Summary
Descriviamo un metodo facile, rapido e relativamente poco costoso per la generazione di gene-interrotto lo streptococco mutans ceppi; Questa tecnica può essere adattata per la generazione di ceppi gene-interrotto di varie specie.
Abstract
Metodi tipici per la delucidazione della funzione di un gene particolare coinvolgono analisi comparative fenotipiche del ceppo selvaggio-tipo e un ceppo in cui è stato interrotto il gene di interesse. Un costrutto di DNA di rottura del gene contenente un gene marcatore di resistenza agli antibiotici adatti è utile per la generazione di ceppi gene-interrotto nei batteri. Tuttavia, metodi di costruzione tradizionali, che richiedono passaggi clonazione genica, coinvolgono protocolli lunghi e complessi. Qui, un metodo relativamente facile, rapido e conveniente per rottura del gene mirati in Streptococcus mutans è descritto. Il metodo utilizza una reazione a catena della polimerasi (PCR) per generare il costrutto di rottura e l'elettroporazione per trasformazione genetica fusione 2-step. Questo metodo non richiede una reazione enzimatica, diverso da PCR e inoltre offre una maggiore flessibilità in termini di design del costrutto rottura. L'occupazione dell'elettroporazione facilita la preparazione di cellule competenti e migliora l'efficienza di trasformazione. Il presente metodo può essere adattato per la generazione di ceppi gene-interrotto di varie specie.
Introduction
Analisi di funzione del gene in genere implica un confronto fenotipico tra un ceppo selvaggio-tipo e un ceppo in cui è stato interrotto un particolare gene di interesse. Questa tecnica di rottura del gene è stata utilizzata per analisi di funzione del gene in una vasta gamma di taxa, dai batteri ai mammiferi. Un costrutto di rottura del gene è necessario per la generazione del ceppo gene-interrotto; Questo costrutto di acido desossiribonucleico (DNA) consiste del gene marcatore di resistenza agli antibiotici fuso a Monte e a valle delle regioni fiancheggianti del gene target ed è incorporato il genoma tramite ricombinazione omologa. Il ceppo di gene-interrotto può essere isolato utilizzando terreni selettivi che contengono l'antibiotico. Il metodo convenzionale utilizzato per la costruzione del ceppo gene-interrotto richiede operazioni complesse, quali l'amplificazione del gene target da reazione a catena della polimerasi (PCR), legatura del gene in un plasmide adatto, digestione con restrizione enzimi e religation per inserire il gene marcatore di resistenza agli antibiotici. Questo processo è che richiede tempo, prendendo diversi giorni a diverse settimane, a seconda dell'esito di ogni passo. Inoltre, il design dei costrutti di rottura è dipenda sui siti degli enzimi di limitazione del gene target. Per risolvere questi problemi, sono stati segnalati basati su PCR del DNA metodi d'impionbatura2 1,per la progettazione di gene-perturbato mutanti di Dictyostelium discoideum3 e Synechocystis SP. PCC68034 . Nello studio presente, è stato sviluppato un metodo per generare un ceppo streptococcico gene-interrotto in maniera relativamente rapida, facile e poco costoso, che utilizza un metodo basato su PCR modificato (designato fusione 2-step PCR) per la costruzione della perturbazione costrutto ed elettroporazione per trasformazione genetica.
La fusione di 2-step che PCR richiede DNA genomic, gene marcatore di resistenza agli antibiotici come un modello PCR e quattro coppie di opportunamente progettato gli iniettori del oligonucleotide. Nella prima fase (1st PCR), una regione di accompagnamento 1 kb a Monte del gene target, una regione di fiancheggiamento 1 kb a valle della destinazione gene e gene marcatore di resistenza agli antibiotici sono amplificati mediante PCR. Regioni 5' sia il primer reverse e il primer in avanti, per l'amplificazione della a Monte e a valle delle regioni, fiancheggianti rispettivamente, includono 15 basi complementari fino agli estremi confini del gene marcatore. 5' regioni di sia forward e reverse primer per l'amplificazione del gene marcatore Analogamente includono 15 basi complementari all'estremità inferiore della regione di fiancheggiamento a Monte del gene dell'obiettivo e l'estremità superiore della regione di fiancheggiamento a valle del gene target, rispettivamente. Di conseguenza, i tre frammenti amplificati contengono regioni sovrapposte di coppia 30-base presso il sito di fusione. Nella seconda fase (2nd PCR), PCR viene eseguita con gli iniettori PCR annidati utilizzando i tre frammenti amplificati da 1st PCR come modelli. Le regioni complementari dei modelli sono inoltre collegate tra loro tramite la 2nd PCR. Infine, il costrutto per ricombinazione omologa è stato introdotto al ceppo selvaggio-tipo di elettroporazione. Successo del gene può essere verificato mediante PCR utilizzando primers specifici. Anche se il costrutto di rottura è amplificato utilizzando ad alta fedeltà della polimerasi del DNA, ulteriori reazioni enzimatiche, come la legatura del DNA o digestione del DNA, non sono necessari per generare il costrutto. Inoltre, una regione eliminata o conservata sul genoma può essere scelti in modo flessibile secondo il disegno dell'iniettore.
Nel presente lavoro, l'eliminazione di intera regione di codificazione del gene gtfC , che codifica glucosiltransferasi in Streptococcus mutans, è stata eseguita per illustrare il metodo di rottura rapida, facile gene in una specie streptococciche. Inoltre, un gtfB-ceppo interrotta è stato generato nello stesso modo. Il glucosyltransferases codificati da sia gtfC e gtfB contribuiscono a cariogeni biofilm dentale sviluppo5,6. Le abilità che formano biofilm del selvaggio-tipo di ceppo (S. mutans WT), gtfC-interrotto ceppo (S. mutans ΔgtfC) e gtfB-ceppo perturbato (S. mutans ΔgtfB) sono stati valutati per analisi fenotipiche comparative. Questo protocollo si estende l'applicazione di un metodo in due fasi per rottura del gene ad un'altre specie e può essere modificato per gli studi di funzione del gene in una gamma più ampia di taxa.
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Protocol
1. primer Design
- preparare primer per fusione di 2-step PCR e verifica della rottura del gene.
Nota: La tabella 1 Mostra le sequenze dell'iniettore utilizzate nel presente protocollo. la figura 1 Mostra un'illustrazione schematica del metodo PCR 2-passo fusione utilizzato per generare S. mutans Δ gtfC.- Primer design per la sostituzione dell'area di destinazione del genoma con la spectinomicina-resistenza gene (spc r) 7. Questo protocollo sostituisce l'intera regione di codificazione del gene di gtfC con spc r.
- Sono 15 basi complementari alle estremità superiore e inferiore del spc r al 5 ' regioni di up-reverse e giù-forward primer, rispettivamente. Analogamente, includere 15 basi complementari all'estremità inferiore delle regioni fiancheggianti a Monte del gtfC e l'estremità superiore delle regioni fiancheggianti a valle di gtfC al 5 ' regioni del spc r-avanti e spc r -reverse primer, rispettivamente ( Figura 1A).
Nota: Sequenze di up-reverse, giù-avanti, spc r - forward e spc r - reverse primer vengono determinate automaticamente a seconda del sito di incorporazione del costrutto rottura. - Design i up-forward e giù-reverse primer comporta > 1-kb a Monte e a valle delle regioni fiancheggianti del gene gtfC, rispettivamente. Impostare la temperatura di fusione (T m) di up-avanti e giù-reverse primer secondo la temperatura di fusione di up-reverse e giù-forward primer, rispettivamente ( Figura 1A).
Nota: Fare riferimento alla seguente formula per determinare T m: T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, dove * N rappresenta il numero di nucleotidi di primer con l'identità specificata (A, T, C o G). - Disegnare primers nidificati (N_up-forward e reverse-N_up) per la 2 nd PCR ( Figura 1B).
Nota: Anche se la coppia di primer ultraperiferiche (up-forward e giù-reverse) può essere usata come primer per la 2 nd PCR, primer nidificati (N_up-forward e reverse N_up) sono stati progettati in questo protocollo. Primer nidificati sono frequentemente richiesti per la 2 nd PCR, come dettagliato nei Risultati rappresentante. - Primer design specifici per spc r. Gli iniettori sono utilizzati per PCR della Colonia alla schermata per rottura gtfC. Rottura di
- primer design per la verifica di gtfC.
Nota: I prodotti della PCR amplificati usando questi iniettori straddle al confine tra gtfC o spc r e a Monte o a valle delle regioni fiancheggianti del gtfC. I set di primer ' gtfC up-forward e gtfC up-reverse ' e ' gtfC giù-avanti e gtfC giù-reverse ' sono specifici per gtfC, e ' gtfC up-forward e spc r 2 -inverso ' e ' spc r 2-forward e gtfC giù-reverse ' sono specifici per spc r.
2. Estrazione del DNA genomico da S. mutans
s- stock Streak mutan S. UA159 su una piastra di agar di cervello cuore infusione (BHI). Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.
- Pick up una singola Colonia utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e inoculare esso in 5 mL di brodo BHI. Incubare la coltura della S. mutan durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.
- Centrifugare la coltura delle cellule batteriche per 15 min 2.000 × g. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di tampone fosfato salino (PBS).
- Centrifuga per 15 min a 2.000 × g. Risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di PBS.
- Estrarre il DNA genomico dalla sospensione utilizzando un kit di estrazione tallone-pestaggio-base genomic del DNA secondo le istruzioni fornite dal produttore.
- Trasferimento la sospensione ad un campione di 2,0 mL tubo contenente microsfere di vetro (inclusi nel kit). Aggiungere 750 µ l di soluzione di lisi (incluso nel kit) per la sospensione cellulare.
- Richiudere ermeticamente e posizionare i tubi simmetricamente in supporto del tubo dell'apparato di rottura della perla-pestaggio. Processo alla velocità massima per 5 min. Centrifugare il branello-battuti i campioni per 1 min 10.000 × g. trasferire il surnatante al filtro spin (incluso nel kit) in una provetta da 2,0 mL e centrifugare per 1 min 7.000 × g .
- Aggiungere 1.200 µ l di DNA binding buffer (incluso nel kit) per il filtrato. Trasferire 800 µ l della miscela per la colonna di spin (inclusa nel kit), un tubo di raccolta di 2,0 mL e centrifugare per 1 min 10.000 × g.
- Scartare il flusso continuo, aggiungere 200 µ l di tampone pre-lavaggio (incluso nel kit) nella colonna di spin per lavare la matrice di colonna e centrifugare per 1 min a 10.000 × g. gettare il flusso continuo, aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio (incluso nel kit) alla rotazione colonna di lavare la matrice colonna e centrifugare per 1 min a 10.000 × g.
- Collocare la colonna di spin in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 100 µ l di tampone di eluizione (incluso nel kit) alla matrice colonna.
- Centrifuga per 30 s a 10.000 × g per eluire il DNA genomic. Stimare la concentrazione del DNA e la purezza misurando l'assorbanza a 260 nm e 280 nmusing uno spettrofotometro e confermare che il rapporto di 280 A 260 /A è superiore a 1,8.
3. L'amplificazione di PCR
- eseguire la 1 st PCR usando il genoma di s WT S. mutan e il gene sintetico spc r come modelli PCR (Vedi tabella 1). Amplificare la regione di fiancheggiamento a Monte del gene gtfC, la regione di fiancheggiamento a valle del gene gtfC e il gene di spc r utilizzando i tre insiemi degli iniettori descritti sopra ( Figura 1A), come per Tabella 2 e tabella 3.
Nota: Gli iniettori PCR, reagenti e cicli di amplificazione sono riassunti nella tabella 1, tabella 2 e tabella 3, rispettivamente. - Frazionare ogni prodotto PCR su un gel di agarosio 1% ed asportare le bande corrispondenti usando una fresa di banda gel.
- Purificare ogni prodotto amplificato di DNA dai gel utilizzando un kit di estrazione spin gel a base di membrana di silice e colonna -.
- Trasferimento le fette del gel per una microcentrifuga pulita provetta e mescolano con 500 µ l di binding buffer (incluso nel kit). Incubare la miscela a 55 ° C per 15 minuti, finché le fette del gel sono completamente dissolte.
- Sistemare la colonna di spin (inclusa nel kit) in una provetta di raccolta (inclusa nel kit), caricare il campione sulla colonna di spin e centrifugare per 30 s a 11.000 × g. Scartare il flusso continuo, aggiungere il 600 µ l di tampone di lavaggio (incluso nel kit) alla colonna Spin per lavare la membrana di silice e centrifugare per 30 s a 11.000 × g.
- Eliminare il flusso continuo e centrifugare per 2 min 11.000 × g per asciugare la membrana di silice.
- Posto nella colonna di selezione in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere 50 µ l tampone di eluizione (incluso nel kit) e incubare a temperatura ambiente per 2 min.
- Centrifugare per 2 min 11.000 × g per eluire il DNA amplificato. Stimare la concentrazione del DNA e la purezza misurando l'assorbanza a 260 nm e 280 nmusing uno spettrofotometro e confermare che il rapporto di 280 A 260 /A è superiore a 1,8.
- Eseguire la 2 nd PCR di fusione 2-step PCR utilizzando i tre frammenti circa equimolari come modelli PCR, secondo tabella 2 < /stRong > e tabella 3.
Nota: Questi frammenti sono stati amplificati e impiombata utilizzando i primers nidificati ' N_up-forward e reverse-N_down ' o gli iniettori ultraperiferiche ' up-forward e giù-reverse ' ( Figura 1B). Gli iniettori di PCR, reagenti e cicli di amplificazione sono riassunti nella tabella 1, tabella 2 e tabella 3, rispettivamente. - Caricare un decimo della miscela di reazione PCR (5 µ l) su un gel di agarosio 0.8% e confrontare la dimensione di banda amplificato con la dimensione di banda prevista per confermare la generazione del amplicon appropriato ( Figura 1).
- Concentrare il prodotto PCR finale restante mediante precipitazione dell'etanolo senza purificazione.
- Aggiungere 55 µ l di ultra-puro dell'acqua alla miscela PCR rimanente per regolare il volume totale a 100 µL.Add un volume di un decimo di 3M sodio acetato (10 µ l), pH 5.2, seguita da 2,5 volumi di etanolo al 100% (250 µ l). Mescolare e congelare per 30 min a -80 ° C.
- Centrifugare per 20 min 15.000 × g a 4 ° C, controllare il precipitato sul fondo della provetta e scartare il surnatante. Lavare la pallina con 1 mL di etanolo al 70%, centrifugare per 5 min 15.000 × g a 4 ° C e scartare il surnatante. Asciugare il pellet per circa 30 min e si dissolvono con 10 µ l di acqua ultra-pura.
4. Preparazione di cellule competenti e trasformazione cellulare
- stock Streak mutan S. s UA159 su una piastra di agar BHI. Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.
- Pick up una singola Colonia utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e inoculare esso in 5 mL di brodo BHI. Incubare la coltura della S. mutan durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.
- Trasferire 2 mL della cultura s s. mutan a 50 mL di brodo BHI e incubare per 6-8 h a 37 ° C per densità ottica a 600 nm (OD 600) di 0.2-0.4 in condizioni anaerobiche.
- Centrifugare le cellule per 15 min a 2.000 × g a 4 ° C, scartare il surnatante e lavare le cellule due volte con 40 mL di acqua ghiacciata, seguita da 40 mL di glicerolo al 10%.
Nota: Sostanze residue influire sulle successiva elettroporazione. - Aspirare il supernatante accuratamente con una pipetta Pasteur come si riduce l'aderenza del pellet cellulare in glicerolo al 10%. Risospendere le cellule in 1 mL di glicerolo al 10% fresco, dispensare 50 µ l della sospensione in ciascuna provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C fino a poco prima dell'uso.
- Mescolare l'aliquota di 50 µ l di cellule competenti ghiacciate con 5 µ l del costrutto di rottura sopra descritto al punto 3. Aggiungere la miscela di cuvette di elettroporazione (con una distanza di 0,2 cm tra gli elettrodi). Impiegare la modalità di Staphylococcus aureus (1.8 kV, Ω 600, 10 µF, 1 impulso) dell'apparato di elettroporazione per electroporate.
- Sospendere le cellule in 500 µ l di brodo BHI immediatamente dopo l'elettroporazione e aggiungere 50 µ l della sospensione di piastre di agar BHI contenenti spectinomicina.
Nota: Incubazione Extra tempo dopo elettroporazione non è necessaria. Tuttavia, incubazione per 1-2 h dopo l'elettroporazione può migliorare l'efficienza di trasformazione. - Incubare la piastra per 2-6 giorni a 37 ° C in anaerobiosi.
Nota: S. mutans Δ gtfB è costruito come descritto sopra. L'intera regione di codificazione del gene di gtfB viene sostituito con l'eritromicina resistenza gene 8 in S. mutans Δ gtfB. Ogni sforzo di S. mutans è coltivato in brodo BHI a 37 ° C in anaerobiosi.
5. Verifica della rottura del Gene e deposito
- Pick casuale colonie e inoculare loro nella miscela PCR per eseguire PCR secondo la tabella 2 e tabella 3 della Colonia. Gli iniettori di PCR, reagenti e cicli di amplificazione sono riassunti nella tabella 1, tabella 2 e tabella 3, rispettivamente.
- Caricare la miscela di reazione PCR su un gel di agarosio all'1% per confermare la spc r-banda specifica DNA.
- Scegliere la Colonia positiva utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e sottocultura cellule in 10 mL di spectinomicina-contenente BHI brodo per 2 giorni a 37 ° C in anaerobiosi.
- Verificare la generazione di S. mutans Δ gtfC.
- Dividere in parti uguali la sospensione cellulare. Estrazione del DNA genomico dalle cellule sopra descritte (passi 2.3. a 2.5.5.). Eseguire PCR con DNA genomico come il modello PCR, utilizzando primers per la verifica di gtfC rottura (tabella 1) secondo la tabella 2 e tabella 3.
Nota: Il primer PCR, reagenti e cicli di amplificazione sono riassunti nella tabella 1, tabella 2 e tabella 3, rispettivamente. - La miscela PCR su un gel di agarosio al 2% di carico e confrontare la dimensione di banda amplificato con la dimensione di banda prevista per confermare la generazione del amplicon appropriato .
- Centrifugare la sospensione delle cellule rimanenti per 15 min a 2.000 × g a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS.
- Centrifuga per 15 min a 2.000 × g a 4 ° C. Risospendere la cella a pellet in 1,5 mL di brodo BHI contenente 25% glicerolo e conservare a-80 ° Cor -20 ° C.
- Dividere in parti uguali la sospensione cellulare. Estrazione del DNA genomico dalle cellule sopra descritte (passi 2.3. a 2.5.5.). Eseguire PCR con DNA genomico come il modello PCR, utilizzando primers per la verifica di gtfC rottura (tabella 1) secondo la tabella 2 e tabella 3.
6. L'analisi fenotipica
- striscia ogni S. mutan ceppo s su una piastra di agar BHI. Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.
- Pick up una singola Colonia utilizzando uno stuzzicadenti sterilizzato e inoculare esso in 2 mL di brodo BHI con o senza un antibiotico appropriato. Incubare per una notte a 37 ° C in anaerobiosi.
- Inoculare 20 µ l della sospensione di cultura durante la notte in 2 mL di brodo BHI contenente 1% o 5% di saccarosio senza antibiotici in una provetta di vetro; cultura le cellule con la provetta in posizione inclinata durante la notte a 37 ° C in anaerobiosi.
- Vortex il vetro provette per 10 s e decantare sospensioni di cultura. Lavare le provette tre volte con acqua distillata. Aggiungere 1 mL di 0,25% Coomassie brilliant blue (CBB) a macchiare il biofilm sulle pareti della provetta e poi incubare per 1 min.
- Decantare la soluzione colorante, lavare le provette tre volte con acqua distillata e asciugare le provette.
- Valutare la densità e la estensione del CBB macchiato-biofilm visivamente per determinare la capacità di formare biofilm in un'analisi fenotipica.
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Representative Results
La figura 2 Mostra che la dimensione di ciascun prodotto dal 1st PCR, come osservato su gel di agarosio all'1%, era in buon accordo con la dimensione prevista di circa 1 kb. La figura 3 Mostra l'analisi di elettroforesi del gel dei prodotti della 2nd PCR. La figura 4 Mostra S. mutans colonie trasformate con il costrutto di rottura e un'analisi di elettroforesi del gel dei prodotti di PCR di Colonia. Gli ampliconi di tutte le colonie erano della dimensione prevista. La figura 5 Mostra i siti di primer-associazione per la verifica di gtfC disagi e gel elettroforesi dei prodotti di PCR. I prodotti PCR ottenuti dall'amplificazione utilizzando il set di primer specifico gtfC-sono stati confermati in S. mutans WT, ma non in S. mutans ΔgtfC, considerando che i prodotti di PCR ottenuti nell' spcr-specifiche set di primer sono stati confermati in S. mutans ΔgtfC, ma non in S. mutans WT Figura 6 Mostra la capacità di formare biofilm saccarosio-derivato di ogni ceppo di S. mutans . Un biofilm aderente era formata da S. mutans WT in presenza di saccarosio; la capacità di formare biofilm aderente di S. mutans ΔgtfB era più bassa di che dello S. mutans WT S. mutans ΔgtfC hanno esibito la formazione di biofilm aderente molto basso in presenza di saccarosio.
Figura 1:Strategy per la fusione di 2-step PCR. Un'illustrazione schematica di S. viene illustrata mutans ΔgtfC costruzione. Le lunghezze di gene non sono in scala. (A) a Monte e a valle delle regioni della gtfC e spcr fiancheggianti loci sono stati amplificati dalla PCR. I siti di legame del primer nel modello sono indicati da motivi identici. (B) la seconda fase PCR è stata effettuata usando (come modelli) i 3 frammenti che sono stati amplificati nel primo passaggio PCR con primer nidificati. (C) il costrutto di rottura è stato ottenuto per ricombinazione omologa in ceppi batterici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Elettroforesi rappresentativo dei prodotti dal 1st PCR. Ampliconi della regione di fiancheggiamento a Monte di gtfC e regione fiancheggiante a valle di gtfC e spcr sono mostrati. M: marcatore molecolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: elettroforesi del gel rappresentativo dei prodotti dalla 2nd PCR. Prodotti amplificati con i primer nidificati e i primer ultraperiferiche sono mostrati. La tinta freccia indica la dimensione prevista del costrutto rottura. M: marcatore molecolare.
Figura 4: Screening per gtfC interruzione da parte di Colonia PCR (A). Colonie di S. mutans sulla piastra BHI agar contenente spectinomicina; ogni numero cerchiato indica Colonia ID. (B) elettroforesi rappresentante di prodotti di PCR di Colonia; ogni numero cerchiato corsia indica l'ID corrispondente di Colonia in Figura 4A. M: marcatore molecolare, WT: selvaggio-tipo DNA genomic utilizzato come modello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Verifica della rottura gtfC mediante PCR. Siti di legame per Primer (A) ; lunghezza del gene non è in scala. PCR è stata effettuata usando il DNA genomic di S. mutans come modello. Set di primer: gtfC up-forward e gtfC up-reverse (specifico per gtfC); gtfC giù-avanti e gtfC giù-reverse (specifico per gtfC); gtfC up-forward e spcr2-reverse (specifico per spcr); spcr2-forward e gtfC giù-reverse (specifico per spcr). (B) elettroforesi rappresentativo dei prodotti di PCR; ogni numero cerchiato corsia indica il primer corrispondente impostato in Figura 5A. Una singola immagine elettroforetica è diviso per etichettare le bande dell'indicatore. M: marcatore molecolare (scala 100-accoppiamenti). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: analisi fenotipica basata sullo sviluppo di biofilm. Saccarosio-derivato biofilm formato da ogni ceppo di S. mutans erano macchiati con brillante di Coomassie. WT: S. mutans WT, ΔgtfB: S. mutans ΔgtfB, ΔgtfC: S. mutans ΔgtfC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Coppia di primer | Sequenza (5' a 3') | Dimensione della banda previsto (bp) | |
| 2-step PCR per rottura gtfC | |||
| 1 ° PCR | |||
| up-avanti up-reverse |
AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA |
1.036 | |
| SPCr-avanti SPCr-inverso |
ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT |
1.188 | |
| giù-avanti giù-reverse |
AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
1.059 | |
| 2 ° PCR | |||
| N_up-avanti N_down-reverse |
TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3.132 | |
| Verifica di rottura gtfC | |||
| PCR della Colonia per lo screening | |||
| S _spcr-avanti S _spcr-inverso |
GGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAG | 535 | |
| Verifica finale | |||
| gtfC up-avanti gtfC up-reverse |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG |
498 | |
| gtfC giù-avanti gtfC giù-reverse |
GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
557 | |
| gtfC up-avanti spcr2-reverse |
Descritto in precedenza CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
641 | |
| spcr2-avanti gtfC giù-reverse |
GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG Descritto in precedenza |
623 | |
| Reagente | Concentrazione delle soluzioni di riserva | Volume | Concentrazione finale |
| DNA polimerasi premix | 2 × | 25 ΜL | 1 × |
| Forward primer | 5 ΜM | 2 ΜL | 0,2 ΜM |
| Reverse primer | 5 ΜM | 2 ΜL | 0,2 ΜM |
| Modello del DNA | Variabile | Variabile | Variabile * * * * * * |
| Acqua deionizzata | - | fino a 50 μL | - |
Tabella 2: Reagenti PCR. * Per 1st passo PCR; 100 ng. * * Per 2nd PCR; ogni 30-50 ng di 1 degli ampliconi PCR del passaggio dist . Per Colonia PCR; Aggiunta diretta di cellule batteriche alla miscela di reazione.
| Passaggio di ciclo | Temperatura | Tempo | Numero di cicli |
| Denaturazione iniziale | 98 ° C | 2 min | 1 |
| Denaturazione Ricottura Estensione |
98 ° C 55 ° C 72 ° C |
10 s 5 s Amplicon dipendente (1 min/1 kbp) |
35 |
| Estensione finale | 72 ° C | Amplicon dipendente (1 min/1 kbp) |
1 |
Tabella 3: Cicli di amplificazione di PCR.
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Discussion
Nel presente protocollo, i primers per la 1st PCR devono essere progettati per amplificare circa 1 kb a Monte e a valle delle regioni fiancheggianti del regione di destinazione nel genoma. Tali sequenze fiancheggianti lungo sono necessari per migliorare l'efficienza di ricombinazione omologa.
Le sequenze dei primer (up-reverse, giù-avanti, spcr-avanti e spcr-inversa) in questo protocollo sono stati automaticamente determinati basato sul sito di incorporazione del costrutto rottura. Ogni primer include 15 basi complementari alla fine del modello 2nd PCR alla regione 5'. Un sito di legame più lungo consente una produzione più efficiente del costrutto rottura. L'inclusione di almeno 10 basi complementari alla regione 5' di ogni primer è consigliata9.
Primer nidificati (N_up-forward e reverse N_up) sono stati utilizzati per la 2nd PCR, piuttosto che i primer ultraperiferiche (up-forward e giù-reverse). L'uso degli iniettori ultraperiferiche per la 2nd PCR è utile in alcuni casi; amplificazione di successo del costrutto rottura per S. mutans ΔgtfB è stata ottenuta utilizzando i primer ultraperiferiche (dati non mostrati). Tuttavia, l'uso degli iniettori ultraperiferiche per il passo PCRnd 2 provoca frequentemente insufficiente amplificazione di PCR, come mostrato nella Figura 3. L'uso degli iniettori annidati è stata trovata per risolvere questo problema9. Quando il costrutto di rottura non è sostanzialmente amplificato anche utilizzando i primer nidificati, tuttavia, riprogettazione dei primer utilizzati nella PCR 1 ° può essere richiesto.
PCR della Colonia consente conveniente screening del ceppo gene-interrotto. Primer di sequenze conosciute può essere applicato per la generazione del ceppo gene-interrotto tramite spcr. L'elettroporazione è stata usata per l'introduzione di costrutti di rottura in S. mutans WT, come l'efficienza di trasformazione raggiunta usando elettroporazione è generalmente superiore a quello permesso da altre procedure. Trasformazione con siero equino o siero equino con peptidi competenza-stimolante, è ampiamente accettata in Streptococcus10,11,12. Anche se un'apparecchiatura di elettroporazione è necessaria, le procedure, quali la preparazione competente delle cellule, sono molto più semplici rispetto a quelli alternativi metodi10,11. Inoltre, l'elettroporazione è consigliabile dal punto di vista del benessere degli animali.
Il presente protocollo è applicabile a più rottura del gene, a seconda i numeri marcatori di ofantibiotic. Per generare sia gtfC- e gtfB-perturbato ceppi di S. mutans , ad esempio, il costrutto di DNA per gtfC-rottura costruita dalla PCR 2-step può essere trasformata in S. mutans ΔgtfB. Perché gtfC e gtfB sono adiacenti in questo caso, S. mutans ΔgtfC e S. mutans ΔgtfB genomi devono essere utilizzati come modelli per la PCR 2-passo per mantenere le sequenze omologhe per omologa ricombinazione. Infatti, doppio gene-interrotto S. mutans ceppo è stato costruito in precedenza da questo protocollo n.9.
Il presente protocollo per rottura del gene in S. mutans può essere adattato per la generazione di ceppi gene-interrotto di varie specie. Questo protocollo non richiede il passaggio di clonazione di gene coinvolto nei protocolli convenzionali. Inoltre, la PCR è l'unica reazione enzimatica necessaria; Pertanto, i vettori plasmidici, Escherichia coli, ligasi ed enzimi di restrizione non sono necessari. Inoltre, il presente protocollo offre una maggiore flessibilità in termini di design del costrutto rottura, come il design di costrutto è indipendente dei siti degli enzimi di limitazione del gene target. I ricercatori possono determinare regioni che vengono eliminate o conservate nel genoma di progettare il reverse primer per l'amplificazione delle regioni fiancheggianti a Monte e il forward primer per l'amplificazione delle regioni fiancheggianti a valle. Queste delle regioni fiancheggianti sono immediatamente a Monte e immediatamente a valle della regione di DNA desiderato per l'eliminazione, rispettivamente. Tale flessibilità può essere utilizzata per diminuire influenze esterne, quali effetti polari, sull'espressione di geni prossime.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla società Giappone per la promozione della scienza [Grant numeri 16 K 15860 a T.M. e 15 K 15777 di N.H.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
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