単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン
Summary
このプロトコルは、単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の募集に腫瘍細胞由来タンパク質の役割を研究するため特に癌細胞とその後続の使用で機能するテトにシステムを設定するためのスキームとして機能します。
Abstract
siRNA と shRNA を介したノックダウン (KD) 遺伝子発現の調整法は、遺伝子やタンパク質の機能を理解するための貴重なツールです。ただし、ケース、興味の蛋白質の KD 細胞致死効果または KD の予想される効果が時間依存性、無条件の KD メソッドを使用すると適切ではありません。条件付きシステムは、このような場合より適しているし、関心の対象とされています。エクダイソン誘導発現システム、チトクローム P-450 誘導システム1テトラサイクリン調節遺伝子発現系であります。
テトラサイクリン調整される遺伝子発現システムは、テトラサイクリン存在下で shRNA 発現誘導による蛋白質の表現の可逆制御をできます。このプロトコルでは、遺伝子発現の条件付き規制ひと癌細胞株における機能的なテトのシステムを用いた実験的なデザインを提案します。我々 は、腫瘍細胞単球の相互作用の研究ではこのシステムの使用を示します。
Introduction
促進することによって腫瘍の開発に貢献する腫瘍関連マクロファージ (Tam) 腫瘍の増殖、転移、および2免疫応答を調節します。がん細胞の腫瘍に潜入し、pro 幹 Tam3に分化するリクルートの炎症性単球。Tam と腫瘍の浸潤臨床予後と相関してマクロファージ4、5の免疫抑制の役割にリンクされています。しかし、腫瘍に大食細胞の募集のメカニズムはよく検討しないと関与する経路を理解フィールドと有望な治療の更なる向上のために重要です。腫瘍細胞と腫瘍微小環境 (TME) における正常細胞間の相互作用を勉強する際の課題の 1 つはメカニズムの解明や細胞、クロストークの解剖を許可する生体外でアプローチを必要とする複雑です。がん細胞由来のパラクライン効果、体外の大食細胞のような他の細胞型の移行の分泌タンパク質の研究に適用できる汎用性の高い方法論をご紹介します。単球の募集に関与するがん細胞由来タンパク質に対して shRNA 発現がテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下では、システムを使用して、分泌タンパク質の単球のパラクライン効果は量的に表わされます。このプロトコルでは規制のベクトルを提示テトラサイクリンに shRNA 配列のクローニングは続いて安定した癌細胞の世代。さらに、プライマリのひと単球・ ボイデン室アッセイの浄化は、単球の移行にがん細胞に由来するタンパク質のパラクライン効果を分析に使用されます。
蛋白質コーディングの遺伝子のダウンレギュレーション、一般的 siRNA と shRNA のテクニックの使用に制限はないがなくて適用されます。長期的なノックダウン (KD) 遺伝子の実験結果を妨げる細胞の二次的適応反応を引き出すことがあります。遺伝子発現の時空間制御の欠如では、時間の経過や細胞の生存に重要なタンパク質の役割蛋白質の動的役割を研究する困難になります。この問題は、腫瘍が確立された後にのみ腫瘍の開発そして進行中のタンパク質の役割が興味の蛋白質の発現のダウンレギュレーションを必要があります設定体内で特に重要です。条件付き KD 早い致死効果 KD の細胞と無条件の KD は腫瘍の開発の欠如につながる間、腫瘍の成長のさまざまな段階で蛋白質の役割の解析を有効にするを防止する利点があります。
条件付きの KD システムの数は、安定した KD の制限に対処する開発されましたが。条件遺伝子発現系には、エクダイソン誘導発現システム、チトクローム P-450 誘導システム1テトラサイクリン調節遺伝子発現系があります。テトラサイクリン調節遺伝子発現システムは、抗生物質テトラサイクリン (またはより安定したアナログ – ドキシサイクリン) の添加によって shRNA 発現を制御できます。テトラサイクリン/ドキシサイクリン KD、遺伝子発現の結果存在下でテトのシステム、shRNA 発現が誘導される shRNA 発現は遺伝子発現、テトラサイクリン存在下で抑制システム テト オフ中。テトラサイクリン誘導システムの欠点は、ドキシサイクリン – いわゆる水漏れしたため6、7の不在で shRNA 発現以前に報告された低レベルです。テトのシステムで説明した、テトラサイクリンの投与時に関心の shRNA のプロモーター領域が H1、テト応答要素 (TRE) シーケンスに恒常発現テトラサイクリン リプレッサー (TetR) 蛋白質の結合抑制されます。ShRNA 発現とテトラサイクリン依存的8,9の興味の蛋白質の翻訳の抑制でこの結果します。
その他の使用可能なテトのシステムは、シーケンス TATA ボックスと近位シーケンス要素 (PSE) 間および TATA ボックスと転写開始ちゃんらによって開発された重音テトの同時ノックに含めます。10このシステムは、非誘導の状態の下で shRNA 表現を規制するテトラサイクリンの有毒な線量低い shRNA のレベル未満、表されます必要があります。基 Krüppel 関連付けられているボックス (ボブ) テトのシステム11 KRAB、被験者の遺伝子は転写抑制 KRAB 結合部位の 3 kb の範囲内にある亜鉛指蛋白質が含まれます。キメラ蛋白質 tTRKRAB は、重音テトにバインドでき、大きい – DNA 制御可能な容量の範囲のため重音テト必要ないトランスクリプション間制限するサイトやプロモーターを開始しプロモーターの活性に低影響があります。ShRNA11,12; の漏らされた式の下位レベルを表示する非誘起状態の下でこの制御の RNA 干渉システムが報告されました。ただし、連続した 2 つのベクター複製のアプローチが必要です。エクダイソン誘導発現システムやチトクロム P-450 誘導システムなど開発済み条件 KD システムと比較してテトラサイクリン調節システム、堅牢性と、可逆性という利点があります、したがって最も日常的にシステムの13を使用しました。このプロトコルで使用されるシステムは、デュアル システム ノックで重音テトと KRAB テト – システムの利点それはまっすぐ進む、1 つのベクトルのクローニングは、複数のクローンの生成を許可する必要がありで水漏れしたための非常に低いレベルを発揮、ドキシサイクリンの不在。
TME は癌の開発のために重要です。腫瘍の成長を促進するには、癌細胞は走化性蛋白質の分泌によって炎症性単球を採用します。採用単球は腫瘍に潜入し、腫瘍の増殖と転移に貢献するプロ幹 Tam に分化します。免疫細胞の動員のin vitro研究利用移行アッセイ、boyden 教授区域の広く使われている試金使用14,15,16,17。この分析では、走化性因子蛋白質源、たとえば、癌細胞、または浄化された蛋白質は、下部室に配置されます。免疫細胞は、下部コンパートメントから多孔質膜で区切られた上部室に配置されます。走化性因子、および膜の下側に見られる増加勾配向かって移行セルを染色して顕微鏡下でカウントします。ここで我々 はドキシサイクリン添加による pai-1 の表現の規制、誘導性、安定した癌細胞を生成することによって単球のプラスミノーゲン活性化因子阻害剤 1 (PAI-1) の走化性因子の機能をテストします。単球の移行における pai-1 の役割を評価するのにボイデン室移行試験で人間の主要な球を使用します。人間の主な単球と THP1 のような広く使用されている単球性細胞株の違いが報告されているなど異なるサイトカイン発現パターン18;たとえば、THP1 細胞の TNF α 発現レベルは 5-10 倍に増加に比べてひと単球19。THP1 細胞白血病単球細胞から派生して、維持し、倍加時間 19-50 h20の平均で増殖し易い。逆に、成長因子の不在で寿命が短いひと単球が特徴です。単球は、個人間や精製方法によって変動のかなりの量が発生します、ドナーの血液から精製したので他のセルタイプで汚染が発生します。それにもかかわらず、主な単球は関連する、使用か生物学研究19の主な球を使用して単球性細胞株により得られた結果を確認してください推奨されています。ここで末梢血から主な単球人間の浄化のためのプロトコルについて述べる。密度勾配と接着プロトコルと Ficoll 後腹 Percoll グラデーション21続いての単一勾配と 2 つのステップ プロシージャ単球浄化の方法が含まれます。70-90% の間これらのメソッドの範囲によって得られる単球の人口の純度。負の免疫淘汰22続いて密度勾配を使用し、彼らの偶発的な活性化を回避し、結果それにより抗体と直接接触することがなくひと単球の浄化を有効にここで説明する方法を >単球の純粋な人口は 95%。
ひと癌細胞株における遺伝子発現 KD テトのシステム機能を設定するためここで提示されたプロトコルを使用して、癌由来分泌タンパク質のパイ 1 単球走化性因子の影響を検討します。パイ 1 さまざまな腫瘍で過剰発現し、その発現の臨床予後23,24逆説的に関与。Pai-1 のプロ性の役割はそのプロ血管新生の結果、抗アポトーシス機能25,26。パイ 1 は、マクロファージの炎症27サイトの募集を促進することによって炎症に寄与する示されています。パイ 1 は、Mac 1 依存マクロファージ移行30に参加する平滑筋細胞28,29を促進するために示された.パイ 1 過剰発現は、B16F10 メラノーマ腫瘍31に未加工 264.7 の大食細胞の募集を大幅強化にも示されています。ただし、タムの移行における pai-1 の役割は、詳しく解明されていません。記述されていたプロトコルを使用して、パイ 1 ががん細胞を単球を集めているかどうかの質問に答えます。この方法論は、癌細胞の分泌蛋白質を黙らせると、TME の成分を分析により腫瘍と TME の間クロストークの郭清。
Protocol
Representative Results
Discussion
さまざまな種類の細胞から成る、TME は癌の開発のために重要です。最適な成長条件を確認するためには、がん細胞は単球走化性因子の分泌を通じてを引き付けます。ここは、腫瘍細胞の in vitro単球採用のメカニズムを研究するためのプロトコルを提案する.このため、誘引可能な遺伝子発現系、プライマリのひと単球の遊走アッセイによる、ボイデン室アッセイの例として浄化に組み?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、原稿の校正にジャクリーン · ローゼンバーグを認めると思います。この作品は DeClerck 屋の付与と米国保健社会福祉省/国立衛生研究によって支えられた (5R01 CA 129377 付与) と TJ マーテル財団。MH クバラはサバン研究所子供のロサンゼルスの病院での研究のキャリア開発奨励賞の受信者です。
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
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