværende stoffer påvirker påfølgende electroporation. - Sug opp nedbryting med en Pasteur pipette som etterlevelse av cellen pellet i 10% glyserol er redusert. Resuspend cellene i 1 mL av fersk 10% glyserol, dispensere 50 µL av suspensjon i hver 1.5-mL microcentrifuge rør og lagre-80 ° c før like før bruk.
- Blanding 50 µL aliquot iskald kompetent celler med 5 µL av avbrudd konstruere beskrevet over i Seksjon 3. Legg blandingen til electroporation cuvettes (med 0,2 cm avstand mellom elektrodene). Ansette Staphylococcus aureus modus (1,8 kV, 600 Ω, 10 µF, 1 puls) av electroporation apparater å electroporate.
- Suspendere cellene i 500 µL av BHI kjøttkraft umiddelbart etter electroporation og legge til 50 µL av suspensjon spectinomycin inneholder BHI-agar plater.
Merk: Ekstra inkubasjon tid etter electroporation ikke er nødvendig. Imidlertid inkubasjonstiden for 1-2 h etter electroporation kan forbedre transformasjon effektiviteten. - Ruge plate for 2-6 dager på 37 ° C under anaerob forhold.
Merk: S. mutans Δ gtfB er konstruert som beskrevet ovenfor. Hele koding regionen av gtfB genet er erstattet med erythromycin motstand genet 8 i S. mutans Δ gtfB. Hver S. mutans stamme er kultivert i BHI sjy ved 37 ° C under anaerob forhold.
5. Bekreftelse av Gene avbrudd og lagring
- plukke tilfeldige kolonier og vaksinere seg i PCR blandingen å utføre kolonien PCR per tabell 2 og tabell 3. PCR primere, reagenser og forsterkning sykluser oppsummeres i tabell 1 og tabell 2 tabell 3, henholdsvis.
- Laste PCR reaksjonsblandingen på en 1% agarose gel å bekrefte spc r-spesifikke DNA bandet.
- Plukke positiv kolonien bruker en sterilisert tannpirker og subkultur celler i 10 mL inneholder BHI spectinomycin kjøttkraft for 2 dager på 37 ° C under anaerob forhold.
- Bekrefte generering av S. mutans Δ gtfC.
- Dele celle suspensjon like. Ekstra genomisk DNA fra cellene beskrevet ovenfor (trinn 2.3. til 2.5.5.). Utføre PCR med genomisk DNA som malen PCR primere i kontroll av gtfC avbrudd (tabell 1) per tabell 2 og tabell 3.
Merk: Den PCR primere reagenser og forsterkning sykluser oppsummeres i tabell 1 og tabell 2 tabell 3, henholdsvis. - Last PCR blandingen på en 2% agarose gel og sammenligne forsterket bandet størrelsen av forventet bandet størrelse bekrefte generering av den aktuelle amplicon .
- Sentrifuge gjenværende celle suspensjon i 15 min 2000 × g på 4 ° C. Resuspend celle pellet i 5 mL av PBS.
- Sentrifuger i 15 min 2000 × g på 4 ° C. Resuspend cellen pellets i 1,5 mL av BHI kjøttkraft inneholder 25% glyserol og lagre i-80 ° Cor -20 ° C.
- Dele celle suspensjon like. Ekstra genomisk DNA fra cellene beskrevet ovenfor (trinn 2.3. til 2.5.5.). Utføre PCR med genomisk DNA som malen PCR primere i kontroll av gtfC avbrudd (tabell 1) per tabell 2 og tabell 3.
6. Fenotypiske analyse
- strek hver S. mutan s belastning på en BHI agar plate. Inkuber platen overnatting på 37 ° C under anaerob forhold.
- Plukke opp en enkelt koloni bruker en sterilisert tannpirker og vaksinere det i 2 mL BHI buljong med eller uten en passende antibiotikumet. Ruge over natten på 37 ° C under anaerob forhold.
- Vaksinere 20 µL av natten kultur suspensjon i 2 mL BHI buljong med 1% eller 5% sukrose uten antibiotika i test røret; kultur cellene med reagensglasset i et skrånende stilling overnatting på 37 ° C under anaerob forhold.
- Vortex glasset reagensglass for 10 s og Dekanter kultur suspensjoner. Vask reagensglass tre ganger med destillert vann. Legge 1 mL av 0,25% Coomassie briljant blå (CBB) stain på biofilm på røret veggen, og deretter ruge i 1
- Dekanter flekker løsningen, vaske reagensglass tre ganger med destillert vann og tørk reagensglass.
- Vurdere både farge tetthet og utvidelse av den CBB farget-biofilm visuelt å bestemme biofilm-forming mulighet i en fenotypiske analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser at størrelsen på hvert produkt i 1st PCR, som observert på 1% agarose gel, var bra avtale med anslått størrelse på ca 1 kb. Figur 3 viser gel geleelektroforese analyse av 2nd PCR. Figur 4 viser S. mutans kolonier forvandlet med avbrudd Konstruer og en gel geleelektroforese analyse av kolonien PCR produktene. Amplicons fra alle koloniene var spådd størrelsen. Figur 5 viser webområdene primer-binding for kontroll av gtfC avbrudd og gel geleelektroforese PCR-produkter. PCR produkter av forsterkning med gtfC -spesifikke primer sett ble bekreftet i S. mutans WT, men ikke i S. mutans ΔgtfC, mens PCR produkter får spcr-spesifikke primer sett ble bekreftet i S. mutans ΔgtfC, men ikke i S. mutans WT. figur 6 viser sukrose-avledet biofilm-forming evne til hver S. mutans stamme. En tilhenger biofilm ble dannet av S. mutans WT i nærvær av sukrose; tilhenger biofilm-forming evne til S. mutans ΔgtfB var lavere enn at av S. mutans WT. S. mutans ΔgtfC viste svært lav tilhenger biofilm formasjonen i nærvær av sukrose.
Finne 1:Strategy for 2-trinns fusion PCR. En skjematisk illustrasjon av S. mutans ΔgtfC konstruksjon vises. Gene lengder er ikke skala. (A) oppstrøms og nedstrøms flankert regionene gtfC og spcr ble loci forsterket av PCR. Primer bindende områdene i malen angis med identiske mønstre. (B) det andre PCR-trinnet ble utført (som maler) 3 fragmenter som ble forsterket i første PCR trinn med nestede primere. (C) avbrudd Konstruer ble oppnådd for homologe rekombinasjon i bakteriell påkjenninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant gel geleelektroforese produkter fra 1st PCR. Amplicons oppstrøms flankemanøveren regionen gtfC og nedstrøms flankemanøveren regionen gtfC og spcr vises. M: molekylær markør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant gel geleelektroforese produkter fra 2nd PCR. Produkter forsterket med nestede primerne og ytterste primerne vises. Solid pilen viser anslått størrelsen på den avbrudd konstruere. M: molekylær markør.
Figur 4: Screening for gtfC avbrudd av kolonien PCR (A). S. mutans kolonier på spectinomycin inneholder BHI-agar plate; hver sirkel nummeret indikerer koloni-ID. (B) representant gel geleelektroforese av kolonien PCR produkter; hver sirkel lane nummeret indikerer den tilsvarende koloni-IDen i figur 4A. M: molekylær markør, WT: vill-type genomisk DNA brukes som mal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Bekreftelse av gtfC forstyrrelser av PCR. (A) Primer bindende områder; Gene lengden er ikke skala. PCR ble utført med S. mutans genomisk DNA som en mal. Primer sett: gtfC opp-forward og gtfC opp-revers (spesifikk for gtfC); gtfC ned-forward og gtfC ned-revers (spesifikk for gtfC); gtfC opp-fremover og spcr2-revers (spesifikk for preparatomtalenr); spcr2-forward og gtfC ned-revers (spesifikk for preparatomtalenr). (B) representant gel geleelektroforese av PCR-produkter; hver sirkel lane nummeret indikerer den tilsvarende primeren i figur 5A. Et enkeltbilde electrophoretic deles Hvis etiketten merket bandene. M: molekylær markør (100-base par stiger). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: fenotypiske analyse basert på biofilm utvikling. Sukrose-avledet biofilm dannet av hver S. mutans stamme var farget med Coomassie briljant blå. WT: S. mutans WT, ΔgtfB: S. mutans ΔgtfB, ΔgtfC: S. mutans ΔgtfC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primer par | Sekvens (5' til 3) | Forventet bandet størrelse (bp) | |
| 2-trinns PCR for gtfC avbrudd | |||
| 1 PCR | |||
| opp-forward opp-revers |
AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA |
1,036 | |
| SPCr-fremover SPCr-omvendt |
ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT |
1,188 | |
| ned-forover ned-revers |
AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
1,059 | |
| 2 PCR | |||
| N_up fremover N_down-revers |
TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3,132 | |
| Bekreftelse av gtfC forstyrrelser | |||
| Kolonien PCR for screening | |||
| S_spcr-fremover S_spcr-omvendt |
GGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAG | 535 | |
| Endelig bekreftelse | |||
| gtfC opp-forward gtfC opp-revers |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG |
498 | |
| gtfC ned-forover gtfC ned-revers |
GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
557 | |
| gtfC opp-forward spcr2 invertering |
Beskrevet ovenfor CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
641 | |
| spcr2 fremover gtfC ned-revers |
GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG Beskrevet ovenfor |
623 | |
| Reagens | Konsentrasjonen av lager løsninger | Volum | Siste konsentrasjon |
| DNA polymerase premix | 2 × | 25 ΜL | 1 × |
| Fremover primer | 5 ΜM | 2 ΜL | 0,2 ΜM |
| Omvendt primer | 5 ΜM | 2 ΜL | 0,2 ΜM |
| Malen DNA | Variabel | Variabel | Variabel * ** *** |
| Deionisert vann | - | opptil 50 μL | - |
Tabell 2: PCR reagenser. * For 1st trinn PCR; 100 ng. ** For 2nd PCR; hver 30-50 ng av 1m skritt PCR amplicon. For kolonien PCR; direkte tillegg av bakterielle celler til reaksjonsblandingen.
| Syklus trinn | Temperatur | Tid | Antall sykluser |
| Første rødsprit | 98 ° C | 2 min | 1 |
| Rødsprit Avspenning Utvidelse |
98 ° C 55 ° C 72 ° C |
10 s 5 s Amplicon avhengige (1 min/1 kbp) |
35 |
| Endelig utvidelse | 72 ° C | Amplicon avhengige (1 min/1 kbp) |
1 |
Tabell 3: PCR forsterkning sykluser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I stede protokollen, må primere for 1st PCR være utformet å forsterke ca 1 kb oppstrøms og nedstrøms flankert regioner målregion i genomet. Så lenge flankemanøveren sekvenser er nødvendig for å forbedre effektiviteten av homologe rekombinasjon.
Sekvenser av primerne (opp-revers, ned-fremover, spcr-fremover, og spcr-omvendt) i denne protokollen var bestemmes på grunnlag av området av inkorporering av avbrudd Konstruer. Hver primer inneholder 15 baser utfyllende til slutten av 2nd PCR malen på 5' regionen. En lengre bindende nettsted gjør mer effektiv produksjon av avbrudd Konstruer. Inkludering av minst 10 komplementære baser på 5' regionen av hver primer anbefales9.
Nestede primere (N_up fram og N_up-revers) ble brukt for 2nd PCR, i stedet for de ytterste primerne (opp-fremover og ned-revers). Bruk av de ytterste primerne for 2nd PCR er nyttig i noen tilfeller. vellykket forsterkning av avbrudd Konstruer for S. mutans ΔgtfB ble oppnådd med ytterste primerne (data ikke vist). Men resulterer bruk av de ytterste primerne for 2nd PCR skritt ofte i utilstrekkelig PCR forsterkning, som vist i Figur 3. Bruk av nestede primere fant for å løse dette problemet9. Når avbrudd Konstruer ikke forsterkes betydelig selv bruker nestede primerne, men kan redesign av primere brukt i 1 PCR være nødvendig.
Kolonien PCR kan praktisk screening av gen-forstyrret belastningen. Primere kjent sekvenser kan brukes for generering av gen-forstyrret belastningen ved hjelp av spcr. Electroporation ble brukt for innføring av avbrudd konstruksjoner i S. mutans WT, transformasjon effektiviteten ved hjelp av electroporation er vanligvis høyere enn aktivert andre prosedyrer. Transformasjon med hest serum eller hest serum kompetanse-stimulerende peptider er allment akseptert i Streptococcus10,11,12. Selv om det kreves et electroporation apparat, er prosedyrene som er involvert, som vedkommende celle forberedelse, mye enklere enn i alternative metoder10,11. I tillegg anbefales electroporation fra synspunkt av dyr velferd.
Nåværende protokollen gjelder flere genet avbrudd, avhengig av antall ofantibiotic merkene. Generere både gtfC- og gtfB-forstyrret S. mutans stammer, for eksempel DNA Konstruer for gtfC-avbrudd konstruert av 2-trinns PCR kan bli forvandlet til S. mutans ΔgtfB. GtfC og gtfB er tilstøtende i dette tilfellet, S. mutans ΔgtfC og S. mutans ΔgtfB genomer må brukes som maler for 2-trinns PCR for å opprettholde homologe sekvenser for homologe rekombinasjon. Faktisk, dobbel gen-forstyrret S. mutans belastningen ble tidligere konstruert av denne protokollen9.
Den nåværende protokollen for genet avbrudd i S. mutans kan tilpasses for generering av gen-forstyrret stammer av ulike arter. Denne protokollen er ikke forlange det gene kloning trinnet involvert i konvensjonelle protokoller. I tillegg er PCR bare nødvendig enzymatiske reaksjonen; Derfor er plasmider vektorer, Escherichia coli, ligase og begrensning enzymer ikke nødvendig. Videre tilbyr finnes protokollen større fleksibilitet i utformingen av den avbrudd konstruksjonen, som konstruksjon er uavhengig av begrensning enzym områder av målet genet. Forskere kan finne områder som er slettet eller bevart i genomet utforme omvendt primer for forsterkning av oppstrøms flankemanøveren regioner og videresende primer for forsterkning av nedstrøms flankemanøveren regioner. Disse flankert regioner er umiddelbart oppstrøms og umiddelbart nedstrøms regionen i DNA ønsket for sletting, henholdsvis. Slik fleksibilitet kan brukes til å redusere ytre påvirkninger, som polar, med uttrykk for proximate gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for fremme av vitenskap [Grant nummer 16 K 15860 til T.M. og 15 K 15777 å N.H.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
Tags
Genetikk problemet 128 Gene avbrudd DNA konstruksjon polymerasekjedereaksjons primer design antibiotikaresistens markør genet Streptococcus mutans electroporation homologe rekombinasjon View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
