Summary
このプロトコルは、単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の募集に腫瘍細胞由来タンパク質の役割を研究するため特に癌細胞とその後続の使用で機能するテトにシステムを設定するためのスキームとして機能します。
Abstract
siRNA と shRNA を介したノックダウン (KD) 遺伝子発現の調整法は、遺伝子やタンパク質の機能を理解するための貴重なツールです。ただし、ケース、興味の蛋白質の KD 細胞致死効果または KD の予想される効果が時間依存性、無条件の KD メソッドを使用すると適切ではありません。条件付きシステムは、このような場合より適しているし、関心の対象とされています。エクダイソン誘導発現システム、チトクローム P-450 誘導システム1テトラサイクリン調節遺伝子発現系であります。
テトラサイクリン調整される遺伝子発現システムは、テトラサイクリン存在下で shRNA 発現誘導による蛋白質の表現の可逆制御をできます。このプロトコルでは、遺伝子発現の条件付き規制ひと癌細胞株における機能的なテトのシステムを用いた実験的なデザインを提案します。我々 は、腫瘍細胞単球の相互作用の研究ではこのシステムの使用を示します。
Introduction
促進することによって腫瘍の開発に貢献する腫瘍関連マクロファージ (Tam) 腫瘍の増殖、転移、および2免疫応答を調節します。がん細胞の腫瘍に潜入し、pro 幹 Tam3に分化するリクルートの炎症性単球。Tam と腫瘍の浸潤臨床予後と相関してマクロファージ4、5の免疫抑制の役割にリンクされています。しかし、腫瘍に大食細胞の募集のメカニズムはよく検討しないと関与する経路を理解フィールドと有望な治療の更なる向上のために重要です。腫瘍細胞と腫瘍微小環境 (TME) における正常細胞間の相互作用を勉強する際の課題の 1 つはメカニズムの解明や細胞、クロストークの解剖を許可する生体外でアプローチを必要とする複雑です。がん細胞由来のパラクライン効果、体外の大食細胞のような他の細胞型の移行の分泌タンパク質の研究に適用できる汎用性の高い方法論をご紹介します。単球の募集に関与するがん細胞由来タンパク質に対して shRNA 発現がテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下では、システムを使用して、分泌タンパク質の単球のパラクライン効果は量的に表わされます。このプロトコルでは規制のベクトルを提示テトラサイクリンに shRNA 配列のクローニングは続いて安定した癌細胞の世代。さらに、プライマリのひと単球・ ボイデン室アッセイの浄化は、単球の移行にがん細胞に由来するタンパク質のパラクライン効果を分析に使用されます。
蛋白質コーディングの遺伝子のダウンレギュレーション、一般的 siRNA と shRNA のテクニックの使用に制限はないがなくて適用されます。長期的なノックダウン (KD) 遺伝子の実験結果を妨げる細胞の二次的適応反応を引き出すことがあります。遺伝子発現の時空間制御の欠如では、時間の経過や細胞の生存に重要なタンパク質の役割蛋白質の動的役割を研究する困難になります。この問題は、腫瘍が確立された後にのみ腫瘍の開発そして進行中のタンパク質の役割が興味の蛋白質の発現のダウンレギュレーションを必要があります設定体内で特に重要です。条件付き KD 早い致死効果 KD の細胞と無条件の KD は腫瘍の開発の欠如につながる間、腫瘍の成長のさまざまな段階で蛋白質の役割の解析を有効にするを防止する利点があります。
条件付きの KD システムの数は、安定した KD の制限に対処する開発されましたが。条件遺伝子発現系には、エクダイソン誘導発現システム、チトクローム P-450 誘導システム1テトラサイクリン調節遺伝子発現系があります。テトラサイクリン調節遺伝子発現システムは、抗生物質テトラサイクリン (またはより安定したアナログ - ドキシサイクリン) の添加によって shRNA 発現を制御できます。テトラサイクリン/ドキシサイクリン KD、遺伝子発現の結果存在下でテトのシステム、shRNA 発現が誘導される shRNA 発現は遺伝子発現、テトラサイクリン存在下で抑制システム テト オフ中。テトラサイクリン誘導システムの欠点は、ドキシサイクリン - いわゆる水漏れしたため6、7の不在で shRNA 発現以前に報告された低レベルです。テトのシステムで説明した、テトラサイクリンの投与時に関心の shRNA のプロモーター領域が H1、テト応答要素 (TRE) シーケンスに恒常発現テトラサイクリン リプレッサー (TetR) 蛋白質の結合抑制されます。ShRNA 発現とテトラサイクリン依存的8,9の興味の蛋白質の翻訳の抑制でこの結果します。
その他の使用可能なテトのシステムは、シーケンス TATA ボックスと近位シーケンス要素 (PSE) 間および TATA ボックスと転写開始ちゃんらによって開発された重音テトの同時ノックに含めます。10このシステムは、非誘導の状態の下で shRNA 表現を規制するテトラサイクリンの有毒な線量低い shRNA のレベル未満、表されます必要があります。基 Krüppel 関連付けられているボックス (ボブ) テトのシステム11 KRAB、被験者の遺伝子は転写抑制 KRAB 結合部位の 3 kb の範囲内にある亜鉛指蛋白質が含まれます。キメラ蛋白質 tTRKRAB は、重音テトにバインドでき、大きい - DNA 制御可能な容量の範囲のため重音テト必要ないトランスクリプション間制限するサイトやプロモーターを開始しプロモーターの活性に低影響があります。ShRNA11,12; の漏らされた式の下位レベルを表示する非誘起状態の下でこの制御の RNA 干渉システムが報告されました。ただし、連続した 2 つのベクター複製のアプローチが必要です。エクダイソン誘導発現システムやチトクロム P-450 誘導システムなど開発済み条件 KD システムと比較してテトラサイクリン調節システム、堅牢性と、可逆性という利点があります、したがって最も日常的にシステムの13を使用しました。このプロトコルで使用されるシステムは、デュアル システム ノックで重音テトと KRAB テト - システムの利点それはまっすぐ進む、1 つのベクトルのクローニングは、複数のクローンの生成を許可する必要がありで水漏れしたための非常に低いレベルを発揮、ドキシサイクリンの不在。
TME は癌の開発のために重要です。腫瘍の成長を促進するには、癌細胞は走化性蛋白質の分泌によって炎症性単球を採用します。採用単球は腫瘍に潜入し、腫瘍の増殖と転移に貢献するプロ幹 Tam に分化します。免疫細胞の動員のin vitro研究利用移行アッセイ、boyden 教授区域の広く使われている試金使用14,15,16,17。この分析では、走化性因子蛋白質源、たとえば、癌細胞、または浄化された蛋白質は、下部室に配置されます。免疫細胞は、下部コンパートメントから多孔質膜で区切られた上部室に配置されます。走化性因子、および膜の下側に見られる増加勾配向かって移行セルを染色して顕微鏡下でカウントします。ここで我々 はドキシサイクリン添加による pai-1 の表現の規制、誘導性、安定した癌細胞を生成することによって単球のプラスミノーゲン活性化因子阻害剤 1 (PAI-1) の走化性因子の機能をテストします。単球の移行における pai-1 の役割を評価するのにボイデン室移行試験で人間の主要な球を使用します。人間の主な単球と THP1 のような広く使用されている単球性細胞株の違いが報告されているなど異なるサイトカイン発現パターン18;たとえば、THP1 細胞の TNF α 発現レベルは 5-10 倍に増加に比べてひと単球19。THP1 細胞白血病単球細胞から派生して、維持し、倍加時間 19-50 h20の平均で増殖し易い。逆に、成長因子の不在で寿命が短いひと単球が特徴です。単球は、個人間や精製方法によって変動のかなりの量が発生します、ドナーの血液から精製したので他のセルタイプで汚染が発生します。それにもかかわらず、主な単球は関連する、使用か生物学研究19の主な球を使用して単球性細胞株により得られた結果を確認してください推奨されています。ここで末梢血から主な単球人間の浄化のためのプロトコルについて述べる。密度勾配と接着プロトコルと Ficoll 後腹 Percoll グラデーション21続いての単一勾配と 2 つのステップ プロシージャ単球浄化の方法が含まれます。70-90% の間これらのメソッドの範囲によって得られる単球の人口の純度。負の免疫淘汰22続いて密度勾配を使用し、彼らの偶発的な活性化を回避し、結果それにより抗体と直接接触することがなくひと単球の浄化を有効にここで説明する方法を >単球の純粋な人口は 95%。
ひと癌細胞株における遺伝子発現 KD テトのシステム機能を設定するためここで提示されたプロトコルを使用して、癌由来分泌タンパク質のパイ 1 単球走化性因子の影響を検討します。パイ 1 さまざまな腫瘍で過剰発現し、その発現の臨床予後23,24逆説的に関与。Pai-1 のプロ性の役割はそのプロ血管新生の結果、抗アポトーシス機能25,26。パイ 1 は、マクロファージの炎症27サイトの募集を促進することによって炎症に寄与する示されています。パイ 1 は、Mac 1 依存マクロファージ移行30に参加する平滑筋細胞28,29を促進するために示された.パイ 1 過剰発現は、B16F10 メラノーマ腫瘍31に未加工 264.7 の大食細胞の募集を大幅強化にも示されています。ただし、タムの移行における pai-1 の役割は、詳しく解明されていません。記述されていたプロトコルを使用して、パイ 1 ががん細胞を単球を集めているかどうかの質問に答えます。この方法論は、癌細胞の分泌蛋白質を黙らせると、TME の成分を分析により腫瘍と TME の間クロストークの郭清。
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Protocol
健康なボランティアから得られたひと単球を使用するプロトコル セクション子供の病院ロサンゼルス人間研究の倫理委員会のガイドラインに従って、ひと由来の材料の下で制度検討委員会によって承認されています。プロトコル番号: 08-00208 CCI。
1. テトラサイクリン調節 shRNA 発現がん細胞の準備
- ShRNA テト pLKO puro ベクトルにパイ 1 のクローニング8,9
- 年齢私とエコRI 胸の谷間サイト 5' 端、意味シーケンス、6 塩基配列ループとアンチセンスのシーケンスを含む shRNA オリゴマーをデザインします。
注: 典型的なオリゴヌクレオチドは、次のように設計されています: 前方の oligo: 5 『 CCGG - 19-21 bp 感覚 - CTCGAG - 19-21 bp アンチセンス - TTTTT、逆オリゴ: 5' AATTAAAAA-19-21 bp 感覚 - CTCGAG - 19-21 bp アンチセンス 3'。オリゴマーの設計のための詳しいプロトコルは、 8で見つけることができます。本研究ではパイ 1 に対して 3 の shRNA シーケンス最強サイレンシング効果に対してテストを行う: shRNA 132shRNA 2、shRNA 333, およびスクランブル33 表 1に含まれています。 - ShRNA オリゴマーをアニール、shRNA オリゴマーをスクランブルします。
- 水で 100 μ M のオリゴヌクレオチドを再構成し、ミックス 1 μ L 前方オリゴヌクレオチド、1 μ L 逆オリゴヌクレオチド、8 μ L H2o.
- オリゴヌクレオチドをアニールする、次を混在: 1 μ L オリゴヌクレオチドの混合物、5 μ L バッファー 10 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) pH 7.5、50 mM 塩化ナトリウム (NaCl) 10 mM 44 μ H、1 mM ジチオエリトリトール (DTE)、塩化マグネシウム (MgCl2)2O.
- 95 ° C、5 分でポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) サーマルサイクラーの混合物を孵化させなさい、電源、スイッチ、室温 (RT) に達するまで待ちます。
- 5 μ L の 3 M 酢酸ナトリウムの pH 5.2 に 50 μ L を追加することによって沈殿物焼鈍オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを熱処理しました。
- 100 μ L 冷たい 100% エタノール (エタノール) を追加し、-80 ° C で 30 分間インキュベート4 ° C で 30 分間、最大速度でベンチトップ遠心分離機で遠心します。
- 上清を削除したり、追加の 500 μ L 冷たい 70 %etoh、30 分間遠心、上清を除去し、20 μ L H2o. でペレットを溶解
- 260 で吸光度を測定吸光光度法による焼なましオリゴヌクレオチドの濃度を評価する nm。オリゴヌクレオチドが 1 ng/μ L の最終濃度を希釈します。
- ルリア ベルターニカミラ (LB) 培地、LB 寒天培地プレートを準備します。
- 解散 10 g トリプトン LB 培地の酵母 5 g、10 g を 1 L の水に塩化ナトリウムを抽出します。Ph7.0 の 1 を使用する培地の pH 調整 N 水酸化ナトリウムとオートクレーブ。
- LB 寒天培地プレート LB 培地に寒天 15 g/L を追加します。オートクレーブとおよそ 50 ° c. で冷却抗生物質を追加し、プレートを注ぐ。
- テト pLKO puro ベクトルで導入した細菌を連勝 (材料表参照) LB 寒天培地プレート 100 μ g/mL アンピシリンと補われ、一晩インキュベート 37 ° C で (O/N)
- 100 μ g/mL アンピシリン (LB/アンピシリン) プレートから 1 コロニーを添加した 100 mL の LB 培地に接種し、37 ° c. で揺すると O/N を成長
- プラスミド分離キットを用いて 100 mL 細菌文化からプーロ IsolateTet pLKO
- 次のように制限酵素 EcoRI と上井をテト pLKO puro ベクターの制限反応の準備: 1 μ L EcoRI、1 μ L 上井、5 μ L の 10 x バッファー、1 μ L の DNA (1 μ g)、42 μ L H2o ・ インキュベート 1 37 ° C で h裂かれたベクトルの十分を得るためには、最大 5 x 50 μ L 反応を準備します。
- 1% アガロースゲルを使用して、DNA 精製キットを使用して agarose のゲルからの裂かれたベクトルを浄化します。DNA の収量を増やすには、大きな井戸の agarose のゲル櫛を使用して、慎重にメスを使用してバンドから agarose のほとんどを削除することにより、ゲルの DNA 比アガロースを最小限にします。
- ライゲーション反応混合物を次のように準備: 1 ng の焼鈍オリゴヌクレオチド、50 ng に裂かれたベクトル、2 μ L 10 x リガーゼ バッファー、1 μ L リガーゼおよび水まで 20 μ L 縛る 16 で焼なまし shRNA オリゴヌクレオチドとベクトル ° C O/n.。
- さらに、陰性対照の反応をせずに偽肯定的なコロニーになります分解されていない、部分的に劈開と自己結紮のベクトルを考慮するオリゴヌクレオチドを準備します。
- 標準の変換方法を使用して、結紮混合物を直接繰り返しを含むレンチウイルスベクターの相同組換えを防ぐために設計されている化学的に有能な細菌セルに変換します。
- アンピシリン O/N 37 ° C で板に細菌を成長します。
注: 衛星コロニーの成長が発生した場合変換を繰り返すし、成長が遅く、衛星コロニーを防ぐために 30 ° C でバクテリアします。 - 結紮を確認するには、(後で肯定的なクローンとして使用) にストック プレートとして 10-20 シングル コロニー、接種した 2 mL の LB/アンピシリン文化アンピシリン プレートの選択します。揺れ O/N 37 ° C で液体の文化を育てるプレート O/N 37 ° c. で孵化させなさい
- パラフィルムと 6 ° C でストアを持つプレートをシールします。
- プラスミド分離キットを使用して液体の文化からプラスミド DNA を分離します。
- XhoI 酵素を用いたアンピシリン抵抗性コロニーから分離されたプラスミド DNA の制限酵素解析を実行します。各クローンの次の反応混合物の準備: 0.5 μ L XhoI 2.5 μ L 10 x バッファー、1 μ L の DNA (0.5 μ g) と 21 μ L H2o ・加温 37 ° C で 1 時間1% アガロースゲルの反応を実行することによって制限の反応の結果を分析します。
注: XhoI 切断 WT ベクターの制限酵素解析 3 フラグメントが生成されます: 8,447, 1,800, と 200 bp。1,800 のテト pLKO puro ベクトルで詰め物シーケンス bp が shRNA パイ 1 を含む肯定的なクローンに存在しないと XhoI ダイジェスト サイズの DNA 断片になります: 8,447, 190、および 130 bp。アンピシリン抵抗性コロニー数から分離した DNA で図 1のように、2,000 の bp のフラグメントが見つからない: 3、8、および 11。オリゴヌクレオチドのデザインによって長さと肯定的なコロニーからの DNA で得られた断片の数が異なる場合があります。 - シーケンス8,9テト pLKO puro ベクトルに shRNA シーケンスの適切な挿入を確認します。
- 正しいクローンを含んでいるコロニー 100 mL LB/アンピシリン文化に接種し、37 ° C で O/N を成長
- プラスミド分離キットを使用してプラスミッド DNA を分離します。
- 年齢私とエコRI 胸の谷間サイト 5' 端、意味シーケンス、6 塩基配列ループとアンチセンスのシーケンスを含む shRNA オリゴマーをデザインします。
- レンチ ウイルス粒子の生成。
- コート 15 cm 細胞培養用ディッシュ 0.01% の溶液を滅菌水で料理の表面を覆うことによってポリ-L-リジンのポリ-L-リジンと常温 15 分インキュベート吸引・ ソリューションを取り外し、皿を風乾します。
- シード 5 x 106人間の萌芽期の腎臓 293 細胞ポリ L リジン コーティング 15 cm 皿 (HEK293) 細胞とペニシリン/ストレプトマイシン ミックス (ペン/連鎖球菌) 37 ° c、5% 10 %fbs と 1% を添加したダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 培地における文化 CO2 70% の confluency に到達するまで。
- ウイルス粒子を生成するため 25 μ g pLKO-テト-上-shRNA、25 μ g psPAX、(プラスミドを包装)、トランスフェクション試薬を用いた 5 μ g pMD2.G プラスミド (エンベロープ表現するプラスミッド) と HEK293 細胞を transfect します。
注: psPAX と pMD2.G プラスミドは、ディディエ Trono 研究室 (エコール連邦工科ローザンヌ, スイス連邦共和国) からの贈り物です。 - 10 mM ナトリウム酪酸と 20 mM HEPES pH 7.2 と 8 時間の培養を DMEM に媒体を変更することで次の日 HEK293 細胞を誘発します。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞を洗浄し、新鮮な DMEM 培地含む 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) の pH 7.2 25 mL を加えます。48 h の 37 ° C で培養後慎重にピペッティング; によってウイルスを含んでいる媒体を収集します。流出を避けるため。
- HEK293 細胞を除去する 0.45 μ M シリンジ フィルターを通して収集された媒体をフィルターします。ウイルス粒子を含む培地をすぐに使用または後で使用するため-80 ° C で保存できます。
- 固定して transfected セル行の生成
- 種子 HCT116 大腸がん細胞と細胞/ウェルで 1% と 10% 牛胎児血清 (FBS) DMEM 培 50,000 で MDA MB 231 乳癌細胞 12 ウェル プレートでペン/連鎖球菌。セルが 60-70% 合流まで 5% CO2で 37 ° C で孵化させなさい。
- PBS のセルを洗浄し、ウイルスを含んだ 1 mL を追加中がん細胞し、5% CO237 ° C で O/N を孵化させなさい。コントロールとして新鮮な DMEM 培 10 %fbs と 1% の 1 つの mL を追加ペン/咽頭癌細胞と 2 の井戸へ。
- 吸引によりウイルスを含んでいる媒体を慎重に取り外します。PBS のセルを洗浄し、テトラサイクリン無料 10% (v/v) を DMEM に媒体を変更 (テト無料) FBS と 1% ペン/連鎖球菌。
- 72 時間後、PBS のセルを洗浄し、10 %dmem に媒体を変更テト無料 FBS 1% ペン/連鎖球菌、ウイルス transfected セルの選択範囲を 1 μ g/mL ピューロマイシン。
- セルラインを使用、に応じて非導入細胞におけるピューロマイシン濃度 (0.1、0.5、1、2、および 5 μ g/mL) の範囲をテストし、制御の細胞が生き残らない最低濃度を選択する最適な選択のピューロマイシン濃度を調整します。3 日後の文化の。
- 3 ~ 14 日ピューロマイシン存在下で細胞を培養してウイルス導入のセルを選択します。コントロールと非導入細胞は、ピューロマイシン ピューロマイシンなしで 1 つを含む培地で 1 つの 2 つの追加の井戸を準備します。ウイルス導入細胞制御の井戸に井戸にピューロマイシンによってセルの部分の殺害を観察します。
注: セルの非導入ピューロマイシン存在下で成長しません。 - ピューロマイシン耐性 HCT116 大腸癌と MDA MB 231 乳癌細胞の条件付きの KD の効率を確認します。
注: ドキシサイクリンの有効濃度および使用細胞ラインと異なります (通常は 2 μ g/mL に 100 ng/mL) から滴定する必要があります。- セルのために有毒なく downregulating 興味の蛋白質の表現に有効であるドキシサイクリン濃度を決定します。このプロトコルでは 1 μ G/ml が正常に使用される体外だった
- 0.1、1、および 2 μ G/ml のドキシサイクリンの有無で 72 時間の細胞を培養します。ダウンレギュ レート蛋白質の表現のレベルを確認 (ここでパイ 1) ウエスタンによって細胞ライセートのしみの分析。条件付きでスクランブル コントロールのセルに shRNA 発現をする HCT116 と MDA MB 231 細胞を比較します。
- 馴化培地の調製
- ドキシサイクリン安定発現細胞の種子 1 x 106 10 cm 皿での pLKO shRNA 含むレンチを規制されています。
- 10 %fbs のテト無料 1% とロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 培地で細胞を育てるペン/球菌不在そして 5% CO2、37 ° C で 72 時間 1 μ G/ml ドキシサイクリンの存在で毎日新鮮なドキシサイクリンを追加します。
注: RPMI 培地は単球の培養条件と互換性があります。ドキシサイクリンは、光敏感な化合物です。アルミ箔被覆による光から培養細胞を保護し、直接の光照射下での作業を避けます。 - ピペットで培地を収集、0.45 μ m フィルター、フィルターおよび因数で-80 ° C で凍結します。
2. 血中単球の分離
- ひと末梢血単球を分離します。
注: ひと主単球は白血球正常な血小板ドナーから得られる白血球フィルターに集中して 7 mL から分離されます。ドナーによって 1 x 10 の9と 2 x 109末梢血単核球 (PBMCs)、約 10% を構成単球の白血球の 1 つのフィルターを生成します。- キャビネットの層流のワークステーションを準備します。
- はさみと 30 分の紫外光 (UV) キャビネットの層流を消毒します。
- 70 %etoh と養生中白血球フィルターを噴霧流のキャビネット。
- 白血球フィルターの両端をハサミで切って 50 mL のチューブにフィルターの内容を空にします。
- 1% (v/v) (PBS/FBS) の FBS を含む PBS を追加して 90 mL に希釈します。
- 3 x 50 mL チューブ 15 mL 密度勾配ソリューションを準備します。PBS/FBS 希釈血液のゆっくり 30 mL をピペット コント ローラーを使用してグラデーションのソリューションを設定重力流れの層の混合を避けるために密度の高い層します。
- 25 分ブレーキなし RT で 400 x g でスイング ローターの遠心分離機します。
- 最上位のレイヤーを破棄し、新鮮な 50 mL のチューブに PBMCs を含む中間層を転送します。
- 50 mL と常温 120 x g で 10 分間遠心まで PBS/FBS は、血小板を含む上清を除去を追加します。この手順をさらに 2 回繰り返します。
- PBS/FBS の 50 mL にペレットを再懸濁します、診断 PBMCs をカウントします。常温 120 × g で遠心し、5 x 107セル/mL の最終濃度 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (PBS、FBS、EDTA) を含む PBS/FBS でペレットを再懸濁します。
- 非単球細胞の枯渇による単球を豊かにするのに負の淘汰キットを使用します。
注: 否定的な選択キットは、T 細胞、NK 細胞、好中球、B 細胞、顆粒球、および赤血球に対する抗体 (CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD56、CD66b、CD123、グリコフォリン A) のカクテルを使用します。抗体の複合体は、これらの非単球の細胞の表面に、微粒子磁性デキストランをバインドします。磁石にチューブを配置すると、ビーズは管の壁に付着し、非単球細胞をソリューションから削除します。- 5 x 107 PBMCs/mL の 1 mL に 50 μ L 抗体カクテルを追加、ピペット、ミックスし抗体カクテル PBMCs にした追加 50 μ L 磁気ビーズで 10 分間インキュベート、ピペット、混ぜて、室温別 10 分間インキュベート
- 25 mL と 50 mL のチューブに対応することができますマグネット PBMC 混合物を置くまで PBS/国債/EDTA を追加します。した磁気ビーズが管壁に付着し、ソリューションから非単球細胞の隔離で 10 分間インキュベートします。
- 25 mL のピペットを使用して、磁石でチューブからの単球を含むソリューションを削除します。ピペット管の側面に触れないように注意します。
- RT で 250 x g で溶液を遠心、上清を除去、10 %fbs のテト無料 1% を含む RPMI 培地の単球を含むペレットを再懸濁しますペン/連鎖球菌。
3. ボイデン室移行アッセイ
- BSA、純水 100 mL に 1 g を溶解することにより 1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションを準備し、消毒に 0.2 μ m の細孔を介してフィルタ リングします。
- マクロファージの細胞膜への密着性向上のための 1% 滅菌 BSA 溶液 O/N 多孔質膜挿入を孵化させなさい。単球/マクロファージ、5-8 μ m 孔サイズ挿入を使用します。
- 1 %bsa 溶液で無菌培養皿を埋めるし、皿にチップを置きます。挿入中 200 μ L 1 %bsa 溶液を適用します。
- 滅菌 PBS とフィルター内部適用の PBS でいっぱい皿にそれらを置くことによって 2 回挿入を洗います。
- シード 10 %fbs のテト無料 1% を含む 0.5 mL RPMI 培地で 40,000 HCT116 または MDA MB 231 セルあたり 3 通の 24 ウェル プレートでよくペン/連鎖球菌。また、走化性因子のソースとしてもに以前に生成された馴化培地の 0.5 mL を配置します。
- 次の日、0.3 mL 10 %fbs のテト無料 1% を含む RPMI 培地量で挿入準備板 8,000 単球ペン/連鎖球菌、3 通、5% CO237 ° C で孵化させなさいと。
- 48 時間後、挿入を収集します。
注: 実験の長さは、特定の条件と異なる培養時の挿入の収集した経時実験の実行で使用されるセルに応じて最適化されなければなりません。- 過剰な媒体を振り払うし、正確に移行しなかったセルを削除する綿棒と内面を強打します。
- ライト-ギムザ メソッドを使用して挿入の外側を染色します。
- 慎重に移行したマクロファージを用いたフィルターの側が上を向くことを確かめて、高粘度の顕微鏡イマージョン オイルの 3 の挿入/ガラス スライドをマウントします。
- 20 × 対物を用いた光顕微鏡スライドをイメージします。9 フィールド/フィルターの写真を撮る。9 フィールド/フィルターに移行したマクロファージをカウントします。
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Representative Results
3 つの shRNA シーケンスのため、最も効率的な KD の PAI-1 がテストされました。このため、パイ 1 とスクランブル (表 1) shRNA シーケンス上記プロトコルを次のテト pLKO puro 発現ベクターにクローニングを行った.HT 1080 線維肉腫細胞株が生成された構造安定発現し、細胞は 3 日間のドキシサイクリンで治療されました。Pai-1 の式はウエスタンブロット(図 2 aによって確認された)、デンシトメトリーによるパイ 1 とチューブリンに対応するバンドの強度を分析しました。テトラサイクリン調節をトランスフェクトした最も効果的な KD シーケンス (shRNA 2)、さらに生成した MDA MB 231 上皮乳房腺癌細胞 (図 2 b) と HCT116 大腸癌細胞 (図 2) 安定を使用してpLKO-shRNA2-パイ-1 式ベクトル (、コントロールとしてスクランブル shRNA)。MDA MB 231 細胞 (図 2 b) のパイ 1 式の 74% 減少とドキシサイクリン (1 μ g/mL) の存在下で HCT116 細胞ラインで 17.5% の減少を実現しました(図 2) 西部にしみが付くことおよびのデンシトメトリー分析により評価しました。バンド。ボイデン室アッセイは、がん細胞への単球の移行を定量化に使用されました。我々 は、そのがん細胞由来のパイ 1 球腫瘍細胞への移行を促進し、したがって以下の移行が観測される時パイ 1 ダウンレギュ レートは、ドキシサイクリンの添加による仮説。癌細胞は 3 日間のドキシサイクリンで治療され、40,000 細胞/ウェルで 24 ウェル プレートの底に播種します。アッセイの上部室 24 h 後で適用された精製されたプライマリひと単球、単球の膜の下に接続されているいた染色し顕微鏡下でカウントします。我々 は、ドキシサイクリンの不在なり、pai-1 の存在、MDA MB 231 と HCT116 細胞 (パイ 1 shRNA とスクランブル コントロール) は増大ひと単球 (図 3) の移行を示しています。単球の移行は、ドキシサイクリンは、共培養に追加された腫瘍細胞による pai-1 の生産は調整される (図 3 a、 C) と、33%、74% 抑制されました。またドキシサイクリンは単球移行抑制効果がなかったことを示されるスクランブル shRNA のコントロールで導入した腫瘍細胞と単球の移行の阻害は認められなかった。ドキシサイクリン投与がん細胞馴化培地は走化性 (図 3 b、 D) のソースとして、井戸の底に置かれた時同様の結果が得られました。
図 1.XhoI 16 細菌のコロニーから抽出した DNA の制限酵素解析します。DNA は 16 の細菌のコロニーから抽出され、制限 XhoI 酵素反応を受けます。結果として得られる DNA のフラグメントは agarose のゲルの電気泳動によって分析されました。XhoI 制限のダイジェストの後 2 kb フラグメントがない肯定的なクローン (レーン 3、8、および 11) は、矢印が付いています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.癌細胞株における条件付きパイの KD 1 式。ウエスタンブロット パイ 1 細胞における発現解析安定テトラサイクリン調節 pLKO-shRNA-パイ-1 (shRNA 1-3) をトランスフェクトしたし、ドキシサイクリン治療の 3 日後発現ベクターをスクランブルします。(A) HT1080。(B) MDA-MB-231。(C) HCT116。西の車線下記のバンドのデンシトメトリーの分析チューブリン バンド強度上パイ 1 強度の比率としてしみ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.パイ 1 マクロファージ遊走を促進する。MDA-MB-231 (A) と (C) HCT116 細胞 shRNA パイ 1 に対して 2 とスクランブル shRNA を条件付きで表現するベクトル安定発現する線に向かってひと単球の移行は、ボイデン室アッセイを使用して測定。癌細胞は 3 日間のドキシサイクリンで治療され、3 通 24 ウェル プレートでシードします。人間の主な単球は、挿入の上に適用されました。24 h 後フィルターの下側に単球染色し、顕微鏡下でカウントします。馴化培地に向かってひと単球の移行はドキシサイクリンの有無で条件付きでパイ 1 を表現する HCT116 細胞 MDA-MB-231 (B) と (D) で 72 時間以上を生成されます。データは、[± 標準偏差 (SD)] 技術トリプリケートの意味を表します。各複製の移行した単球は、対物レンズの倍率 × 20 で 9 分野で数えられました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| Oligo の名前 | シーケンス | ||||
| shRNA 1 (抗 PAI-1 シーケンス 1 - 8 ) | 進む: | shPAI 1A5' 3' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT | |||
| 逆: | 5' 3' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG shPAI 1B | ||||
| shRNA 2: (パイ 1 反 2 のシーケンス) | 進む: | shPAI-1 C 5'-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3' | |||
| 逆: | shPAI 1 次元 5'-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3' | ||||
| shRNA 3 (パイ 1 シーケンス - 3 反9) | 進む: | shPAI 1E 5'-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3' | |||
| 逆: | shPAI 1F 5'-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3' | ||||
| スクランブル (スクランブル シーケンス - 4 9) | 進む: | スクランブル 1 5'-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3' | |||
| 逆: | スクランブル 2 5'-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3' | ||||
テーブル 1 shRNA 配列。 。ここでパイ 1 に対して 3 の shRNA シーケンスは最強のサイレンシング効果を調べた: shRNA 1、2、3 とスクランブルエッグの shRNA shRNA
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Discussion
さまざまな種類の細胞から成る、TME は癌の開発のために重要です。最適な成長条件を確認するためには、がん細胞は単球走化性因子の分泌を通じてを引き付けます。ここは、腫瘍細胞の in vitro単球採用のメカニズムを研究するためのプロトコルを提案する.このため、誘引可能な遺伝子発現系、プライマリのひと単球の遊走アッセイによる、ボイデン室アッセイの例として浄化に組み合わせてです。
提案するプロトコルの最初の重要なステップは、テトのベクトルは、常にシーケンスによって評価されるべきに shRNA シーケンスの正しいクローニングを確認です。機能の安定したテトの細胞ラインのさらなる確立は西部にしみが付くことによってドキシサイクリンの存在下で KD をテストによって確認する必要があります。細胞間応用ドキシサイクリンの金額が異なる場合があります、したがってそれは細胞に効果的な濃度 KD と毒性をテストすることをお勧め。テトラサイクリン誘導システムの既知の欠点は、その水漏れしたため6,7です。ドキシサイクリンの有無で検出される蛋白質の量を測定し、この効果を考慮するスクランブル コントロールに比較する必要があります。生体外実験では図 2に示すように shRNA2 と shRNA3 の KD で水漏れしたための低レベルを観測します。また、常にテトラサイクリン無料血清培養制御条件のタンパク質レベルの低下を避けるために使用することが重要です。複数のクローンの迅速な生成を可能このプロトコルで使用されるシステムは、1 つのベクトルのクローニングが必要です他のテトのシステム上の利点や水漏れしたための非常に低いレベルを展示します。
血液からプライマリひと単球を得ることの重要なステップは、希釈血液の遅い層密度勾配に依存している良い勾配分離を得ています。プロトコルの別の重要なステップは、血液懸濁液に追加抗体カクテルや磁気ビーズの量を決定するため負の淘汰のステップの前に細胞の数を適切に見積もることです。実験の再現性を保証するため、1 つ以上の血液ドナーを複製の実験を行うことで使用してください。この手法は、低リンパ球の汚染が新株予約権単球浄化密度勾配や接着ベースのプロトコル34単一勾配21、2 つの手順などの既存の代替よりも優れてレベルと高純度 (> 95%) の得られた単球。単球抗体カクテル、抗体の存在と直接接触したがって抗体との相互作用によってアクティブになる単球のリスクで来ていない非単球細胞型は、負の淘汰で PBMC 混合物から削除されます、ので最小限です。得られる細胞の代替アプリケーションは単球のひと単球を免疫不全マウスに注入する場所の in vitroとin vivoの実験を介してマクロファージへの分化を含めることができます。プロトコルの変更には一般 PBMCs の洗浄のステップ中に赤血球細胞の換散バッファーの使用が含まれます。この変更は浸透圧を適用することによって赤血球の取り外し・追加を目指します。技術の制限には、試薬の指定された量を使用して取得することができますマクロファージの限られた数が含まれます。
ボイデン室遊走アッセイによる場合は分泌された蛋白質を分析する高速かつ簡単な方法または細胞が他の細胞型の移行を促進します。この試金の落とし穴は、感度が低いと細胞死を経るセル アカウンティングしていないに含まれます。マイクロ ベースのアッセイと時間の短い期間で移行が測定される時間コース実験のようなこれらの懸念に対処する方法、さまざまな分析の結果を確認でしょう。小集団を除いて、成熟した単球は生体内で35,36; を増殖しません。しかし他のセルを使用すると、その分裂サイクルより短いタイムラインが細胞数の増加を避けるために選択されます。また、細胞分裂をブロッキング試薬は、もともとめっきセル数を変更することを避けるために使用ください。
ここで提示されたプロトコルは簡単に癌細胞とそのパラクリン機能によって分泌される他のタンパク質の研究に適応することができます。条件付き KD 癌細胞の可能なアプリケーションの一つはその KD は毒性タンパク質の役割を勉強して細胞の培養だけでなく生体内で、テト規制細胞株、マウス、xenotransplanted、KD が誘導されます。ドキシサイクリン、飲料水への添加による腫瘍の確立の後
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、原稿の校正にジャクリーン · ローゼンバーグを認めると思います。この作品は DeClerck 屋の付与と米国保健社会福祉省/国立衛生研究によって支えられた (5R01 CA 129377 付与) と TJ マーテル財団。MH クバラはサバン研究所子供のロサンゼルスの病院での研究のキャリア開発奨励賞の受信者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
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