Summary
Denne protokol fungerer som en ordning for oprettelse af en funktionel Tet-ON system i kræft cellelinjer og dens efterfølgende anvendelse, navnlig for at studere rollen af tumor celle-afledte proteiner i rekruttering af monocytter/makrofager at tumor mikromiljø.
Abstract
siRNA og shRNA-medieret banke ned (KD) metoder til regulering af genekspression er uvurderlige værktøjer for at forstå gen- og protein funktion. I det tilfælde, at KD protein af interesse har en dødelig effekt på celler eller den forventede effekt af KD er er tidsafhængig, ubetinget KD metoder ikke passende. Betinget systemer er mere velegnede i disse tilfælde og har været genstand for stor interesse. Disse omfatter Ecdysone-inducerbar overekspression systemer, cytokrom P-450 induktion system1, og tetracyklin reguleret gen expression systemer.
Tetracyklin reguleret gen expression system muliggør reversible kontrol over protein udtryk ved induktion af shRNA udtryk i overværelse af tetracyclin. I denne protokol præsenterer vi en eksperimenterende design ved hjælp af funktionelle Tet-ON system i menneskelige cancer cellelinjer til betinget regulering af genekspression. Vi så vise brugen af dette system i studiet af tumor celle-monocyt interaktion.
Introduction
Tumor forbundet makrofager (TAMs) bidrage til tumor udvikling ved at fremme tumorvækst, metastaser og regulere immunrespons2. Kræftceller rekruttere inflammatoriske monocytter, der infiltrerer tumoren og differentiere sig til pro-tumorfremkaldende TAMs3. Infiltration af tumor med TAMs korrelerer med dårlig klinisk resultat og har været knyttet til rollen immunosuppressive makrofager4,5. Men mekanismer for rekruttering af makrofager at tumor er ikke godt udforsket og en bedre forståelse af de involverede veje er afgørende for videre avancement felt og lovende behandlinger. En af udfordringerne i at studere samspillet mellem kræftceller og normale celler i tumor mikromiljø (TME) er kompleksiteten af de mekanismer og celler involveret, som kræver in vitro- metoder, der tillader dissektion af krydstale. Her præsenterer vi en alsidig metode, der kan anvendes til at undersøge den paracrine virkning af en kræft celle-afledte, udskilles protein migration af andre celletyper som makrofager, in vitro. Bruger et system hvor udtrykket af shRNA mod en kræft celle-afledte protein involveret i ansættelse af monocytter er under kontrol af tetracyklin inducerbar promotor, er paracrine effekten af udskilles protein på monocytter quantitated. I denne protokol efterfulgt kloning af shRNA sekvenser til tetracyklin regulerede vektor præsenteres af generation af stabil kræft cellelinjer. Yderligere, rensning af primære humane monocytter og en Boyden kammer analysen bruges til at analysere paracrine effekten af en kræft-celle afledte protein migration af monocytter.
Downregulation af protein kodende gener er almindeligt anvendt med siRNA og shRNA teknikker, dog ikke uden begrænsninger i dets anvendelse. Den langsigtede knock-down (KD) af gener kan fremkalde sekundære adaptive responser af celler, der interfererer med eksperimentelle resultater. Manglende tidsmæssig kontrol over genekspression gør det udfordrende at studere et protein dynamisk rolle over tid eller rollen som et protein, der er afgørende for celle overlevelse. Dette spørgsmål er især vigtigt i i vivo indstillinger, hvor rollen som et protein i tumor udvikling og progression kan kræve downregulation af udtryk for protein af interesse kun efter at tumor er etableret. Betinget KD har fordelen at forhindre en for tidligt dødelige virkning af KD på celler og for at aktivere analyse af rollen, som proteinet i forskellige stadier af tumorvækst, mens ubetinget KD kunne resultere i manglende tumor udvikling.
En række betinget KD systemer er blevet udviklet for at afhjælpe begrænsningerne af stabil KD. Betinget gen expression systemer omfatter Ecdysone-inducerbar overekspression systemer, cytokrom P-450 induktion system1og tetracyklin reguleret gen expression systemer. Tetracyclin-reguleret gen expression systemer giver kontrol over udtryk for shRNA ved tilsætning af antibiotikum tetracyklin (eller dens mere stabil analog - doxycyclin). I Tet-ON systemer, udtryk for shRNA er induceret i overværelse af tetracyklin/doxycyclin resulterer i en genekspression KD, mens i Tet-OFF systemer, udtryk for shRNA er undertrykt i overværelse af tetracyklin resulterer i genekspression. En ulempe ved tetracyklin-inducerbar system er tidligere rapporteret lavt niveau af udtryk for shRNA i mangel af doxycyclin - såkaldte leakiness6,7. I Tet-ON beskrevet system her, efter administration af tetracyclin, binding af constitutively udtrykt tetracyklin repressor (TetR) protein til Tet-responderende element (TRE) rækkefølgen inden for H1 promotor-regionen shRNA af interesse er undertrykt. Dette resulterer i udtryk for shRNA og hæmning af oversættelse af protein af interesse i en tetracyklin-afhængige måde8,9.
Andre tilgængelige Tet-ON systemer omfatter samtidige knock-i af Millie sekvens mellem TATA boks og proksimale sekvens element (PSE) og TATA boks og transskription starte hjemmesiden er udviklet af Chan mfl. 10 dette system kræver mindre end toksiske doser af tetracyklin at regulere shRNA udtryk, dog under en ikke-induceret stat, lave niveauer af shRNA udtrykkes. Krüppel-associerede boks (KRAB) baseret Tet-ON system11 omfatter KRAB, en finger protein, zink, som fag gener ligger inden for en 3 kb række KRAB bindingssted transcriptional undertrykkelse. Kimære protein tTRKRAB kan binde til Millie, og på grund af den store vifte af DNA styrbar kapacitet, Millie ikke skal begrænses mellem transkription starte site og initiativtageren og har lav effekt på aktiviteten af initiativtageren. Under ikke-induceret staten, blev kontrollerbar RNA interferens systemet rapporteret til at vise et lavere niveau af rende udtryk for shRNA11,12; Det kræver dog en sekventiel, to-vektor kloning tilgang. I forhold til tidligere udviklet betinget KD systemer såsom Ecdysone-inducerbar overekspression system eller cytokrom P-450 induktion system, tetracyklin-reguleret system har fordelen af dens robusthed og reversibilitet, og derfor er mest anvendte rutinemæssigt system13. Systemet anvendes i denne protokol har fordel over dobbelt Millie knock-in system og KRAB Tet-ON system som det kræver ligetil, enkelt vektor kloning, giver mulighed for hurtig generation af flere kloner, og det udstiller meget lave niveauer af leakiness i den fravær af doxycyclin.
TME er afgørende for udviklingen af kræft. For at lette tumorvækst, rekruttere kræftceller inflammatoriske monocytter ved at udskille kemotaktisk proteiner. Rekrutterede monocytter infiltrere tumor og differentiere sig til pro-tumorfremkaldende TAMs, der bidrager til tumorvækst og metastaser. In vitro undersøgelser af immun celle rekruttering udnytte migration assays, med Boyden kammer assay er almindeligt brugt14,15,16,17. I denne analyse, er chemoattractant proteinkilde, for eksempel, kræftceller, eller et oprenset protein, placeret i bunden kammer. Immunceller er placeret i den øverste kammer adskilt med porøse membran fra bunden rum. Celler migrerer mod den stigende graduering af chemoattractant, og dem, der findes på den nederste side af membranen er farves og tælles under mikroskop. Her tester vi funktionen chemoattractant af Plasminogen aktivator Inhibitor 1 (PAI-1) på monocytter ved at generere stabile, inducerbar kræft cellelinjer hvor udtryk af PAI-1 er reguleret ved doxycyclin. Vi bruger menneskelige primære monocytter i Boyden kammer migration assay for at vurdere PAI-1 rolle i monocyt migration. Forskelle mellem menneskelige primære monocytter og udbredte monocytic cellelinjer som THP1 er blevet rapporteret og omfatter forskellige cytokin udtryk mønstre18; for eksempel 5-10 fold stigning i TNF-α udtryk niveauer af THP1 celler i forhold til humane monocytter19. THP1 celler er afledt af menneskelige monocytic leukæmiceller, er nemme at vedligeholde, og formere sig med en gennemsnitlig fordobling tid af 19-50 h20. Tværtimod er humane monocytter karakteriseret ved en kort levetid i mangel af vækstfaktorer. Da monocytter er renset fra blod af donorer, en rimelig mængde af variabilitet opstår blandt personerne og afhængigt af metoden rensning forekomme forurening med andre celletyper. Ikke desto mindre primære monocytter er relevante og det er blevet anbefalet at bruge eller bekræfte de opnåede resultater med monocytic celle linjerne ved hjælp af primære monocytter i biologiske forskning19. Her beskriver vi en protokol til rensning af menneskelige primære monocytter fra perifert blod. Alternative metoder til monocyt rensning omfatte tæthed farveforløb og vedhæftning protokoller og to-trins procedure med enkelt forløb af Ficoll-Hypaque efterfulgt af en Percoll gradient21. Renhed af befolkningens monocyt fremstillet ved disse metoder varierer mellem 70-90%. Metoden beskrevet her bruger en tæthed farveforløb efterfulgt af en negativ immun udvalg22 og muliggør rensning af humane monocytter uden direkte kontakt med antistoffer, derved undgår deres utilsigtet aktivering og resulterer i en > 95% ren population af monocytter.
Protokollen præsenteres her bruges til at konfigurere en funktionel Tet-ON system for genekspression KD i menneskelige cancer cellelinjer til at undersøge chemoattractant virkningen af kræft-afledte udskilles protein PAI-1 på monocytter. PAI-1 er overexpressed af en bred vifte af tumorer og sit udtryk paradoksalt nok korrelerer med dårlig klinisk resultat23,24. Den pro-tumorfremkaldende rolle af PAI-1 er et resultat af sine pro-angiogene og anti-apoptotiske fungerer25,26. PAI-1 har vist sig at bidrage til betændelse ved at fremme rekrutteringen af makrofager til stedet for betændelse27. PAI-1 blev vist sig at fremme glatte muskulatur cellmigration28,29 og til at deltage i Mac-1 afhængig af makrofag migration30. PAI-1 overekspression har også vist sig at signifikant øge rekrutteringen af Raw 264.7 makrofager ind B16F10 melanom tumorer31. PAI-1 rolle i TAM migration har imidlertid ikke været undersøgt i detaljer. Vi bruger den beskrevne protokol til at besvare spørgsmålet om, hvorvidt PAI-1 tiltrækker monocytter til kræftceller. Denne metode giver dissektion af krydstale mellem tumor og TME ved hæmning af udskilles protein i kræftceller og analysere komponenterne af TME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Afsnittet protokol, der anvender humane monocytter fra raske frivillige følger retningslinjerne fra children's Hospital Los Angeles menneskelige forskning etiske komité og er blevet godkendt af den institutionelle Review Board under den menneskelige materiale Protokol nummer: CCI 08-00208.
1. forberedelse af kræft cellelinjer med tetracyklin-regulerede shRNA udtryk
- Kloning af shRNA PAI-1 i Tet-pLKO-puro vektor 8 , 9
- Design shRNA oligomerer, der indeholder alderjeg og EcoRI kavalergang site på 5'-enden, forstand sekvens, en 6 nukleotid loop og antisense sekvensen.
Bemærk: Typisk oligonukleotider er beregnet som følger: fremad oligo: 5' CCGG - 19-21 bp forstand - CTCGAG - 19-21 bp antisensstoffer - TTTTT, Reverse oligo: 5' AATTAAAAA-19-21 bp forstand - CTCGAG - 19-21 bp antisensstoffer 3'. Detaljeret protokol for oligomer design kan findes i 8. I dette studie 3 shRNA sekvenser mod PAI-1 blev testet for den stærkeste silencing effekt: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333og scrambled33 er inkluderet i tabel 1. - Bind shRNA oligomerer og scrambled shRNA oligomerer.
- Rekonstruere oligonukleotider til 100 µM i vand og Bland 1 µL fremad oligonukleotid, 1 µL omvendt oligonukleotid og 8 µL H2O.
- For at anneal oligonukleotider, bland følgende: 1 µL oligonukleotid blanding, 5 µL buffer 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7,5, 50 mM natriumchlorid (NaCl), 10 mM magnesiumchlorid (MgCl2), 1 mM dithioerythritol (DTE) og 44 µL H 2 O.
- Inkuber blandingen i en polymerase kædereaktion (PCR) termisk cycler ved 95 ° C i 5 min, Sluk apparatet og vente indtil stuetemperatur (RT) er nået.
- Bundfald udglødet oligonukleotider ved at tilføje 5 µL 3 M natriumacetat pH 5,2 til 50 µL udglødet oligonukleotider.
- Tilsæt 100 µL koldt 100% ethanol (EtOH) og Inkuber i 30 min. ved-80 ° C. Der centrifugeres i et benchtop centrifugeres ved maksimal hastighed i 30 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten, tilsættes 500 µL koldt 70% EtOH, centrifugeres i 30 min, Fjern supernatanten, og opløse pellet i 20 µL H2O.
- Vurdere udglødet oligonukleotider koncentration ved spektrofotometri, måling af absorbans på 260 nm. Fortyndet oligonukleotider til den endelige koncentration af 1 ng/µL.
- Forberede Luria Bertani (LB) medium og LB agar plader.
- For LB medium, opløses 10 g trypton, 5 g gær extract, 10 g NaCl i 1 L vand. Justere pH af medium til pH 7,0 bruger 1 N NaOH og autoklave.
- LB agar plader, tilføje 15 g/L af agar i LB medium. Autoklave og køle ned til ca. 50 ° C. Tilføje antibiotikum og hæld pladerne.
- Streak bakterier transduced med Tet-pLKO-puro vektor (Se Tabel af materialer) på LB agar plade suppleret med 100 µg/mL ampicillin og der inkuberes natten over (O/N) ved 37 ° C.
- Podes 100 mL LB medium suppleret med 100 µg/mL ampicillin (LB/ampicillin) med 1 koloni fra pladen og vokse O/N under omrystning ved 37 ° C.
- IsolateTet-pLKO-puro fra 100 mL bakteriekulturen ved hjælp af en plasmid isolering kit.
- Forberede restriktion reaktionen for Tet-pLKO-puro vektor med EcoRI og AgeI-restriktionsenzymer som følger: 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, 5 µL 10 x buffer, 1 µL plasmid DNA (1 µg), 42 µL H2O. Inkubér 1 h ved 37 ° C. For at få nok af kløvet vektor, forberede op til 5 x 50 µL reaktioner.
- Brug 1% agarosegel til at rense kløvet vektoren fra agarosegel ved hjælp af en DNA rensning kit. For at øge udbyttet af DNA, minimere Agarosen til DNA-forholdet i gel ved hjælp af en Agarosen gel kam til store brønde og ved omhyggeligt at fjerne de fleste af Agarosen fra bandet ved hjælp af en skalpel.
- Forberede ligatur mastermix som følger: 1 ng udglødet oligonukleotider, 50 ng kløvet vektor, 2 µL 10 x ligase buffer, 1 µL ligase og vand op til 20 µL. Ligate vektor med udglødet shRNA oligonukleotider på 16 ° C O/N.
- Forbered desuden en negativ kontrol reaktion uden oligonukleotider at tage højde for uncleaved, delvist kløvet og selv sammenskrevne vektor, som vil resultere i falske positive kolonier.
- Bruger standard transformation teknikker, omdanne ligatur blandinger til kemisk kompetente bakterieceller designet til at forhindre homologe rekombination af lentiviral vektorer indeholdende direkte gentagelser.
- Vokse bakterier på plader med ampicillin O/N ved 37 ° C.
Bemærk: Hvis vækst af satellit kolonier opstår, gentage transformationen og vokse bakterier ved 30 ° C til at bremse væksten og dermed forhindre satellit kolonier. - For at kontrollere succes ligatur, vælge mellem 10-20 enkelt kolonier, vaccinere 2 mL LB/ampicillin kulturer og en ampicillin plade som en stock tallerken (skal bruges som en positiv klon senere). Vokse flydende kulturer med ryster O/N ved 37 ° C. Inkuber plade O/N ved 37 ° C.
- Forsegle pladen med parafilm og butik på 6 ° C.
- Isolere plasmid DNA fra flydende kulturer ved hjælp af en plasmid isolering kit.
- Udføre begrænsning analyse af plasmid DNA isoleret fra ampicillin-resistente kolonier ved hjælp af XhoI enzym. For hver klon, forberede de følgende mastermix: 0,5 µL XhoI, 2,5 µL 10 x buffer, 1 µL plasmid DNA (0,5 µg), og 21 µL H2O. Incubate i 1 timer ved 37 ° C. Analysere resultatet af begrænsning reaktion ved at køre reaktionen på en 1%-agarosegel.
Bemærk: Begrænsning analyse af WT vektor kløvet af XhoI vil generere 3 fragmenter: 8,447, 1.800 og 200 bp. Stuffer sekvens i Tet-pLKO-puro vektor af 1.800 bp findes ikke i positiv kloner indeholdende shRNA-PAI-1 og XhoI digest vil resultere i DNA fragmenter af størrelse: 8,447, 190 og 130 bp. Som vist i figur 1, 2.000 bp Fragmentet blev ikke fundet i DNA isoleret fra ampicillin resistente kolonier nummer: 3, 8 og 11. Afhængigt af oligonukleotider design variere længden og antallet af opnåede fragmenter i DNA fra positive kolonier. - Kontrollér korrekt indsættelse af shRNA sekvenserne i Tet-pLKO-puro vektor af sekventering8,9.
- Podes 100 mL LB/Ampicillin kultur med den koloni, der indeholder den korrekte klon og vokse O/N ved 37 ° C.
- Isolere plasmid DNA ved hjælp af en plasmid isolering kit.
- Design shRNA oligomerer, der indeholder alderjeg og EcoRI kavalergang site på 5'-enden, forstand sekvens, en 6 nukleotid loop og antisense sekvensen.
- Generation af lentivirus partikler.
- Coat en 15 cm vævskultur parabol med Poly-L-lysin ved at dække overfladen af fadet med sterilt vand opløsning af 0,01% Poly-L-lysin og inkubere på RT for 15 min. Fjern løsningen ved aspiration og lufttørre retter.
- Frø 5 x 106 menneskelige embryonale nyre 293 celler (HEK293) celler i Poly-L-lysin-belagt 15 cm parabol, og kultur i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) medium suppleret med 10% FBS og 1% Penicillin/Streptomycin mix (Pen/Strep) ved 37 ° C, 5% CO 2 indtil de når 70% confluency.
- For at producere viruspartikler, transfect HEK293 celler med 25 µg pLKO-Tet-på-shRNA, 25 µg psPAX, (emballage plasmid), og 5 µg pMD2.G plasmider (kuvert udtrykker plasmid) ved hjælp af Transfektion reagens.
Bemærk: psPAX og pMD2.G plasmider er en gave fra Didier Trono lab (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Schweiz). - Fremkalde HEK293 celler næste dag ved at ændre mediet til DMEM suppleret med 10 mM natrium butyrat og 20 mM HEPES pH 7,2 og dyrkningsbaserede for 8 h.
- Cellerne vaskes med fosfatbufferet saltopløsning (PBS), og der tilsættes 25 mL frisk DMEM medium indeholdende 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) pH 7,2. Efter inkubation ved 37 ° C for 48 h, omhyggeligt indsamle virus-holdige medium af pipettering; undgå spild.
- Filtrere de indsamlede medium gennem et 0,45 µM sprøjte filter til at fjerne HEK293 celler. Det medium, der indeholder virus partikler kan anvendes straks eller opbevares ved-80 ° C til senere brug.
- Generation af stabilt transfekteret cellelinjer
- Seed HCT116 tyktarmskræft celler og MDA-MB-231 brystkræftceller på 50.000 celler/brønd i DMEM medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% Pen/Strep i en 12-godt plade. Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 indtil celler er 60-70% sammenflydende.
- Vaske cellerne med PBS og tilsættes 1 mL af virus-holdige medium til kræft celler og O/N der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2. Som et kontrolelement, der tilsættes 1 mL af friske DMEM medium suppleret med 10% FBS og 1% Pen/Strep 2 brønde med kræftceller.
- Forsigtigt fjerne virus-holdige medium ved aspiration. Cellerne vaskes med PBS og ændre mediet til DMEM med 10% (v/v) tetracyklin-fri (Tet-fri) FBS og 1% Pen/Strep.
- Efter 72 h, vaske cellerne med PBS og ændre mediet til DMEM 10% Tet-fri FBS 1% Pen/Strep, 1 µg/mL puromycin til markering af virus-transfekteret celler.
- Afhængigt af den cellelinje bruges, justere puromycin koncentration for optimal udvælgelse ved prøvning rækken puromycin koncentrationer (0.1, 0.5, 1, 2 og 5 µg/mL) i ikke-transduced celler og vælge den laveste koncentration, hvor ingen kontrol af cellerne overlever efter 3 dages kultur.
- Vælg virus-transduced celler ved dyrkning af celler i puromycin for 3-14 dage. Som kontrol, forberede to yderligere brønde med ikke-transduced celler, med medium indeholdende puromycin og uden puromycin. Observere delvis drab af celler af puromycin i brønden med virus-transduced celler i forhold til kontrolhullerne.
Bemærk: Ikke transduced celler vil ikke vokse ved tilstedeværelse af puromycin. - Verificere effektiviteten af den betingede KD i puromycin-resistente HCT116 tyktarmskræft og MDA-MB-231 brystkræftceller.
Bemærk: Den effektive koncentration af doxycyclin vil variere med cellelinie anvendes og skal titreres (typisk fra 100 ng/mL til 2 µg/mL).- Bestemme doxycyclin-koncentration, ikke der er giftigt for celler, men effektiv i downregulating udtryk af protein af interesse. I denne protokol blev 1 µg/mL med held anvendte i vitro.
- Kultur celler for 72 h i tilstedeværelse og fravær af 0.1, 1 og 2 µg/mL doxycyclin. Kontrollér niveauet af udtryk af downregulated proteinet (her, PAI-1) i cellen lysate af Western blot analyse. Sammenligne HCT116 og MDA-MB-231 celler betinget udtryk for shRNA til røræg kontrol celler.
- Forberedelse af konditioneret medium
- Frø 1 x 106 celler stabilt transfekteret med doxycyclin reguleret pLKO-shRNA indeholdende lentiviruses i 10 cm retter.
- Vokse cellelinjer i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium 10% Tet-fri FBS og 1% Pen/Strep i fravær og tilstedeværelsen af 1 µg/mL doxycyclin i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO2, tilføje frisk doxycyclin dagligt.
Bemærk: RPMI medium er kompatibel med kultur betingelser af monocytter. Doxycyclin er en lys følsom sammensatte. Beskytte cellekulturer fra lys af dækker med aluminiumsfolie og undgå arbejder under direkte lys eksponering. - Indsamle medium af pipettering, filtreres gennem 0,45 µm filter og fryse ved-80 ° C i delprøver.
2. isolering af monocytter fra humant blod
- Isolere monocytter fra humant perifert blod.
Bemærk: Menneskelige primære monocytter er isoleret fra 7 mL af hvide blodlegemer koncentreret i et leukocyt filter hidrøre fra sunde trombocyt donorer. Afhængigt af donor producerer en leukocyt filter mellem 1 x 109 og 2 x 109 af perifert blod mononukleære celler (PBMC), ca 10% som udgør monocytter.- Forberede arbejdsstation i laminar flow kabinet.
- Sterilisere saks og laminar flow kabinet med ultraviolet lys (UV) i 30 min.
- Spray leukocyt filter med 70% EtOH og lufttørre indersiden laminar flow kabinet.
- Skær begge ender af leukocyt-filter med en saks og tømme indholdet af filteret i en 50 mL tube.
- Fortyndes til 90 mL ved at tilføje PBS, som indeholder 1% (v/v) FBS (PBS/FBS).
- Forbered 3 x 50 mL rør med 15 mL tæthed gradient løsning. Lag langsomt 30 mL PBS/FBS fortyndet blod over tæthed gradient løsning ved hjælp af en pipette controller sætte på gravitationel flow for at undgå blanding af lagene.
- Der centrifugeres i en swing rotor på 400 x g på RT uden bremser i 25 min.
- Bortskaffe det øverste lag og overføre det midterste lag, der indeholder PBMC til en frisk 50 mL tube.
- Tilføje PBS/FBS op til 50 mL og centrifugeres ved 120 x g på RT for 10 min. Fjern supernatanten indeholdende blodplader. Gentag dette trin to gange mere.
- Resuspenderes i 50 mL PBS/FBS og tælle PBMC ved hjælp af en hemocytometer. Der centrifugeres ved 120 x g på RT og resuspenderes i PBS/FBS indeholdende 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) til en endelig koncentration på 5 x 107 celler/mL.
- Brug en negativ udvalg kit til at berige monocytter ved nedbrydning af ikke-monocytic celler.
Bemærk: Negative valg kit bruger en cocktail af antistoffer (CD2 CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 og glycophorin A) mod T celler, NK celler, neutrofiler, B celler, granulocytter og erytrocytter. Antistof-komplekser bindes til overfladen af disse ikke-monocytic celler og dextran magnetiske partikler. Når røret er placeret i en magnet, perlerne overholder væggene i røret og fjerne de ikke-monocytic celler fra løsningen.- Tilsæt 50 µL antistof cocktail til 1 mL af 5 x 107 PBMC/mL, blandes med en pipette, og inkuberes i 10 min. ved RT. tilsættes 50 µL magnetiske perler til PBMC med antistof cocktail, blandes med en pipette og inkuberes i en anden 10 min på RT.
- Tilføje FBS-PBS-EDTA til 25 mL og sted PBMC blandingen i en magnet, der kan rumme en 50 mL tube. Der inkuberes i 10 min. ved RT. magnetiske perler vil holde sig til væggene i røret og lægge beslag på de ikke-monocytic celler fra løsningen.
- Bruger en 25 mL pipette, fjerne den løsning, der indeholder monocytter fra røret i magneten. Pas på at ikke røre siderne af røret med en pipette.
- Centrifugeres løsning på 250 x g på RT og Fjern supernatanten resuspenderes indeholdende monocytter i RPMI medium som indeholder 10% Tet-fri FBS og 1% Pen/Strep.
3. Boyden kammer Migration Assay
- Forberede 1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) løsning ved at opløse 1 g af BSA i 100 mL i ultrarent vand og filtreres gennem et 0,2 µm porestørrelse at sterilisere.
- Inkuber porøse membran skær i 1% sterilt BSA løsning O/N for forbedret overholdelsen af makrofager membranen. Monocytter/makrofager, bruge 5-8 µm pore størrelse skær.
- Fyld en steril vævskultur parabol med 1% BSA løsning og placere indsætter i fadet. Anvende 200 µL 1% BSA løsning inde indsætter.
- Vask indsætter to gange ved at placere dem i en skål, fyldt med steril PBS og anvende PBS inde i filteret.
- Seed 40.000 HCT116 eller MDA-MB-231 celler i 0,5 mL RPMI medium indeholdende 10% Tet-fri FBS og 1% Pen/Strep pr. brønd, i en 24-godt plade i tre eksemplarer. Alternativt kan du placere 0,5 mL af tidligere genererede konditioneret medium i brønden som en kilde til chemoattractant.
- Den næste dag, plade 8.000 monocytter i den forberedte indsætte i 0,3 mL volumen af RPMI medium indeholdende 10% Tet-fri FBS og 1% Pen/Strep, i tre eksemplarer, og der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2.
- Indsamle indsætter efter 48 timer.
Bemærk: Længden af et eksperiment skal optimeres specifikke forhold og celler, der bruges, ved at udføre et tidsforløb eksperiment, hvor skær er indsamlet på forskellige inkuberingstider.- Ryste overskydende medium og netop knalde den indvendige overflade med en bomuld tippes applikator til at fjerne celler, ikke overflyttet.
- Plette den udvendige side af indsætter ved hjælp af metoden Wright-Giemsa.
- Omhyggeligt montere 3 skær/glas dias i en høj viskositet mikroskop nedsænkning olie, og sørg for, at siden af filteret med overflyttede makrofager vender opad.
- Image dias ved hjælp af et lysmikroskop med 20 X mål. Tage billeder af 9 felter/filter. Tælle overflyttede makrofager i 9 felter/filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre shRNA sekvenser blev testet for den mest effektive KD PAI-1. For dette, blev shRNA sekvenser mod PAI-1 og scrambled (tabel 1) klonet i Tet-pLKO-puro udtryk vektor efter den protokol, der er beskrevet ovenfor. HT-1080 fibrosarcoma cellelinje var stabilt transfekteret med genererede konstruktioner og cellerne blev behandlet med doxycyklin i 3 dage. Udtryk af PAI-1 blev bekræftet ved Western blotting ()figur 2A) og intensiteten af de bands, svarende til PAI-1 og tubulin blev analyseret af densitometri. Ved hjælp af de mest effektive KD sekvens (shRNA 2), vi desuden genereret MDA-MB-231 epitelial bryst adenocarcinom celler (figur 2B) og HCT116 colorectal karcinom celler (figur 2 c) stabilt transfekteret med en tetracyklin-regulerede pLKO-shRNA2-PAI-1 udtryk vektor (og shRNA scrambled som kontrol). Vi opnåede et fald på 74% af PAI-1 udtryk i MDA-MB-231 cellelinje (figur 2B) og 17,5% fald i HCT116 cellelinje i overværelse af doxycyclin (1 µg/mL)()figur 2 c) vurderet af Western blotting og densitometric analyse af bands. Boyden kammer assay blev brugt til at kvantificere migration af monocytter mod kræftceller. Vi antager, at kræft celle-afledte PAI-1 fremmer migration af monocytter mod tumorceller, og derfor mindre migration vil observeres når PAI-1 er downregulated ved tilsætning af doxycyclin. Kræftceller blev behandlet med doxycyklin i 3 dage og var seeded i bunden af en 24-godt plade på 40.000 celler/brønd. Renset primære humane monocytter blev anvendt i det øverste kammer af analysen og efter 24 h, monocytter knyttet til bunden af membranen blev farves og tælles under mikroskop. Vi viser, at i mangel af doxycyclin og derfor tilstedeværelsen af PAI-1, i MDA-MB-231 og HCT116 celler (PAI-1 shRNA og scrambled kontrol), markant øget migration af humane monocytter (figur 3). Migration af monocytter blev derefter hæmmes af 33% og 74% når doxycyclin blev føjet til fælles kulturer og produktion af PAI-1 ved tumorceller var nedreguleret (figur 3A, C). Ingen hæmning af monocyt migration blev observeret med tumorceller transduced med røræg shRNA kontrol, som antydede, at doxycyclin havde ingen hæmmende effekt på monocyt migration. Lignende resultater blev opnået når konditioneret medium af doxycyclin-behandlede kræftceller blev placeret i bunden af brøndene som en kilde til chemoattractants (figur 3B, D).
Figur 1 . XhoI begrænsning analyse af DNA ekstraheret fra 16 bakteriel kolonier. DNA blev udvundet fra 16 bakteriel kolonier og udsat for begrænsning reaktion med XhoI enzym. De resulterende DNA fragmenter blev analyseret ved agarosegelelektroforese gelelektroforese. Positive kloner (baner 3, 8 og 11), der mangler 2 kb fragment efter XhoI begrænsning digest er markeret med pile. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Betingede KD af PAI-1 udtryk i kræft cellelinjer. Western blotting analyse af PAI-1 udtryk i cellelinjer stabilt transfekteret med tetracyklin-regulerede pLKO-shRNA-PAI-1 (shRNA 1-3) og forvrænget udtryk vektor efter 3 dage af doxycyclin behandling. (A) HT1080. (B) MDA-MB-231. (C) HCT116. Densitometri analyse af bandene er angivet under baner af Western blots som et forhold af PAI-1 intensitet over tubulin band intensitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . PAI-1 fremmer makrofag migration. Migration af humane monocytter mod (A) MDA-MB-231 og (C) HCT116 celle linjer stabilt transfekteret med vektor betinget udtryk for shRNA 2 mod PAI-1 og scrambled shRNA, målt ved hjælp af Boyden kammer assay. Kræftceller blev behandlet med doxycyklin i 3 dage og seeded i en 24-godt plade i tre eksemplarer. Menneskelige primære monocytter blev anvendt på toppen af indsatsen. Efter 24 timer, var monocytter på den nederste side af filteret farves og tælles under mikroskop. Migration af humane monocytter mod konditioneret medium genereret over 72 h ved (B) MDA-MB-231 og (D) HCT116 cellelinjer betinget udtryk for PAI-1 i tilstedeværelse og fravær af doxycyclin. Data repræsenterer middelværdien af tekniske tre [+/-standardafvigelse (SD)]. For hver replikat blev overflyttede monocytter talt i 9 felter på 20 X objektive forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navnet på Oligo | Sekvens | ||||
| shRNA 1 (anti PAI-1 sekvens 1 - 8 ) | Videresend: | shPAI-1A5' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT 3' | |||
| Omvendt: | shPAI-1B 5' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG 3' | ||||
| shRNA 2: (anti PAI-1 sekvens 2) | Videresend: | shPAI - 1C 5'-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3' | |||
| Omvendt: | shPAI - 1D 5'-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3' | ||||
| shRNA 3 (anti PAI-1 sekvens - 3 9) | Videresend: | shPAI-1E 5'-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3' | |||
| Omvendt: | shPAI-1F 5'-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3' | ||||
| Scramble (scramble sekvens - 4 9) | Videresend: | Forvrænge 1 5'-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3' | |||
| Omvendt: | Scramble 2 5'-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3' | ||||
Bord 1. shRNA sekvenser. Her 3 shRNA sekvenser mod PAI-1 blev testet for den stærkeste silencing effekt: shRNA 1, shRNA 2, shRNA 3, og røræg
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammensat af en række forskellige celletyper, er TME afgørende for udviklingen af kræft. For at sikre optimale vækstbetingelser, tiltrække kræftceller monocytter gennem udskillelsen af kemotaktisk faktorer. Her præsenterer vi en protokol for at studere mekanismen af monocyt rekruttering af tumor celler i vitro. Til dette formål anvendes en kombination af inducerbar gen expression system, rensning af primære humane monocytter og som et eksempel på en migration assay, Boyden kammer assay.
Den første afgørende skridt i præsenteres protokollen er at bekræfte den korrekte kloning af shRNA sekvenserne i Tet-ON vektor, som bør altid vurderes af sekventering. Yderligere etablering af de funktionelle stabil Tet-ON cellelinjer skal bekræftes ved testning KD i overværelse af doxycyclin af Western blotting. Mængden af anvendt Doxycyclin kan variere mellem cellelinjer, og derfor er det tilrådeligt at teste de effektive koncentrationer for KD og toksicitet på cellerne. En kendt ulempe af tetracyclin-inducerbar systemer er deres leakiness6,7. Mængden af protein i tilstedeværelse og fravær af doxycyclin skal måles og sammenlignes på scrambled kontrolelementerne for at tage højde for denne effekt. I in vitro- eksperimenter, er et lavt niveau af leakiness observeret med shRNA2 og shRNA3 KD, som er vist i figur 2. Desuden er det vigtigt altid at bruge tetracyklin-gratis serum in vitro- for at undgå downregulation af protein niveauer i kontrol betingelser. Systemet anvendes i denne protokol har fordele frem for andre Tet-ON systemer, da det kræver en enkelt vektor kloning, giver mulighed for hurtig generation af flere kloner, og udstiller meget lave niveauer af leakiness.
Et kritisk trin i opnåelse primære humane monocytter fra blodet er at opnå god gradient separation, som bygger på langsom lagdeling af den fortyndede blod over tæthed farveforløb. En anden afgørende trin i protokollen er korrekt vurdere antallet af celler før trinnet negative valg, fordi det vil bestemme mængden af antistof cocktail og magnetiske perler føjet til blodet suspension. For at sikre reproducerbarheden af eksperimenter, bør mere end én bloddonor anvendes i udførelsen Repliker eksperimenter. Denne teknik er overlegen i forhold til eksisterende alternativer monocyt rensning herunder en tæthed farveforløb og vedhæftning-baseret protokol34 og en totrinsprocedure med enkelt forløb21, fordi det garanterer lav lymfocyt forurening niveau og høj renhed (> 95%) af opnåede monocytter. Da de ikke-monocytic celletyper er fjernet fra PBMC blanding af negative valg, kommer monocytter ikke i direkte kontakt med antistoffer til stede i antistof cocktail, og dermed risikoen for monocytter bliver aktiveret af interaktion med antistoffer er minimal. Alternative anvendelser af opnåede celler kan omfatte differentiering af monocytter i makrofager gennem in vitro- og i vivo eksperimenter hvor humane monocytter injiceres i immundefekte mus. Ændringer af protokollen omfatter almindeligt brug af røde blodlegemer lysisbuffer under vask trin af PBMC. Denne ændring tager sigte på yderligere fjernelse af røde blodlegemer ved at anvende osmotisk tryk. Begrænsninger af teknikken, der omfatter et begrænset antal makrofager, der kan opnås ved hjælp af et bestemt beløb af reagenserne.
Boyden kammer migration assay er en hurtig og enkel måde at analysere hvis en udskilles protein eller en cellelinje stimulerer migration af andre celletyper. Faldgruber af dette assay omfatter lav følsomhed og ikke tegner sig for celler gennemgår celledød. Måder at løse disse problemer ville bekræfter resultaterne med en forskellige assay som en mikrofluid baseret analysen og et tidsforløb eksperiment hvor migration er målt over kortere tid. Undtagen for små populationer, modne monocytter ikke formere sig i vivo35,36; men hvis andre celler, der bruges, en tidslinje kortere end deres division cyklus bør være valgt at undgå en stigning i antallet af celler. Alternativt, reagenser blokering celledeling bør bruges til at undgå at ændre den oprindeligt forgyldt celle nummer.
Protokollen præsenteres her kan tilpasses nemt til undersøgelser af andre proteiner, der udskilles af kræftceller og deres paracrine funktioner. En af de mulige anvendelser af betingede KD kræft cellelinjer studerer rolle af proteiner hvis KD er giftigt for celler ikke kun in vitro- men også i vivo, hvor Tet-regulerede cellelinjer er xenotransplanted ind i musene og KD er induceret efter oprettelsen af tumor ved tilsætning af doxycyclin til drikkevandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Jacqueline Rosenberg for korrekturlæsning håndskriftet. Dette arbejde blev støttet af den os Department of Health and Human Services/National Institutes of Health med et tilskud til YA DeClerck (Giv 5R01 CA 129377) og TJ Martell Foundation. MH Kubala er modtageren af en forskning karriere udvikling Fellowship tildeling af det Saban forskningsinstitut på children's Hospital Los Angeles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J.
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
- Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
- Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
- Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
- Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
- Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
- Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
- Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
- Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
- Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
- Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
- Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
- Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
- Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
- Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
- Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
- Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
- Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
- Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
- Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
- Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).
