Summary
이 프로토콜 공부 monocytes/세포 종양 microenvironment에의 채용에 있는 종양 세포 유래 단백질의 역할에 대 한 특히 암 세포 선 및 그것의 사용, 기능 Tet에 시스템 설정에 대 한 방식으로 제공 합니다.
Abstract
siRNA 및 유전자 발현 조절의 (KD) 방법 아래로 노크 shRNA 중재 유전자와 단백질의 기능을 이해 하기 위한 귀중 한 도구가 있습니다. 그러나,이 관심사의 단백질의 KD 세포에 치명적인 효과가 나는 KD의 기대 효과 경우에서 시간 종속, 무조건 KD 방법 적절 한 하지 않습니다. 조건부 시스템은 이러한 경우에 더 적합 하 고 많은 관심의 대상이 되고있다. 이러한 Ecdysone 유도할 수 있는 overexpression 시스템, 시 토 크롬 P-450 유도 시스템1를 포함 하 고 있는 항생물질 규제 유전자 식 시스템.
항생물질 통제 유전자 식 시스템 항생물질 존재 shRNA 식의 유도 의해 단백질 표정 가역 제어할을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 유전자 발현의 조건부 규칙에 대 한 인간 암 세포 라인에 기능 Tet에 시스템을 사용 하 여 실험 설계를 제시. 우리는 다음 종양 세포 monocyte 상호 작용의 연구에서이 시스템의 사용을 보여 줍니다.
Introduction
홍보 함으로써 종양 개발에 기여 하는 관련 된 종양 세포 (Tam) 종양의 성장, 전이, 그리고 면역 반응2를 조절. 암 세포 모집 염증 monocytes, 종양 침투 하 고 프로 tumorigenic Tam3으로 차별화. Tam와 종양의 침투 빈약한 임상 결과와 상관 관계가 고 대 식 세포4,5의 면역 역할에 연결 되었습니다. 그러나, 대 식 세포는 종양의 채용의 메커니즘은 잘 탐험 하지 고 참여 통로의 더 나은 이해 하는 것은 더 유망한 요법 분야의 발전을 위한 중요 한. 종양 세포와 정상 세포에서 종양 microenvironment (TME) 간의 상호 작용을 공부 하 고 있는 과제 중 하나입니다 메커니즘 및 셀 요구는 크로스 토크의 해 부를 허용 하는 체 외에서 접근, 참여의 복잡성. 여기 우리는 암 세포 유래의 paracrine 효과, 대 식 세포, 생체 외에서처럼 다른 세포 유형의 마이그레이션에 분 비 단백질 연구에 적용할 수 있는 다양 한 방법론을 제시. ShRNA는 암 세포 유래 단백질에에서 관여 monocytes의 채용에 대 한의 식을 항생물질 유도할 수 있는 발기인의 통제는 시스템에 사용 하 여, monocytes에 secreted 단백질의 paracrine 효과 quantitated 이다. 이 프로토콜, 안정 암 세포 라인의 세대 뒤 규제 벡터 제시 항생물질 shRNA 시퀀스의 복제. 또한, 기본 인간 monocytes 그리고 Boyden 챔버 분석 결과의 정화는 monocytes의 마이그레이션에는 암 세포 파생 된 단백질의 paracrine 효과 분석 하는 데 사용 됩니다.
단백질 코딩 유전자의 Downregulation 일반적으로 비록 그것의 사용에 제한 없이 siRNA와 shRNA 기술로 적용 됩니다. 유전자의 장기 노크 다운 (KD) 실험 결과 방해 하는 셀의 보조 적응 반응 유도 수 있습니다. 일시적인 유전자 발현 제어의 부족 하면 시간 또는 세포 생존을 위해 중요 한 단백질의 역할은 단백질의 동적 역할을 연구 하는 도전 수 있습니다. 이 문제는 설정 비보에 ,에서 특히 중요 한 종양 개발 및 진행에 단백질의 역할이 종양 설립 후에 관심사의 단백질의 표현의 downregulation를 필요할 수 있습니다. 조건부 KD 방지는 너무 치명적인 효과 KD의 셀에 고 무조건 KD 종양 개발의 부족 귀 착될 수 있었다 하는 동안 종양 성장의 다른 단계에서 단백질의 역할의 분석을 가능 하의 이점이 있다.
다양 한 조건부 KD 시스템 안정적인 KD의 한계를 해결 하기 위해 개발 되었습니다. 조건부 유전자 표정 시스템 포함 Ecdysone 유도할 수 있는 overexpression 시스템, 시 토 크롬 P-450 유도 시스템1, 그리고 항생물질 규제 유전자 식 시스템. 항생물질 통제 유전자 표정 시스템 항생제 항생물질 (또는 그것의 보다 안정적인 아날로그-doxycycline)의 추가 따라 shRNA의 표현 제어할을 수 있습니다. Tet-켜 짐 시스템 shRNA 표현의 항생물질/doxycycline KD, 유전자 발현의 결과로 존재 유도 된다 Tet 오프 시스템에 shRNA 표현의 항생물질 인 유전자 발현의 억제. 항생물질을 유도할 수 있는 시스템의 결점은 이전에 보고 된 저급 shRNA doxycycline-소위 시키는6,7의 부재에서의 표현의. Tet에 시스템 여기에 설명 된, 항생물질의 관리에 따라 관심의 shRNA의 발기인 영역이 H1 내 Tet 응답 요소 (TRE) 시퀀스에 constitutively 표현된 항생물질 진압 (TetR) 단백질 바인딩 표시 되지 않습니다. ShRNA 표현과 저해 항생물질 종속 방식으로8,9에 관심사의 단백질의 번역의 결과.
다른 사용 가능한 Tet-켜 짐 시스템 포함 동시 노크-TetO 시퀀스 및 TATA 상자와 전사 TATA 상자 및 인접 시퀀스 요소 (PSE) 사이의 시작 찬 외에 의해 개발 된 사이트의. 그러나 10 이 시스템 shRNA 식,, 비 유도 된 상태에서 규제 하는 항생물질의 유독한 복용량의 낮은 수준 shRNA 보다 적게 표현 됩니다 필요 합니다. Krüppel 관련 상자 (리아) 기반 Tet-켜 짐 시스템11 리아를, 과목 유전자 transcriptional 억제 하 리아 바인딩 사이트의 3 kb 범위 내에 있는 아연 손가락 단백질을 포함 한다. 공상 단백질 tTRKRAB TetO, 바인딩할 수 및 큰-DNA 제어 용량 범위, 때문 TetO 할 하지 필요 전사 사이 제한 시작 사이트 및 발기인 고 낮은 충격 발기인의 활동에. 유발 되지 않은 상태에서이 제어 RNA 간섭 시스템 shRNA11,12;의 유출 된 식의 하위 수준 표시를 보고 되었다 그러나, 그것은 연속, 2-벡터 복제 접근을 필요로 한다. 이전 개발된 조건부 KD 시스템 overexpression 시스템 Ecdysone 유도할 수 있는 등 시 토 크롬 P-450 유도 시스템에 비해 항생물질 규제 시스템의 견고성 및 가역, 장점이 이며 따라서 가장은 일상적으로 시스템13사용. 이 프로토콜에 사용 되는 시스템은 듀얼 TetO 노크에서 시스템 및 리아 Tet-켜 짐 시스템의 이점을 정직, 단일 벡터 클로닝, 여러 클론의 빠른 생성을 허용을 요구 하 고 그것은 전시에 시키는의 매우 낮은 수준으로는 doxycycline의 부재입니다.
TME 암 개발에 대 한 중요 하다입니다. 종양의 성장을 촉진 하기 위하여 암 세포 염증 monocytes 혈 단백질을 은닉 하 여 모집 합니다. 모집된 monocytes 종양 침투 하 고 종양 성장 및 전이에 기여 하는 프로 tumorigenic Tam으로 차별화 합니다. 면역 세포 신규 모집의 생체 외에서 연구 활용 마이그레이션 분석 실험, Boyden 챔버 시험 되 고 널리 사용14,15,,1617. 이 분석 결과에서 chemoattractant 단백질 소스, 예를 들어 암 세포, 또는 순화 된 단백질은 아래쪽 챔버에 배치 됩니다. 면역 세포는 아래쪽 구획에서 다공성 막으로 분리 된 상단 챔버에 배치 됩니다. 셀의 chemoattractant, 그리고 그는 막의 더 낮은 측에 발견 증가 그라데이션으로 마이그레이션 스테인드 고 현미경 계산. 여기 우리가 테스트 플라스 미노 겐 활성 제 억제 물 1 (파이-1)의 chemoattractant 함수에 monocytes 파이-1의 표현 doxycycline 추가 의해 통제 된다 안정, 유도할 수 있는 암 세포 라인을 생성 하 여. 우리는 monocyte 마이그레이션에서 파이-1의 역할을 평가 하기 위해 Boyden 챔버 마이그레이션 분석 결과에서 인간의 기본 monocytes를 사용 합니다. 인간의 기본 monocytes 그리고 THP1 같은 널리 사용 되는 monocytic 셀 라인의 차이점 보고 되었습니다 및 다른 cytokine 표현 패턴18; 포함 예를 들어 THP1 세포에서 TNF-α 식 수준에 5-10 배 증가 인간 monocytes19에 비해. THP1 셀 인간의 백혈병 monocytic 세포에서 파생 됩니다, 그리고 쉽게 유지, 평균 19-50 h20의 시간을 두 배로 증식 하는. 그와 반대로, 인간 monocytes 성장 요인의 부재에는 짧은 수명이 특징입니다. Monocytes는 가변성의 상당량 발생는 개인 중 고 정화 방법에 따라 기증자의 혈액에서 정화 이후 다른 세포 유형으로 오염 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 기본 monocytes 관련 되며 기본 monocytes를 사용 하 여 생물학 연구19에서 monocytic 셀 라인으로 얻은 결과 확인 또는 사용 권장 되었습니다. 여기는 말 초 혈액에서 인간의 기본 monocytes의 정화에 대 한 프로토콜에 설명합니다. Monocyte 정화의 다른 방법 밀도 그라데이션 및 접착 프로토콜 및 단일 그라디언트 Ficoll-Hypaque Percoll 그라데이션21다음의 2 단계 절차를 포함 됩니다. 70-90% 사이 그 방법 범위에 의해 얻은 monocyte 인구의 순도. 여기 설명 하는 방법을 뒤에는 부정적인 면역 선택22 밀도 그라디언트를 사용 하 여 및 수 있습니다 항 체와 직접 접촉 하지 않고 인간 monocytes의 정화 함으로써 그들의 우발적인 활성화를 방지 하 고 발생 하는 > monocytes의 95% 순수 인구입니다.
여기에 제시 된 프로토콜 암 파생 secreted 단백질의 파이 1 monocytes에 chemoattractant 효과 연구를 유전자 발현 KD 인간 암 세포 라인에 대 한 기능 Tet에 시스템 설정에 사용 됩니다. 파이-1 다양 한 종양에 의해 overexpressed와 식을 역설적으로 가난한 임상 결과23,24상관. 파이-1의 프로 tumorigenic 역할의 프로-신생의 결과 이며, 안티-apoptotic 기능25,26. 파이-1 세포 염증27의 사이트에 모집을 홍보 하 여 염증에 기여할 표시 되었습니다. 파이-1 부드러운 근육 cellmigration,2829 를 조성 하 고 맥 1 종속 macrophage 마이그레이션30에 참여를 표시 했다. 파이 1 overexpression 또한 크게 B16F10 흑색 종 종양31에 Raw 264.7 세포의 모집을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다. 그러나, TAM 마이그레이션에서 파이-1의 역할 자세히 조사 하지는. 우리는 파이-1 암 세포에 monocytes를 유치 하는 여부의 질문에 대답을 설명 된 프로토콜을 사용 합니다. 이 방법론 암 세포에서 secreted 단백질을 침묵 하 고는 TME의 구성 요소를 분석 하 여 종양과 TME 사이 누화의 해 부를 수 있습니다.
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Protocol
건강 한 지원자에서 얻은 인간 monocytes를 사용 하 여 프로토콜 섹션 아동 병원 로스 앤젤레스 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다 및 인간의 재료 아래 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다. 프로토콜 번호: CCI 08 00208.
1. 암 세포 라인 항생물질 규제 shRNA 식의 준비
- ShRNA Tet pLKO 순수 하지 않아 벡터에 파이-1의 복제 8 , 9
- ShRNA 올리고 나이어 에코리 분열 5' 끝, 감각 시퀀스, 6 뉴클레오티드 루프 센스 순서에 사이트를 포함 하는 디자인.
참고: 일반적인 oligonucleotides 설계 되었습니다 다음과 같습니다: 앞으로 올리고: 5' CCGG-19-21 혈압 감지-CTCGAG-19-21 혈압 antisense-TTTTT, 역방향 올리고: 5' AATTAAAAA-19-21 혈압 감지-CTCGAG-19-21 혈압 antisense 3'. 올리고 머 디자인에 대 한 자세한 프로토콜 8에서 찾을 수 있습니다. 이 연구에서는 3 shRNA 시퀀스 파이-1에 대 한 강한 입을 효과 대 한 테스트 되었습니다: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333및 스크램블된33 표 1에 포함 됩니다. - ShRNA 올리고 anneal와 뒤섞여 shRNA 올리고.
- 물에 100 µ m oligonucleotides를 다시 구성 하 고 믹스 1 µ L 앞으로 oligonucleotide, 1 µ L 역 oligonucleotide 8 µ L H2o.
- oligonucleotides anneal, 다음 믹스: 1 µ L oligonucleotide 혼합물, 5 µ L 버퍼 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7.5, 50 m 염화 나트륨 (NaCl), 10 m m m 염화 마그네슘 (MgCl2), 1 m m dithioerythritol (DTE) 및 44 µ H L 2 O.
- 5 분 동안 95 ° C에 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 열 cycler에 있는 혼합물을 품 어, 악기, 떨어져 전환 하 고 실내 온도 (RT)에를 때까지 기다립니다.
- 5 µ L 3 M 아세트산 나트륨 pH 5.2 ~ 50 µ L 단련 oligonucleotides 추가 하 여 단련된 oligonucleotides 침전.
- 100 µ L 감기 100% 에탄올 (EtOH)를 추가 하 고-80 ° c.에 30 분 동안 품 어 4 ° c.에 30 분 동안 최대 속도로 벤치탑 원심 분리기에 원심
- 상쾌한을 제거, 추가 500 µ L 찬 70 %EtOH, 30 분 동안 원심 분리기 상쾌한, 제거 하 고 20 µ L H2o. 펠 릿을 녹
- 분 광 광도 법, 260에서 흡 광도 측정 하 여 단련된 oligonucleotides의 농도 평가 nm. Oligonucleotides 1 ng / µ L의 최종 농도에 희석.
- Luria Bertani (파운드) 매체와 파운드 한 천 배지 준비 합니다.
- LB 매체, 디졸브 10 g tryptone 5 g 효 모 추출 물, 10 g 물 1 L에 NaCl. PH 7.0 1를 사용 하 여 매체의 pH 조정 N NaOH와 오토 클레이 브.
- 파운드 한 천 배지, 파운드 매체에의 한 천 15 g/L를 추가 합니다. 오토 클레이 브와 멋진 약 50 ° c.까지 항생제를 추가 하 고 접시를 붓는 다.
- Tet pLKO 순수 하지 않아 벡터와 불리고 박테리아 행진 ( 테이블의 자료를 참조 하는) 파운드에 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 보충 하 고 밤새 품 어 (O/N) 37 ° c.에
- 100 mL 파운드 매체 100 µ g/mL 암 피 실린 (LB/암 피 실린) 접시에서 1 식민지와 보충 접종 및 O/N 37 ° c.에 떨고 함께 성장
- IsolateTet-pLKO-순수 하지 않아 플라스 미드 분리 키트를 사용 하 여 100 mL 세균성 문화에서.
- 다음과 같이 AgeI 및 EcoRI 금지 효소로 Tet pLKO 순수 하지 않아 벡터에 대 한 제한 반응 준비: 1 µ L EcoRI, 1 µ L AgeI, 5 µ L 10 x 버퍼, 1 µ L 플라스 미드 DNA (1 µ g), 42 µ H L2h 37 ° c.에 오 품 어 1 쪼개진된 벡터의 충분히 얻을, 최대 5 x 50 µ L 반응 준비.
- 1 %agarose 젤을 사용 하 여 DNA 정제 키트를 사용 하 여 agarose 젤에서 쪼개진된 벡터를 정화. DNA의 수율을 높이기 위해 큰 우물 agarose 젤 빗을 사용 하 여 및 신중 하 게 메스를 사용 하 여 밴드에서는 agarose의 대부분을 제거 하 여 agarose 젤에서 DNA 비율을 최소화 합니다.
- 결 찰 반응 믹스를 다음과 같이 준비: 1 ng 단련 oligonucleotides, 50 ng 쪼개진된 벡터, 2 µ L 10 x 리가 버퍼, 1 µ L 리가, 및 최대 20 µ L. 물 선 16 단련된 shRNA oligonucleotides 벡터 ° C O/명.
- 또한, oligonucleotides 거짓 긍정적인 식민지 귀 착될 것 이다 uncleaved, 부분적으로 쪼개진, 그리고 자기 합자 벡터에 대 한 계정 없이 부정적인 제어 반응 준비.
- 표준 변환 기술을 사용 하 여, 직접 포함 lentiviral 벡터의 동종 재결합을 방지 하기 위해 설계 된 화학적으로 유능한 세균성 세포로 변환 결 찰 혼합물을 반복 합니다.
- 암 피 실린 O/N 37 ° c.에 접시에 박테리아를 성장
참고: 위성 식민지의 성장을 발생, 전이 반복 하 고 성장을 감속 하 고 이렇게 방지 위성 식민지를 30 ° C에서 박테리아 성장. - 성공적인 결 찰을 확인 하려면 선택 10-20 단 하나 식민지, 접종 2 mL LB/암 피 실린 문화와 암 피 실린 플레이트 사이 주식 접시로 (나중에 사용 될 긍정적인 클론으로)을. O/N 37 ° c.에 떨고 액체 문화를 성장 플레이트 O/N 37 ° c.에 품 어
- Parafilm와 6 ° c.에 게 접시를 봉인
- 플라스 미드 DNA 플라스 미드 분리 키트를 사용 하 여 액체 문화에서 분리.
- 암 피 실린 내성 식민지 XhoI 효소를 사용 하 여 격리 하는 플라스 미드 DNA의 제한 분석을 수행 합니다. 각 복제본에 대 한 준비 다음 반응 혼합: 0.5 µ L XhoI, 2.5 µ L 10 x 버퍼, 1 µ L 플라스 미드 DNA (0.5 µ g), 그리고 21 µ H L2오 품 37 ° c.에서 1 h 1 %agarose 젤에 반응을 실행 하 여 제한 반응의 결과 분석 합니다.
참고: XhoI에 의해 죽 습 WT 벡터의 제한 분석 3 조각이 생성 됩니다: 8,447, 1800, 및 200 bp. 1800의 Tet pLKO 순수 하지 않아 벡터에 투표자 시퀀스 bp가 긍정적인 클론 shRNA-파이-1와 XhoI 다이제스트 크기의 DNA 파편 귀 착될 것 이다: 8,447, 190, 및 130 bp. 그림 1에서 보듯이 2000 bp 조각에서에서 찾을 수 없는 DNA 암 피 실린 내성 식민지에서 분리: 3, 8, 및 11. Oligonucleotides의 디자인에 따라 길이 긍정적인 식민지에서 DNA에서 얻은 조각 수는 달라질 수 있습니다. - 연속8,9Tet pLKO 순수 하지 않아 벡터에 shRNA 시퀀스의 적절 한 삽입을 확인 합니다.
- 100 mL LB/암 피 실린 문화 정확한 복제를 포함 하는 식민지와 inoculate 및 O/N 37 ° c.에 성장
- 플라스 미드 DNA 플라스 미드 분리 키트를 사용 하 여 격리 합니다.
- ShRNA 올리고 나이어 에코리 분열 5' 끝, 감각 시퀀스, 6 뉴클레오티드 루프 센스 순서에 사이트를 포함 하는 디자인.
- Lentivirus 입자의 세대입니다.
- 15 cm 조직 문화 접시 코트 폴 리-L-리 신 접시의 표면에 0.01%의 살 균 물 솔루션을 취재 하 여 폴 리-L-리 신 15 분에 대 한 실시간에 잠복기 포부에 의해 솔루션 제거와 요리를 건조.
- 씨앗 5 x 106 인간 미 발달 신장 293 세포 15 cm 폴 리-L-리 신-코팅 접시에 (HEK293) 세포와 문화 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 매체에 보충 10 %FBS 1% 페니실린/스 믹스 (펜/Strep) 37 ° C, 5 %CO 2 70 %confluency 도달할 때까지.
- 바이러스 성 입자를 생성 하려면 transfect HEK293 세포와 25 µ g pLKO-Tet-에-shRNA, 25 µ g psPAX, (포장 플라스 미드), 5 µ g pMD2.G 플라스 미드 (봉투 표현 플라스 미드) transfection 시 약을 사용 하 여.
참고: psPAX 및 pMD2.G 플라스 미드는 디디에 Trono 연구소 (Ecole Polytechnique Federale 드 로잔, 스위스)에서 선물. - 10 m m 나트륨 낙 산 염 및 20 mM HEPES ph 7.2, 및 8 h에 대 한 자란 보충 DMEM 매체 변경 하 여 다음 날 HEK293 세포 유도.
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 셀을 세척 하 고 신선한 DMEM 매체 포함 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) pH 7.2의 25 mL를 추가. 48 h에 대 한 37 ° C에 외피, 후 신중 하 게 pipetting;에 의해 바이러스를 포함 하는 매체를 수집 유출을 하지 마십시오.
- HEK293 세포를 제거 하는 0.45 μ M 주사기 필터를 통해 수집 된 매체를 필터링 합니다. 바이러스 성 입자를 포함 하는 매체는 즉시 사용 하거나 나중에 사용-80 ° C에서 저장 수 있습니다.
- 안정적으로 transfected 세포의 생성
- HCT116 결 장 암 세포 및 세포/잘 DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 보충에 50000에서 MDA-MB-231 유방암 세포 씨 펜/Strep 12-잘 접시에. 세포는 60-70% 합칠 때까지 5% CO2 에서 37 ° C에서 품 어.
- PBS로 세포 세척 하 고 포함 하는 바이러스의 1 mL을 추가 중간 암 세포와 O/N 5% CO2에서 37 ° C에서 품 어. 컨트롤 추가 10 %FBS 1% 보충 하는 신선한 DMEM 매체의 1 mL 펜/Strep 암 세포와 함께 2 웰 스.
- 조심 스럽게 포부에 의해 매체를 포함 하는 바이러스를 제거. PBS로 세포 세척 하 고 매체를 변경 DMEM 10% (v/v) 항생물질 무료 (Tet 무료) FBS와 1% 펜/Strep.
- 72 h 후 PBS로 세포 세척 하 고 10 %DMEM 매체 변경 Tet 무료 FBS 1% 펜/Strep, 1 µ g/mL puromycin 바이러스 페 셀 선택 영역에 대 한.
- 셀 라인 사용에 따라 비 불리고 셀에 puromycin 농도 (0.1, 0.5, 1, 2, 및 5 µ g/mL)의 범위를 테스트 하 고 제어 셀 생존 최저 농도 선택 하 여 최적의 선택 위한 puromycin 농도 조정 문화의 3 일 후
- 3-14 일 동안 puromycin 존재는 세포를 배양 하 여 바이러스 불리고 셀을 선택 합니다. 컨트롤 puromycin 그리고 puromycin 없이 하나를 포함 하는 매체와 하나 비 불리고 세포와 2 개의 추가적인 우물을 준비 합니다. 제어 우물에 비해 바이러스 불리고 세포와 세포의 부분 살인 puromycin 우물에 의해 관찰 합니다.
참고: 비 불리고 셀 puromycin 존재는 성장 하지 않습니다. - Puromycin 저항 HCT116 결 장 암과 유방암 세포 MDA-MB-231에서 조건부 KD의 효율성을 확인 합니다.
참고: doxycycline의 효과적인 농도 사용 세포 선으로 변화할 것 이다 하 고 (2 µ g/mL를 100 ng/mL)에서 일반적으로 적정 해야 합니다.- 셀에 대 한 독성 아니라 downregulating 관심사의 단백질의 표현에에서 효과적인 doxycycline 농도 결정 합니다. 이 프로토콜에 1 µ g/mL는 성공적으로 사용 된 생체 외에서했다.
- 존재와 부재의 0.1, 1, 및 2 µ g/mL doxycycline 72 h에 대 한 셀을 문화. 표현의 downregulated 단백질의 수준을 확인 (여기, 파이-1) 서 부에 의해 세포 lysate에서 오 점 분석. ShRNA 스크램블된 제어 셀에 조건에 따라 표현 HCT116와 MDA-MB-231 셀을 비교 합니다.
- 조건 화 된 매체의 준비
- 안정적으로 doxycycline와 페 셀의 씨앗 1 x 106 10 cm 요리에서 pLKO shRNA 포함 lentiviruses 통제.
- 10% FBS Tet 무료와 1% 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 중간에 셀 라인 성장 펜/연쇄 상 부재와 1 µ g/mL doxycycline 5% CO2, 37 ℃에서 72 h의 존재에 매일 신선한 doxycycline 추가.
참고: RPMI 매체 문화 조건 monocytes의와 호환 됩니다. Doxycycline는 가벼운 과민 한 화합물 이다. 알루미늄 호 일로 덮 음에 의해 빛에서 셀 문화를 보호 하 고 직접 가벼운 노출에서 작업 하지 마십시오. - Pipetting으로 매체를 수집, 0.45 μ m 필터를 통해 필터링 하 고 aliquots에-80 ℃에서 동결.
2입니다. 인간의 혈액에서 Monocytes의 격리
- Monocytes 인간 주변 혈액에서 분리.
참고: 인간의 기본 monocytes 건강 한 혈소판 기증자 로부터 얻은 백혈구 필터에 집중 되어 백혈구의 7 mL에서 격리 됩니다. 기증자, 따라 한 백혈구 필터 1 x 109 와 2 x 109 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs), 약 10%는의 구성 monocytes의 생성 합니다.- 층 류 캐비닛에서 워크스테이션을 준비 합니다.
- 가 위 및 층 류 캐비닛 자외선 (UV) 30 분에 대 한 소독.
- 70% EtOH air-dry 내부와 백혈구 필터 스프레이 층 류 캐비닛.
- 가 위로 백혈구 필터의 양쪽 끝을 잘라내어 50 mL 튜브 필터의 내용을 비어.
- 추가 PBS 1% (v/v) FBS (PBS/FBS)를 포함 하 여 90 mL에 희석.
- 15 mL 밀도 그라데이션 솔루션 3 x 50 mL 튜브를 준비 합니다. 피 펫 컨트롤러를 사용 하 여 그라데이션 솔루션 레이어 혼합 방지 중력 흐름에 준비가 밀도에 천천히 30 mL PBS/FBS 희석 혈액의 레이어.
- 25 분을 위한 브레이크 없이 RT에서 400 x g에서 스윙으로 터에서 원심.
- 상위 레이어를 처분 하 고 신선한 50 mL 튜브에 PBMCs를 포함 하는 중간 계층을 전송.
- PBS/FBS 50 mL와 10 분에 대 한 RT에서 120 x g에서 원심 분리기 제거 혈소판을 포함 하는 상쾌한 추가 합니다. 두 번 이상이 단계를 반복 합니다.
- 50 ml PBS/FBS의 펠 릿을 resuspend과 PBMCs는 hemocytometer를 사용 하 여. RT에서 120 x g에서 centrifuge 고 PBS/FBS 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) 5 x 107 셀/mL의 최종 농도를 포함 하는 펠 릿을 resuspend.
- 부정적인 선택 키트를 사용 하 여 비 monocytic 세포의 고갈으로 monocytes를 풍부 하 게.
주: 부정적인 선택 키트 T 세포, NK 세포, 호 중구, B 세포, granulocytes, 및 적혈구에 대하여 항 체 (c d 2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, 및 glycophorin A)의 칵테일을 사용합니다. 항 체 복합물이 아닌 monocytic 세포의 표면에 고 dextran 자석 입자에 바인딩합니다. 튜브는 자석에 놓으면 구슬 튜브의 벽에 고착 하 고 솔루션에서 비 monocytic 셀을 제거 합니다.- 5 x 107 PBMCs/mL의 1 mL를 50 µ L 항 체 칵테일을 추가, 피 펫, 혼합 및 실시간 추가 50 µ L 자석 구슬 칵테일 항 체와 PBMCs에서 10 분 동안 품 어, 피 펫, 혼합 및 실시간에서 또 다른 10 분 동안 품 어
- 25 mL 및 50 mL 튜브를 수용할 수 있는 자석에서 PBMC 섞어 배치 PBS/FBS/EDTA를 합계 한다. 실시간 자기 구슬 튜브의 벽에 준수 하 고 격리 솔루션에서 비 monocytic 세포에서 10 분 동안 품 어.
- 25 mL 피 펫을 사용 하 여, 자석에 튜브에서 monocytes를 포함 하는 솔루션을 제거 합니다. 피펫으로와 튜브의 측면을 만지지를 주의 해야 합니다.
- RT에서 250 x g에서 솔루션 원심, 상쾌한를 제거 하 고 10% FBS Tet 무료 및 1% 포함 된 RPMI 매체에 monocytes를 포함 하는 펠 릿 resuspend 펜/Strep.
3. Boyden 챔버 마이그레이션 분석 결과
- 초순 수 100ml에 BSA의 1 g을 용 해 하 여 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션을 준비 하 고 소독 0.2 µ m 기 공 크기를 통해 필터링.
- 1% 살 균 BSA 솔루션 O/N 향상 된 준수 대 식 세포의 막의 다공성 막 삽입을 품 어. Monocytes/대 식 세포, 5-8 µ m 기 공 크기 삽입 사용 하 여.
- 1 %BSA 솔루션 무 균 조직 문화 접시와 접시에 삽입을 배치. 삽입 내부 200 µ L 1 %BSA 솔루션을 적용 합니다.
- 두 번 살 균 PBS와 필터 내부 적용 PBS 가득 접시에 그들을 배치 하 여 삽입을 세척.
- 10% FBS Tet 무료 및 1% 포함 된 0.5 mL RPMI 매체에 40000 HCT116 또는 MDA-MB-231 셀 씨 펜/Strep 잘, 3 중에는 24-잘 접시에서 당. 또는, chemoattractant의 근원으로 우물에서 이전에 생성 된 조건된 매체의 0.5 mL 장소.
- 다음 날에는 준비에서 접시 8000 monocytes 10% FBS Tet 무료 및 1% 포함 된 RPMI 매체의 0.3 mL 볼륨에 삽입 펜/연쇄 상, 3 중, 5% CO2에서 37 ° C에서 품 어와.
- 48 h 후 삽입을 수집 합니다.
참고: 실험의 길이 셀 삽입 다른 보육 시간에 수집 됩니다 시간 과정 실험을 수행 하 여 사용 하 고 특정 조건에 따라 최적화 해야 합니다.- 초과 매체에서 흔들어과 정확 하 게 마이그레이션되지 않은 세포를 제거 하 면 밀고 주걱으로 안쪽 표면을 슬쩍.
- 라이트-Giemsa 메서드를 사용 하 여 삽입의 외부 측면 얼룩.
- 신중 하 게 확인 마이그레이션된 세포와 필터의 측 직면 하 고 높은 점도 현미경 침수 기름에 3 삽입/유리 슬라이드를 탑재 합니다.
- 20 X 목표는 가벼운 현미경을 사용 하 여 슬라이드 이미지. 9 필드/필터의 사진을 찍을. 9 필드/필터에 마이그레이션된 세포를 계산 합니다.
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Representative Results
3 shRNA 시퀀스에 대 한 가장 효율적인 KD의 파이-1 테스트 되었습니다. 이 위해, 파이 1과 스크램블된 (표 1)에 대 한 shRNA 시퀀스 Tet pLKO 순수 하지 않아 식 벡터 프로토콜 위에서 설명한 다음에 복제 되었다. HT 1080 fibrosarcoma 셀 라인은 안정적으로 생성 된 구문 페 하 고 세포는 3 일 동안 doxycycline로 치료 했다. 파이-1의 식 서 부 (그림 2Ablotting에 의해 확인 된) 파이 1, tubulin 해당 밴드의 강도 densitometry 분석 했다. 항생물질 규제와 페 가장 효과적인 KD 시퀀스 (shRNA 2), 우리 또한 생성 된 MDA-MB-231 상피 유 방 선 암 세포 (그림 2B)와 HCT116 대 장 암 세포 (그림 2C) 안정적으로 사용 하 여 pLKO-shRNA2-파이-1 식 벡터 (그리고 제어로 뒤섞여 shRNA). 우리는 MDA-MB-231 셀 라인 (그림 2B)에 파이-1 식의 74% 감소 및 HCT116 셀 라인 doxycycline (1 µ g/mL)의 존재에서 17.5% 감소 달성(그림 2C) 부 럽 고의 densitometric 분석 하 여 평가 밴드입니다. Boyden 챔버 분석 결과 암 세포로 monocytes 마이그레이션 계량에 사용 되었다. 우리는 암 세포 유래 파이 1 쪽으로 종양 세포, monocytes의 마이그레이션을 촉진 하 고 따라서 마이그레이션 덜 관찰 될 것 입 때 파이 1 downregulated doxycycline의 추가 의해 가설. 암 세포 doxycycline로 3 일 동안 치료 했다 고에 40, 000 셀/잘 24-잘 접시의 바닥에 시드 했다. 정화 주 인간 monocytes의 분석 결과 24 시간 후 최고 챔버에 적용 된, 막의 아래쪽에 연결 하는 monocytes는 스테인드 현미경 계산 했다. 우리는 아목시실린과의 부재 및 따라서 파이-1의 존재, MDA-MB-231 및 HCT116 셀 (파이 1 shRNA 및 스크램블된 컨트롤), 크게 증가 인간 monocytes (그림 3)의 마이그레이션 방법을 보여 줍니다. Monocytes의 마이그레이션 doxycycline 공동 문화에 추가 되었습니다 하 고 종양 세포에 의해 파이-1의 생산은 아래로 (그림 3A, C) 33%, 74%로 억제 다음 이었다. Monocyte 마이그레이션 없음 억제 또한 doxycycline monocyte 마이그레이션에 영향을 주지 않습니다 금지 했다 표시 스크램블된 shRNA 컨트롤과 불리고 종양 세포로 관찰 되었다. Doxycycline 치료 암 세포의 조절된 매체 chemoattractants (그림 3B, D)의 근원으로 우물의 하단에 배치 했다 때 비슷한 결과 얻은 했다.
그림 1 . 16 세균성 식민지에서 추출한 DNA의 XhoI 제한 분석. DNA 16 세균성 식민지에서 추출 하 고 XhoI 효소를 가진 제한 반응 대상이 되었다. 결과 DNA 파편은 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 분석 되었다. 긍정적인 복제품 (3, 8, 및 11 레인) XhoI 제한 다이제스트 후 2 kb 조각 부족 화살표와 함께 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 암 세포 라인에 조건부 KD의 파이-1 식. 안정적 셀 라인에서 파이-1 식의 분석을 더럽혀 서 항생물질 규제 pLKO-shRNA-파이-1 (shRNA 1-3) 페 고 식 벡터 doxycycline 치료 3 일 후 발진. (A) HT1080입니다. (B) MDA-MB-231. (C) HCT116입니다. 밴드의 Densitometry 분석 아래 서쪽의 차선 표시 됩니다 tubulin 밴드 강도 이상 파이 1 강도의 비율로 서 지우고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 파이 1 대 식 세포 이동 촉진. MDA-MB-231 (A)와 (C) HCT116 셀 라인 안정적 shRNA 파이-1에 대 한 2와 뒤섞여 shRNA 조건에 따라 표현 하는 벡터와 페 인간 monocytes의 마이그레이션 Boyden 챔버 분석 결과 사용 하 여 측정. 암 세포 3 일 동안 doxycycline 치료 되었고 3 중에서 24-잘 접시에 시드. 인간의 기본 monocytes 삽입 상단 적용 되었다. 24 시간 후 필터의 더 낮은 측에 monocytes 스테인드 되었고 현미경 계산. 바른된 매체를 향해 인간 monocytes의 MDA-MB-231 (B)와 (D) 이상 72 h 조건부로 존재와 아목시실린과의 부재에서 파이-1을 표현 하는 HCT116 셀 라인 생성. 데이터 [± 표준 편차 (SD)] 기술 triplicates의 평균을 나타냅니다. 각 복제에 대 한 마이그레이션된 monocytes는 객관적인 배율 X 20에서 9 필드에 포함 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| Oligo의 이름 | 시퀀스 | ||||
| shRNA 1 (안티 파이-1 시퀀스 1- 8 ) | 앞으로: | shPAI 1A5' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT 3' | |||
| 리버스: | shPAI-1B 5' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG 3' | ||||
| shRNA 2: (파이-1 안티 순서 2) | 앞으로: | shPAI-1 C 5'-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3' | |||
| 리버스: | shPAI-1 D 5'-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3' | ||||
| shRNA 3 (안티 파이-1 순서-3 9) | 앞으로: | shPAI-1E 5'-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3' | |||
| 리버스: | shPAI 1 층 5'-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3' | ||||
| 출 격 (순서-4 출 격 9) | 앞으로: | 1 5'-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3 출 격 ' | |||
| 리버스: | 출 격 2 5'-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3' | ||||
표 1. shRNA 시퀀스. 여기 3 shRNA 시퀀스 파이-1에 대 한 강한 입을 효과 대 한 테스트 되었습니다: 1, 2, 3, 그리고 스크램블 shRNA shRNA shRNA
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Discussion
다양 한 종류의 세포로 구성은 TME 암 개발에 대 한 결정적 이다. 최적의 성장 조건 확인, 암 세포는 monocytes 혈 요인의 분 비를 통해 유치. 여기 선물이 종양 세포에서 생체 외에서의해 monocyte 모집의 메커니즘을 공부에 대 한 프로토콜. 이 위해 유도할 수 있는 유전자 표현 시스템, 기본 인간 monocytes 그리고 마이그레이션 분석 결과, Boyden 챔버 분석 결과의 예를 들어 정화의 조합이 사용 됩니다.
제시 프로토콜의 첫 번째 중요 한 단계 항상 연속 평가 한다 Tet에 벡터에 shRNA 시퀀스의 정확한 복제를 확인 하는 것입니다. 기능 안정적인 Tet에 셀 라인의 더 설립 서양 blotting에 의해 doxycycline 존재 KD를 테스트 하 여 확인 해야 합니다. 적용된 doxycycline 양의 셀 라인, 사이 다를 수 있습니다 그리고 그러므로 그것은 세포에 효과적인 농도 및 독성에 대 한 KD에 대 한 테스트 하는 것이 좋습니다. 항생물질을 유도할 수 있는 시스템의 알려진된 단점은 그들의 시키는6,7입니다. 존재와 아목시실린과의 부재에서 감지 하는 단백질의 양은 측정 하 고이 효과 대 한 계정에 스크램블된 컨트롤에 비교 해야 합니다. 그림 2에서 같이 생체 외에서 실험에 저수준 시키는 shRNA2 및 shRNA3 KD와 관찰 됩니다. 또한, 항상를 사용 하 여 생체 외에서 항생물질 무료 혈 청 단백질 수준의 제어 조건에서 downregulation를 피하기 위해 중요 하다. 이 프로토콜에 사용 되는 시스템 장점이 다른 Tet-켜 짐 시스템에 단일 벡터 클로닝을 필요로 여러 클론의 빠른 세대 있으며 시키는 매우 낮은 수준의 전시.
혈액에서 기본 인간 monocytes를 얻기에 있는 중요 한 단계 희석된 혈액의 느린 레이어 링에 의존 하는 조밀도 기온 변화도 통해 좋은 그라데이션 분리를 얻는 이다. 제대로 그것은 항 체 칵테일 및 자석 구슬 피 정지에 추가의 금액을 결정할 것입니다 때문에 부정적인 선택 단계 전에 셀의 수를 추정 하는 프로토콜의 또 다른 중요 한 단계가입니다. 실험의 재현성을 확보, 복제 실험에 더 이상의 혈액 기증자를 사용 해야 합니다. 때문에 낮은 림프 구 오염 보증이 기술은 monocyte 정화 밀도 그라데이션 및 접착 기반 프로토콜34 및 단일 그라디언트21, 2 단계 절차를 포함 하 여 기존 대안 보다는 수준과 높은 순도 (> 95%) 획득된 monocytes의. 이후 비 monocytic 세포 유형 부정적인 선택에 의해 PBMC 혼합물에서 제거 됩니다, monocytes 칵테일, 항 체에 항 체와 직접 접촉에 따라서 monocytes 항 체와의 상호 작용에 의해 활성화 되 고의 위험에 가져오지 않은 것 최소 이다입니다. 얻은 세포의 다른 응용 프로그램은 인간 monocytes immunodeficient 쥐로 주사 된다 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 통해 세포로 monocytes의 감 별 법을 포함할 수 있습니다. 프로토콜의 수정 일반적으로 PBMCs의 세척 단계 동안 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 사용을 포함합니다. 이 수정 삼투성 압력을 적용 하 여 적혈구의 추가 제거를 목표로 합니다. 기술의 한계는 시 약의 지정된 된 금액을 사용 하 여 얻을 수 있는 대 식 세포의 제한 된 수를 포함 합니다.
Boyden 챔버 마이그레이션 분석 결과 secreted 단백질 분석 하는 빠르고 간단한 방법 또는 셀 라인 마이그레이션 다른 종류의 세포를 자극. 이 분석 결과의 함정에는 낮은 감도 세포 세포 죽음을 받고 대 한 회계 하지 포함 됩니다. 그 문제를 해결 하는 방법은 미세 분석 결과 및 마이그레이션은 짧은 기간 동안 측정 하는 시간-과정 실험을 기반으로 같은 다른 분석 결과와 결과 확인 것입니다. 작은 인구를 제외 하 고 성숙한 monocytes vivo에서35,36; 증식 하지 않습니다. 그러나 다른 셀 사용 하는 경우 셀의 수에 있는 증가 피하기 위해 그들의 사단 주기 보다 짧은 시간 표시 막대를 선택 합니다. 또는, 세포 분열을 차단 하는 시 약 원래 도금된 핸드폰 번호를 변경 하지 않으려면 사용 해야 합니다.
여기에 제시 된 프로토콜 paracrine 기능 및 암 세포에 의해 은닉 하는 다른 단백질의 연구를 쉽게 적용할 수 있습니다. 조건부 KD 암 세포 라인의 가능한 응용 프로그램 중 하나 인 KD에 대 한 독성은 단백질의 역할을 공부 하 고 세포를 체 외에서 뿐만 아니라 vivo에서, 어디 Tet 통제 세포는 쥐로 xenotransplanted는 KD 유도 후 식 수에 doxycycline의 추가 의해 종양의 설립.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 원고를 교정에 대 한 재클린 로젠버그를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품은 미국 부의 보건 및 인적 서비스/국립 보건원 DeClerck에 부여와에 의해 지원 되었다 (5R01 CA 129377 부여)와 TJ 마르텔 재단. MH Kubala의 Saban 연구소 어린이 병원의 로스 앤젤레스에서 연구 경력 개발 장학금 상 받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
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