Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem
Summary
Nós descrevemos um método fácil, rápido e relativamente barato para a geração de gene-interrompeu Streptococcus mutans cepas; Esta técnica pode ser adaptada para a geração de linhagens gene-interrompido de várias espécies.
Abstract
Métodos típicos para a elucidação da função de um gene específico envolvem análises comparativas de fenotípicas de uma estirpe em que o gene de interesse foi interrompido e a estirpe selvagem-tipo. Uma construção de DNA do gene-interrupção contendo um gene marcador de resistência a antibióticos adequados é útil para a geração de linhagens gene-interrompido em bactérias. No entanto, métodos de construção convencional, que exigem etapas clonagem de gene, envolvem protocolos complexos e demorados. Aqui, um método relativamente fácil, rápido e econômico para ruptura do gene alvo de Streptococcus mutans é descrito. O método utiliza uma fusão 2-passo da cadeia polimerase (PCR) para gerar a construção de perturbação e eletroporação para transformação genética. Este método não requer uma reação enzimática, além do PCR e além disso, oferece maior flexibilidade em termos do projeto de construção de interrupção. Emprego de eletroporação facilita a preparação de células competentes e melhora a eficiência de transformação. O método atual pode ser adaptado para a geração de linhagens gene-interrompido de várias espécies.
Introduction
Análise de função do gene normalmente envolve uma comparação fenotípica entre uma estirpe selvagem-tipo e uma tensão em que um determinado gene de interesse foi interrompido. Esta técnica de gene-interrupção tem sido utilizada para análises de função do gene em uma ampla gama de táxons, de bactérias a mamíferos. Uma construção de gene-interrupção é necessária para a geração da estirpe gene-interrompido; Essa construção de Ácido desoxirribonucleico (DNA) consiste no gene marcador de resistência aos antibióticos fundido para o upstream e downstream flanqueiam regiões do gene alvo e é incorporada no genoma da através de recombinação homóloga. A estirpe de gene-interrompido pode ser isolada usando meios selectivos, que contém o antibiótico. O método convencional, usado para a construção da estirpe gene-interrompeu requer etapas complexas, tais como a amplificação do gene do alvo por reação em cadeia da polimerase (PCR), ligadura do gene em um plasmídeo adequado, digestão com restrição enzimas e religation para inserir o gene marcador de resistência a antibióticos. Este processo é demorado, levando vários dias a várias semanas, dependendo do sucesso de cada etapa. Além disso, o design das construções de interrupção é dependente os enzima de restrição de sites do gene do alvo. Para resolver esses problemas, têm sido relatados baseados em PCR DNA emenda métodos1,2 para a concepção de gene-interrompeu mutantes de Dictyostelium discoideum3 e Synechocystis SP. PCC68034 . No presente estudo, foi desenvolvido um método para gerar uma cepa estreptocócica gene-interrompido de forma relativamente rápida, fácil e barata, utilizando um método modificado baseados em PCR (designado 2-etapa fusão PCR) para a construção de interrupção construção e eletroporação para transformação genética.
A fusão de 2-step que PCR requer DNA genômico, o gene marcador de resistência aos antibióticos como um modelo PCR e quatro pares de adequadamente projetado primeiras demão do oligonucleotide. Na primeira etapa (1st PCR), uma região flanqueando upstream de 1 kb do gene alvo, uma região flanqueando a jusante de 1 kb do alvo gene e do gene marcador de resistência a antibióticos são amplificados por PCR. As regiões 5′ do primer o reverso e o primer para a frente, para a amplificação da montante e a jusante flanqueiam regiões, respectivamente, incluem 15 bases complementares às extremidades do gene marcador. As regiões 5′ da frente e verso de primers para amplificação do gene marcador similarmente incluem 15 bases complementares para a extremidade inferior da região flanqueando montante do gene do alvo e a extremidade superior da região flanqueando a jusante do gene alvo, respectivamente. Portanto, os três fragmentos amplificados contêm regiões sobrepostas de 30 pares de base no local de fusão. Na segunda etapa (2nd PCR), PCR é realizado com iniciadores de PCR aninhados usando os três fragmentos amplificados pelo 1st PCR como modelos. As regiões complementares dos modelos são adicionalmente ligadas uns aos outros através de 2nd do PCR. Finalmente, a construção por recombinação homóloga é introduzida para a estirpe selvagem-tipo por eletroporação. Interrupção de gene bem sucedido pode ser verificada por PCR utilizando primers específicos. Embora a construção de interrupção é amplificada usando DNA polimerase de alta-fidelidade, reações enzimáticas adicionais, tais como a ligadura de DNA ou digestão de DNA, não são necessárias para gerar a construção. Além disso, uma região excluída ou preservada no genoma pode ser flexivelmente escolhida de acordo com o projeto da primeira demão.
No presente trabalho, realizou-se a exclusão de toda a região de codificação do gene esferoplastos , que codifica o glucosyltransferase de Streptococcus mutans, para demonstrar o método de interrupção rápida, fácil de gene em uma espécie de estreptococos. Além disso, um Ionization-tensão interrompida foi gerado da mesma maneira. Os glucosyltransferases codificados por esferoplastos e Ionization contribuir para65,desenvolvimento do biofilme dental cariogênica. As habilidades de formação de biofilme do selvagem-tipo tensão (S. mutans WT), esferoplastos-interrompeu a estirpe (S. mutans Δesferoplastos) e o Ionization-tensão interrompida (S. mutans ΔIonization) foram avaliados para análises comparativas fenotípicas. Este protocolo amplia a aplicação de um método de duas etapas para interrupções no gene de uma espécie de adicional e pode ser modificado para estudos da função do gene em uma escala mais larga dos táxons.
Protocol
Representative Results
Discussion
No presente protocolo, as primeiras demão para o 1st PCR devem ser concebidas para amplificar aproximadamente 1 kb a montante e a jusante flanqueiam regiões da região-alvo no genoma. Tais sequências flanqueando tempo são necessárias para melhorar a eficiência de recombinação homóloga.
As sequências dos primers (reverso de cima, para baixo-forward, spcr-para a frente e spcr-reverso) neste protocolo automaticamente foram determinados …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela sociedade de Japão para a promoção da ciência [Grant Numbers 16 K 15860-T.M. e 15 K 15777 para N.H.].
Materials
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
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