Summary
Este protocolo sirve como un esquema para establecer un sistema funcional de Tet-ON en líneas celulares de cáncer y su posterior utilización, en particular para estudiar el papel de proteínas derivadas de células de tumor en el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del tumor.
Abstract
siRNA y shRNA-mediada derribar los métodos de regulación de la expresión génica (KD) son herramientas muy valiosas para entender la función del gen y proteína. Sin embargo, en el caso que la KD de la proteína de interés tiene un efecto letal sobre las células o el efecto esperado del KD es dependiente del tiempo, incondicionales métodos KD no son apropiados. Sistemas condicionales son más adecuados en estos casos y han sido objeto de mucho interés. Estos incluyen sistemas de sobreexpresión de ecdisona-inducible, citocromo P-450 inducción sistema1, y la tetraciclina regulado sistemas de expresión de genes.
El sistema de expresión de gene de tetraciclina regulado permite control reversible sobre la expresión de la proteína por la inducción de expresión de shRNAs en presencia de tetraciclina. En este protocolo, se presenta un diseño experimental utilizando sistema Tet-ON funcional en líneas celulares de cáncer humano condicional regulación de la expresión génica. Entonces se demuestra el uso de este sistema en el estudio de la interacción monocito célula de tumor.
Introduction
Los macrófagos asociados tumor (TAMs) contribuyan al desarrollo de tumor por promover el crecimiento del tumor, metástasis y regular la respuesta inmune2. Cáncer células inflamatorias monocitos recluta, que infiltran el tumor y se diferencian en pro-tumorigenic TAMs3. Infiltración del tumor con TAMs correlaciona con mala evolución clínica y se ha relacionado con la función inmunosupresora de macrófagos4,5. Sin embargo, los mecanismos del reclutamiento de macrófagos que el tumor no se exploraron bien y una mejor comprensión de los caminos implicados es crucial para más adelanto del campo y prometedoras terapias. Uno de los retos en el estudio de las interacciones entre las células tumorales y células normales en el microambiente del tumor (TME) es la complejidad de los mecanismos y las células involucradas, que requieren enfoques en vitro que permiten la disección de la diafonía. Aquí presentamos una metodología versátil que puede ser aplicada para estudiar el efecto paracrino de un cáncer derivado de la célula, la proteína secretada sobre la migración de otros tipos celulares como macrófagos, en vitro. Utiliza un sistema donde la expresión de shRNA contra una cáncer derivado de células proteína que participa en el reclutamiento de monocitos está bajo el control del promotor inducible por tetraciclina, se cuantificaron el efecto paracrino de la proteína secretada en monocitos. En el presente Protocolo, la clonación de secuencias de shRNAs en la tetraciclina se presenta regulado vector seguido por generación de líneas celulares de cáncer estable. Además, la purificación de monocitos humanos primarios y un análisis de la cámara de Boyden se utilizan para analizar el efecto paracrino de una proteína de la célula de cáncer derivada sobre la migración de monocitos.
Downregulation de proteína codificación genes comúnmente se aplica con técnicas de siRNA y shRNA, aunque no sin limitaciones en su uso. La precipitación a largo plazo (KD) de genes puede provocar secundarias respuestas adaptativas de las células que interfieren con los resultados experimentales. Falta de control temporal sobre expresión génica hace difícil estudiar el papel dinámico de una proteína con el tiempo o el papel de una proteína crucial para la supervivencia de la célula. Esta cuestión es especialmente importante en entornos en vivo , donde el papel de una proteína en el desarrollo del tumor y la progresión podría requerir regulación a la baja de la expresión de la proteína de interés sólo después de establecido el tumor. KD condicional tiene la ventaja de evitar un pronto efecto letal del KD en las células y para permitir el análisis del papel de la proteína en diferentes etapas de crecimiento del tumor, mientras que KD incondicional podría resultar en la falta de desarrollo del tumor.
Un número de sistemas condicionales de KD se han desarrollado para abordar las limitaciones de la KD estable. Los sistemas de expresión génica condicional incluyen ecdisona-inducible sobreexpresión sistemas, el sistema de inducción de citocromo P-450 de1, y tetraciclina regulado sistemas de expresión de genes. Los sistemas de expresión de genes regulados por tetraciclina permiten control sobre la expresión de shRNAs sobre adición de antibiótico tetraciclina (o su análogo más estable - doxiciclina). En Tet-sobre los sistemas, se induce la expresión de shRNAs en presencia de tetraciclina/doxiciclina dando lugar a una expresión génica KD, mientras que en los sistemas de Tet-OFF, se suprime la expresión de shRNAs en presencia de tetraciclina que resulta en la expresión génica. Una desventaja del sistema inducible por tetraciclina es previamente divulgados bajos niveles de expresión de shRNAs en ausencia de doxiciclina - supuesta filtración6,7. En el Tet-sistema descrito aquí, sobre la administración de la tetraciclina, la Unión de la proteína represora (TET) de tetraciclina constitutivamente expresada a la Tet respuesta secuencia de elemento (TRE) dentro de la H1 es la región del promotor de shRNAs de interés suprimió. Esto resulta en la expresión de shRNA y la inhibición de la traducción de la proteína de interés en una manera dependiente de la tetraciclina8,9.
Otros sistemas de Tet-ON disponibles incluyen simultánea knock-in del TetO secuencia entre la caja TATA y el elemento de secuencia proximal (PSE) y entre transcripción y caja TATA Inicio Sitio desarrollado por Chan et al. 10 este sistema requiere menos dosis tóxicas de tetraciclina para regular la expresión del shRNA, sin embargo, bajo un estado de no inducido, niveles bajos de shRNA se expresan. La caja asociada a Krüppel (Cascarudo) basado en Tet-ON system11 incluye KRAB, una proteína dedo de zinc, que temas genes situados dentro de un rango de 3 kb del sitio de unión de KRAB supresión transcripcional. La tTRKRAB de la proteína quimérica puede enlazar a TetO, y debido a la amplia gama de capacidad controlable de ADN, TetO no necesita ser limitada entre la transcripción comienzan sitio y el promotor y tiene bajo impacto sobre la actividad del promotor. Bajo estado no inducida, informó de este sistema controlable de interferencia de RNA para mostrar un menor nivel de expresión se filtró de shRNAs11,12; sin embargo, requiere un enfoque alternativamente, dos vectores de clonación. En comparación con sistemas de KD condicionales previamente desarrollados como el sistema inducible por la ecdisona de sobreexpresión o sistema de inducción de citocromo P-450, sistema reglamentado de tetraciclina tiene la ventaja de su robustez y su reversibilidad y por lo tanto es la más habitualmente utilizada sistema13. El sistema utilizado en el presente Protocolo tiene la ventaja sobre el TetO doble knock-en sistema y KRAB Tet-ON requiere vector recto hacia adelante, solo la clonación, que permite la generación rápida de múltiples clones, y presenta niveles muy bajos de filtración en la ausencia de doxiciclina.
TME es fundamental para el desarrollo del cáncer. Para facilitar el crecimiento del tumor, las células de cáncer reclutan monocitos inflamatorios secretando proteínas quimiotácticas. Monocitos reclutados infiltran el tumor y se diferencian en pro-tumorigenic TAMs que contribuyen al crecimiento del tumor y la metástasis. Estudios in vitro del reclutamiento de células inmunes utilizan ensayos de migración, con Boyden, ensayo de cámara siendo ampliamente usado14,15,16,17. En este ensayo, la fuente de proteína chemoattractant, por ejemplo, las células cancerosas, o una proteína purificada, se coloca en la cámara inferior. Las células inmunes se colocan en el compartimiento superior separado por membrana porosa del compartimiento inferior. Las células migran hacia el gradiente de aumento de chemoattractant y los que se encuentran en la parte inferior de la membrana son manchadas y contaron con el microscopio. Aquí probamos la chemoattractant función de inhibidor de activador del plasminógeno 1 (PAI-1) en monocitos mediante la generación de líneas celulares de cáncer estable, inducible en expresión de PAI-1 es regulada por la adición de doxiciclina. Utilizamos monocitos humanos primarios en el ensayo de migración cámara de Boyden para evaluar el papel de PAI-1 en la migración de monocitos. Diferencias entre monocitos humanos primarios y líneas de células monocytic ampliamente utilizado como THP1 han divulgado y son de patrones de expresión de citoquinas diferentes18; por ejemplo, 5-10 veces aumento en los niveles de expresión de TNF-α por las células THP1 comparado con monocitos humanos19. Las células THP1 se derivan de las células monocytic de la leucemia humana, son fáciles de mantener y proliferan con una media de tiempo de 19-50 h20de duplicación. Por el contrario, los monocitos humanos se caracterizan por una vida corta en ausencia de factores de crecimiento. Desde monocitos son purificados de sangre de los donantes, una gran cantidad de variabilidad que se produce entre los individuos y según el método de purificación, puede producirse la contaminación con otros tipos de células. Sin embargo, los monocitos primarios son relevantes y se ha recomendado utilizar o confirmar los resultados obtenidos con las líneas de células monocytic en monocitos primarias de investigación biológica19. Aquí se describe un protocolo para la purificación de monocitos humanos primarios de la sangre periférica. Otros métodos de purificación de monocitos son protocolos de densidad gradiente y adherencia y procedimiento de dos pasos con solo gradientes de Ficoll-Hypaque, seguido de un gradiente de Percoll21. La pureza de la población de monocitos obtenida por esas gamas de métodos entre 70-90%. El método descrito aquí utiliza un gradiente de densidad, seguido de una selección negativa inmune22 y permite la purificación de monocitos humanos sin contacto directo con los anticuerpos, así evitando su activación accidental y resultando en un > 95% de la población pura de monocitos.
El protocolo presentado aquí se utiliza para establecer un sistema funcional de Tet-ON para expresión génica KD en líneas celulares de cáncer humano para estudiar el efecto de chemoattractant del cáncer secretan la proteína derivada del PAI-1 en monocitos. PAI-1 se sobre expresa por una variedad de tumores y paradójicamente, su expresión se correlaciona con resultado clínico pobre23,24. El papel pro-tumorigenic de PAI-1 es el resultado de su pro-angiogénicos y anti-apoptotic funciones25,26. PAI-1 se ha demostrado para contribuir a los inflamación promoviendo el reclutamiento de macrófagos al sitio de inflamación27. PAI-1 fue demostrado para promover el músculo liso cellmigration28,29 y a participar en el Mac-1 dependiente macrófago migración30. Sobre-expresión de PAI-1 también ha demostrado mejorar significativamente el reclutamiento de macrófagos Raw 264.7 en de los tumores de melanoma B16F1031. Sin embargo, el papel de PAI-1 en la migración de TAM no ha sido investigado en detalle. Utilizamos el protocolo descrito para responder a la pregunta de si el PAI-1 atrae monocitos a las células cancerosas. Esta metodología permite la disección de la diafonía entre tumor y TME por silenciar la proteína secretada en las células del cáncer y analizar los componentes de lo TME.
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Protocol
La sección de protocolo que utiliza monocitos humanos obtenidas de voluntarios sanos sigue las pautas del Comité de ética de Investigación Hospital Los Ángeles humanos de los niños y ha sido aprobada por la Junta de revisión institucional en el Material humano Número de protocolo: CCI 08-00208.
1. preparación de líneas celulares de cáncer con tetraciclina regulado shRNA expresión
- Clonación del shRNA PAI-1 en Tet-pLKO-puro vector 8 , 9
- Diseño de oligómeros de shRNAs que contienen edadI y EcoRI escote sitio en el extremo 5', la secuencia de sentido, un lazo de 6 nucleótidos y la secuencia antisentida.
Nota: Oligonucleótidos típicos están diseñados como sigue: oligo Forward: 5' CCGG - 19-21 bp sentido - CTCGAG - 19-21 bp antisentido - TTTTT, oligo Reverse: sentido de 5' AATTAAAAA-19-21 bp - CTCGAG - 19-21 antisentido de bp 3'. Protocolo detallado para el diseño de oligómero puede encontrarse en el 8. En este estudio se analizaron 3 secuencias de shRNA contra PAI-1 para el efecto de silenciamiento más fuerte: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333y revueltos33 están incluidos en la tabla 1. - Templar los oligómeros de shRNA y revueltos shRNA oligómeros.
- Reconstituir de oligonucleótidos a 100 μm en agua y mezcla de oligonucleótidos hacia adelante de 1 μl, oligonucleótidos inversa de 1 μl y 8 μl de H2O.
- Para templar los oligonucleótidos, mezclar lo siguiente: mezcla de oligonucleótidos de 1 μl, 5 μl de tampón 10 mM Tris (hidroximetil) aminometano (Tris), pH 7.5, 50 mM cloruro de sodio (NaCl), 10 mM cloruro de magnesio (MgCl2), 1 mM dithioerythritol (DTE) y 44 μl de H 2 O.
- Incubar la mezcla en un termociclador de la reacción en cadena (PCR) de polimerasa a 95 ° C durante 5 minutos, apague el instrumento y espere hasta que se alcance la temperatura ambiente (RT).
- Oligonucleótidos recocidos precipitados al añadir 5 μl 3 M acetato de sodio pH 5.2 a 50 μl habían recocido oligonucleótidos.
- Añadir 100 μl frío 100% etanol (EtOH) e incubar durante 30 min a 80 ° C. Centrifugar en una centrífuga de sobremesa a la máxima velocidad durante 30 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante, agregar 500 μl de frío 70% EtOH, centrifugar por 30 min, eliminar el sobrenadante y disolver el pellet en 20 μl de H2O.
- Evaluar la concentración de oligonucleótidos recocidos por espectrofotometría midiendo la absorbancia a 260 nm. Oligonucleótidos diluidas a la concentración final de 1 ng/μl.
- Preparar el medio Luria Bertani (LB) y las placas de agar LB.
- De medio LB, disolver 10 g triptona, extracto de levadura 5 g, 10 g de NaCl en 1 L de agua. Ajustar el pH del medio a pH 7.0 con 1 N NaOH y autoclave.
- Para las placas de agar LB, añadir 15 g/L de agar en medio LB. Autoclave y enfriar hasta aproximadamente 50 ° C. Añadir antibiótico y verter a las placas.
- Raya las bacterias transduced con Tet-pLKO-puro vector (véase la Tabla de materiales) en LB placa de agar suplementado con ampicilina μg/mL 100 e incubar durante la noche (O/N) a 37 ° C.
- Inocular 100 mL LB suplementado con ampicilina 100 de μg/mL (LB/ampicilina) con 1 Colonia de la placa y crecer O/N con agitación a 37 ° C.
- IsolateTet-pLKO-puro de la cultura bacteriana de 100 mL utilizando un kit de aislamiento de plásmidos.
- Preparar la reacción de restricción para el Tet-pLKO-puro vector con enzimas de restricción EcoRI y africanas como sigue: 1 μl de EcoRI, 1 μl de africanas, 5 μl de tampón de 10 x, 1 μl ADN de plásmido (1 μg), 42 μl de H2O. Incubar 1 h a 37 ° C. Para obtener suficiente de vector exfoliado, preparar reacciones de hasta 5 x 50 μl.
- Utilice gel de agarosa al 1% para purificar exfoliado vector del gel de agarosa usando un kit de purificación de ADN. Para aumentar el rendimiento de la DNA, minimizar la agarosa al cociente de la DNA en el gel usando un peine de gel de agarosa para grandes pozos y quitando con cuidado la mayor parte de la agarosa de la banda con un bisturí.
- Preparar la mezcla de reacción de la ligadura siguiente: oligonucleótidos ng recocido 1, vector exfoliados de 50 ng, 2 μl de tampón de ligasa 10 x, 1 ligasa μl y el agua hasta 20 μl. ligan el vector con oligonucleótidos shRNA recocido a 16 ° C O/N.
- Preparar además, una reacción de control negativo sin oligonucleótidos para vector uncleaved parcialmente hendido y auto ligado que dan lugar a colonias positivas falsos.
- Mediante técnicas de transformación estándar, transformar mezclas de ligadura en células bacterianas competentes químicamente diseñadas para evitar la recombinación homóloga de vectores lentivirales que contienen repeticiones directas.
- Crecer las bacterias en las placas con ampicilina O/N a 37 ° C.
Nota: Si se produce el crecimiento de las colonias satélite, repetir la transformación y crecer las bacterias a 30 ° C para retardar el crecimiento y prevenir así las colonias satélite. - Para verificar la ligadura acertada, escoge entre las colonias solo 10-20, inoculando 2 mL LB/ampicilina culturas y una placa de ampicilina como placa de la bolsa (para ser utilizado como un clon positivo más adelante). Crecen cultivos líquidos con agitación O/N a 37 ° C. Incube la placa O/N a 37 ° C.
- Sellar la placa con parafilm y tienda a 6 ° C.
- Aislar ADN plasmídico de culturas líquidas usando un kit de aislamiento de plásmidos.
- Realizar el análisis de restricción del DNA plasmídico aislado de colonias resistentes a ampicilina con enzima XhoI. Para cada clon, prepare la siguiente mezcla de reacción: 0,5 μl XhoI, 2.5 μl de tampón 10 x, 1 μl ADN de plásmido (0,5 μg) y 21 μl de H2O. Incubar 1 h a 37 ° C. Analizar el resultado de la reacción de restricción mediante la ejecución de la reacción en un gel de agarosa al 1%.
Nota: El análisis de restricción del vector WT por XhoI generará 3 fragmentos: 8.447, 1.800 y 200 bp. La secuencia de embutidora en Tet-pLKO-puro vector de 1.800 bp no está presente en clones positivos que contiene el shRNA-PAI-1 y la digest XhoI dará lugar a fragmentos de ADN del tamaño: 8.447, 190 y 130 bp. Como se muestra en la figura 1, el fragmento de bp 2.000 no se encuentra en la DNA aislada del número de colonias resistentes a ampicilina: 3, 8 y 11. Dependiendo del diseño de los oligonucleótidos, pueden variar la longitud y el número de fragmentos obtenidos en el ADN de las colonias positivas. - Para comprobar la correcta inserción de las secuencias de shRNAs en el vector de Tet-pLKO-puro secuencia8,9.
- Inocular 100 mL de cultivo LB/ampicilina con la colonia que contiene la copia correcta y O/N de crecer a 37 ° C.
- Aislar DNA plasmídico utilizando un kit de aislamiento de plásmidos.
- Diseño de oligómeros de shRNAs que contienen edadI y EcoRI escote sitio en el extremo 5', la secuencia de sentido, un lazo de 6 nucleótidos y la secuencia antisentida.
- Generación de partículas de lentivirus.
- Un plato de cultivo de tejidos de 15 cm de la capa con poli-l-lisina al cubrir la superficie del plato con agua estéril solución de 0.01% Poly-L-lisina e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos retirar la solución por la aspiración y secar los platos.
- Células de semilla 5 x 106 293 de riñón embrionario humano (HEK293) en el plato de la polivinílico-L-lisina-revestidas de 15 cm, y cultura en medio de modificado Eagle de Dulbecco Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS y 1% mezcla de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) a 37 ° C, 5% CO 2 hasta llegar a confluencia de 70%.
- Para producir partículas virales, transfectar las células HEK293 con 25 μg pLKO-Tet-a-shRNA, 25 μg psPAX, (plásmido de empaquetado) y 5 μg pMD2.G plásmidos (plásmidos expresando su envolvente) utilizando el reactivo de transfección.
Nota: los plásmidos psPAX y pMD2.G son un regalo del laboratorio de Didier Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Suiza). - Inducir las células HEK293 al día siguiente cambiando el medio DMEM suplementado con 10 mM sodio butirato y 20 mM HEPES pH 7.2 y cultivo de 8 h.
- Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y añadir 25 mL de fresco DMEM medio conteniendo 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES) pH 7.2. Después de incubación a 37 ° C por 48 h, recoger cuidadosamente medio que contiene el virus mediante pipeteo; Evite derrames.
- Filtrar el medio recogido a través de un filtro de jeringa de 0.45 μm para eliminar las células HEK293. El medio que contiene partículas virales puede ser utilizado inmediatamente o almacenado a-80 ° C para su uso posterior.
- Generación de líneas de células transfected estable
- HCT116 células de cáncer de colon y las células de cáncer de mama MDA-MB-231 a 50.000 células/pozo en medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de la semilla pluma/Strep en una placa de 12 pozos. Incubar a 37 ° C en 5% de CO2 hasta que las células son confluentes de 60-70%.
- Lavar las células con PBS y añadir 1 mL de virus que contiene medio cáncer de las células y O/N de incubar a 37 ° C en 5% CO2. Como control, añadir 1 mL de medio fresco de DMEM suplementado con 10% FBS y 1% pluma/Strep a 2 pocillos con células de cáncer.
- Para sacar el medio que contiene el virus de la aspiración. Lavan las células con PBS y cambiar el medio DMEM con 10% (v/v) libre de tetraciclina FBS (Tet-libre) y 1% pluma/Strep.
- Después de 72 h, lavar las células con PBS y cambiar el medio DMEM 10% FBS TTE libre 1% pluma/Strep, puromicina de 1 μg/mL para la selección de células transfectadas por el virus.
- Dependiendo de la línea celular utilizada, ajuste la concentración de puromicina para la óptima selección prueba la gama de concentraciones de puromicina (0.1, 0.5, 1, 2 y 5 μg/mL) en las células no-transduced y eligiendo la menor concentración donde sobreviven ningunas células control después de 3 días de la cultura.
- Seleccionar las células virus-transduced por cultivo de células en presencia de puromicina 3-14 días. Como controles, preparar dos pozos adicionales con las células no-transduced, uno con medio que contiene puromicina y uno sin puromicina. Observar muerte parcial de las células de puromicina en el pozo con las células virus-transduced en comparación con el control de pozos.
Nota: Las células no-transduced no crecerá en presencia de puromicina. - Verificar la eficacia de la DC condicional en el cáncer de colon resistente a la puromicina HCT116 y las células de cáncer de mama MDA-MB-231.
Nota: La concentración efectiva de doxiciclina varía según la línea celular utilizada y debe titularse (típicamente de 100 ng/mL a 2 μg/mL).- Determinar la concentración de doxiciclina que no se tóxicos para las células pero eficaz disminuyendo la expresión de la proteína de interés. En este protocolo, 1 μg/mL fue utilizado con éxito en vitro.
- La cultura de las células durante 72 h en presencia y ausencia de doxiciclina de 0.1, 1 y 2 μg/mL. Verificar el nivel de expresión de la proteína regulada (aquí, PAI-1) en la célula lisada por Western blot análisis. Comparar las células HCT116 y MDA-MB-231 condicional expresa shRNA control revuelto células.
- Preparación de medio condicionado
- Semilla 1 x 106 células transfectadas estable con doxiciclina regulado pLKO-shRNA lentivirus que contiene platos de 10 cm.
- Crecimiento de líneas celulares en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% FBS Tet-libre y 1% pluma/Strep en ausencia y presencia de 1 doxiciclina μg/mL durante 72 h a 37 ° C en 5% CO2, añadir doxiciclina fresca todos los días.
Nota: Medio RPMI es compatible con las condiciones de cultivo de monocitos. La doxiciclina es un compuesto sensible luz. Proteger las culturas de célula de la luz por la cubierta con papel de aluminio y evitar trabajar bajo exposición directa a la luz. - Recoger el medio mediante pipeteo, filtrar con filtro de 0.45 μm y congelar a-80 ° C en alícuotas.
2. aislamiento de monocitos de sangre humana
- Aislamiento de monocitos de sangre periférica humana.
Nota: Monocitos humanos primarios son aislados de 7 mL de glóbulos blancos, concentrados en un filtro de leucocitos Obtenido de donantes de plaquetas sanas. Según el donante, un filtro de leucocitos produce entre 1 x 109 y 2 x 109 de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), aproximadamente el 10% de los cuales constituyen monocitos.- Preparar la estación de trabajo en el gabinete de flujo laminar.
- Esterilizar las tijeras y el flujo laminar con luz ultravioleta (UV) durante 30 minutos.
- Rocíe el filtro de leucocitos con 70% EtOH y secado al aire dentro del gabinete de flujo laminar.
- Cortar ambos extremos del filtro de leucocitos con tijeras y vaciar el contenido del filtro en un tubo de 50 mL.
- Diluir hasta 90 mL agregando PBS con 1% (v/v) FBS (PBS/FBS).
- Preparar tubos de 3 x 50 mL con 15 mL de solución de densidad gradiente. La capa lentamente 30 mL de sangre de PBS/FBS diluido sobre la densidad solución gradiente usando un aspirador situado en flujo gravitatorio para evitar la mezcla de las capas.
- Centrífuga de un rotor de columpio a 400 x g a temperatura ambiente sin los frenos durante 25 minutos.
- Desechar la capa superior y transferencia de la capa media contiene PBMCs a un nuevo tubo 50 mL.
- Añadir QUE PBS/FBS hasta 50 mL y centrifugar a x 120 g a temperatura ambiente durante 10 minutos retirar el sobrenadante que contiene las plaquetas. Repita este paso dos veces más.
- Resuspender el precipitado en 50 mL de PBS/FBS y contar las PBMCs usando un hemocitómetro. Centrifugue a 120 g de x en RT y resuspender el precipitado en PBS/FBS que contiene 1 mM dihidratada del ácido (EDTA) (FBS/PBS/EDTA) a una concentración final de 5 x 107 células/mL.
- Utilice un kit de selección negativa para enriquecer monocitos por agotamiento de las células no-monocytic.
Nota: El kit de la selección negativa utiliza un cóctel de anticuerpos (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 y glycophorin A) contra T células NK células, neutrófilos, B células, los granulocitos y eritrocitos. Los complejos de anticuerpos se unen a la superficie de estas células no-monocytic y a las partículas magnéticas de dextrano. Cuando el tubo se coloca en un imán, los granos se adhieren a las paredes del tubo y eliminar las células no-monocytic de la solución.- Añada 50 μl del anticuerpo cóctel a 1 mL de 5 x 107 PBMCs/mL, mezclar con una pipeta, incubar 10 min a granos magnéticos de RT. Añadir 50 μl a las PBMCs con el cóctel de anticuerpos, mezclar con una pipeta e incube durante otro 10 min a TA.
- Se suman FBS/PBS/EDTA a 25 mL y coloque la mezcla PBMC en un imán que puede alojar un tubo de 50 mL. Incubar 10 min a RT. magnética granos se adhieren a las paredes del tubo y secuestrar las células no-monocytic de la solución.
- Con una pipeta de 25 mL, retire la solución que contiene monocitos del tubo en el imán. Tenga cuidado de no tocar los lados del tubo con la pipeta.
- Centrifugue la solución a 250 x g a temperatura ambiente, retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene monocitos en Medio RPMI con 10% FBS Tet-libre y 1% pluma/Strep.
3. ensayo de migración en camara Boyden
- Preparar la solución de albúmina de suero bovino (BSA) 1% (p/v) disolviendo 1 g de BSA en 100 mL de agua ultrapura y filtrar con un tamaño de poro de 0.2 μm para esterilizar.
- Incubar los membrana porosa insertos en 1% BSA una solución estéril O/N para mejorar la adherencia de los macrófagos a la membrana. Monocitos/macrófagos, utilizar 5-8 μm poro tamaño inserciones.
- Llenar un plato de cultivo de tejido estéril con solución al 1% BSA y colocar los insertos en el plato. Aplique 200 μL 1% BSA solución dentro de los rellenos.
- Lave los insertos dos veces colocándolos en un plato llenado de PBS estéril y aplicar PBS dentro del filtro.
- 40.000 células HCT116 o MDA-MB-231 en Medio RPMI de 0,5 mL que contiene 10% FBS Tet-libre y 1% de la semilla pluma/Strep por pozo, en un plato 24-well, por triplicado. Como alternativa, coloque 0.5 mL de medio condicionado previamente generado en el pozo como fuente de chemoattractant.
- Al día siguiente, monocitos placa 8.000 en el preparado insertar volumen 0.3 mL de Medio RPMI con 10% FBS Tet-libre y 1% pluma/Strep, en triplicado e incubar a 37 ° C en 5% CO2.
- Recoger los insertos después de 48 h.
Nota: La longitud de un experimento debe ser optimizada dependiendo de las condiciones específicas y células utilizadas, realizando un experimento de evolución temporal donde se recogen los partes movibles en tiempos de incubación diferentes.- Sacudir el exceso medio y pase precisamente la superficie interna con un aplicador con punta de algodón para eliminar las células que no migran.
- Mancha de la cara externa de los rellenos utilizando el método de Wright-Giemsa.
- Cuidadosamente Instale 3 insertos de vidrio deslizante en un aceite de inmersión de microscopio de alta viscosidad, asegurándose que el lado del filtro con los macrófagos migrados se enfrenta.
- Imágenes de las diapositivas utilizando un microscopio óptico con objetivo 20 X. Tome fotos de 9 campos de filtro. La cuenta migrados macrófagos en 9 campos de filtro.
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Representative Results
Tres secuencias de shRNAs fueron probadas para el KD más eficiente de PAI-1. Para ello, secuencias shRNA contra PAI-1 y revueltos (tabla 1) se clonaron en vectores de expresión Tet-pLKO-puro siguiendo el protocolo descrito anteriormente. La línea de células de fibrosarcoma HT 1080 fue estable transfected con constructos generados y las células fueron tratadas con doxiciclina durante 3 días. La expresión de PAI-1 se verificó por Western Blot ()figura 2A) y la intensidad de las bandas correspondientes a la tubulina y PAI-1 se analizó por densitometría. Utilizando la secuencia más efectiva de KD (shRNA 2), que además genera las células epiteliales de mama MDA-MB-231 adenocarcinoma (figura 2B) y las células del carcinoma colorrectal HCT116 (figura 2) estable transfected con tetraciclina-regulado pLKO-shRNA2-PAI-1 expresión vector (y shRNA revueltos como control). Hemos logrado una disminución del 74% de la expresión de PAI-1 en la línea de celular MDA-MB-231 (figura 2B) y disminución de 17,5% en línea de células HCT116 en presencia de doxiciclina (1 μg/mL)()figura 2) según lo determinado por Western Blot y análisis densitométricos de las bandas. El análisis de la cámara de Boyden se utilizó para cuantificar la migración de los monocitos a las células cancerosas. La hipótesis de que el cáncer mástil-célula-derivados de PAI-1 promueve la migración de los monocitos a las células del tumor y por lo tanto menos migración será observado al PAI-1 es regulada por la adición de doxiciclina. Las células cancerosas fueron tratadas con doxiciclina durante 3 días y fueron sembradas en la parte inferior de una placa de 24 pozos en 40.000 células/pozo. Monocitos humanos primarios purificados fueron aplicados en la cámara superior del ensayo y después de 24 h, los monocitos en la parte inferior de la membrana fueron y contaron con el microscopio. Demostramos que en la ausencia de doxiciclina y por lo tanto la presencia de PAI-1, en MDA-MB-231 y HCT116 células (PAI-1 shRNA y controles codificados), aumentó significativamente la migración de los monocitos humanos (figura 3). La migración de monocitos luego fue inhibida por el 33% y el 74% doxiciclina fue agregada a las culturas Co y la producción de PAI-1 por las células tumorales se regula (Figura 3A, C). Se observó ninguna inhibición de la migración de monocitos con tumor de células transduced con los controles de shRNAs revuelto, que también se indicaron que la doxiciclina no tiene ningún efecto inhibitorio sobre la migración de monocitos. Resultados similares se obtuvieron cuando el medio condicionado de las células cancerosas tratadas con doxiciclina fue colocado en la parte inferior de los pozos como fuente de atrayentes (figura 3B, D).
Figura 1 . El análisis de la DNA extraída de 16 colonias bacterianas restricción XhoI. ADN fue extraído de 16 colonias bacterianas y sometido a la reacción de restricción con enzima XhoI. Los fragmentos de ADN resultantes se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. Clones positivos (carriles 3, 8 y 11) que falta el fragmento de 2 kb después digestión de restricción XhoI están marcados con flechas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Expresión condicional KD de PAI-1 en líneas celulares de cáncer. Western Blot estable análisis de la expresión de PAI-1 en líneas celulares transfectadas con tetraciclina regulado pLKO-shRNA-PAI-1 (shRNA 1-3) y revueltos vector de expresión después de 3 días de tratamiento doxiciclina. HT1080 (A). (B) MDA-MB-231. HCT116 (C). Análisis de densitometría de las bandas se indicaron a continuación de los carriles del Western blots como un cociente de la intensidad de PAI-1 en la intensidad de la banda de tubulina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . PAI-1 promueve la migración de macrófagos. Migración de monocitos humanos hacia células HCT116 (C) y (A) MDA-MB-231 líneas estable transfected con el vector de expresión condicional shRNA 2 contra PAI-1 y shRNA revuelto, medido usando el análisis de la cámara de Boyden. Las células cancerosas fueron tratadas con doxiciclina durante 3 días y sembradas en una placa de 24 pozos por triplicado. Monocitos humanos primarios fueron aplicados en la parte superior de la estufa. Después de 24 h, monocitos en la parte inferior del filtro se mancharon y contaron con el microscopio. Migración de monocitos humanos hacia el medio condicionado genera más de 72 h (B) MDA-MB-231 y (D) las líneas de células HCT116 condicional expresan PAI-1 en presencia y ausencia de doxiciclina. Los datos representan la media de los triplicados técnicas [+-desviación estándar (SD)]. Para cada repetición, monocitos migrados se contaron en 9 campos en 20 X aumento del objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de la Oligo | Secuencia de | ||||
| shRNA 1 (anti secuencia de PAI-1 1 - 8 ) | Avance: | shPAI-1A5' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT 3' | |||
| Reverso: | shPAI-1B 5' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG 3' | ||||
| shRNAs 2: (anti PAI-1 secuencia 2) | Avance: | shPAI - 1C 5'-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3' | |||
| Reverso: | shPAI - 1D 5'-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3' | ||||
| shRNAs 3 (anti secuencia de PAI-1 - 3 9) | Avance: | shPAI-1E 5'-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3' | |||
| Reverso: | shPAI-1F 5'-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3' | ||||
| Scramble (codificar la secuencia de 4 - 9) | Avance: | Revolver 1 5'-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3' | |||
| Reverso: | Scramble 2 5'-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3' | ||||
Tabla 1. secuencias de shRNAs. Aquí se probaron 3 secuencias de shRNA contra PAI-1 para el efecto de silenciamiento más fuerte: shRNA 1, shRNA 2, shRNA 3 y revuelto
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Discussion
Compuesto por una variedad de tipos celulares, la TME es crucial para el desarrollo del cáncer. Para determinar las condiciones de crecimiento óptimo, las células cancerosas atraen monocitos a través de la secreción de factores quimiotácticos. Aquí presentamos un protocolo para estudiar el mecanismo de reclutamiento de monocitos por células tumorales en vitro. Para ello, se utiliza una combinación de sistema de expresión inducible gene, purificación de monocitos humanos primarios y como un ejemplo de un análisis de la migración, el análisis de la cámara de Boyden.
El primer paso crítico en el protocolo presentado es confirmar la correcta la clonación de las secuencias de shRNAs en el vector de Tet-ON, que siempre deben ser evaluados por la secuencia. Más establecimiento de las líneas de celulares Tet-ON estables funcionales debe ser confirmada por la prueba de KD en presencia de doxiciclina por borrar occidental. La cantidad de doxiciclina aplicada puede variar entre las líneas celulares, y por lo tanto, es recomendable probar las concentraciones efectivas de KD y de toxicidad en las células. Una desventaja conocida de sistemas inducible por tetraciclina es su filtración6,7. La cantidad de proteína detectada en presencia y ausencia de doxiciclina debe medida y comparada con los controles codificados para tener en cuenta este efecto. En los experimentos en vitro , se observa un bajo nivel de filtración con el KD shRNA2 y shRNA3, como se muestra en la figura 2. Además, es importante siempre usar suero libre de tetraciclina en vitro para evitar la regulación a la baja de los niveles de proteína en condiciones de control. El sistema utilizado en el presente Protocolo tiene ventajas sobre otros sistemas de Tet-ON ya que requiere un solo vector de clonación, permite la generación rápida de múltiples clones y presenta niveles muy bajos de filtración.
Un paso crítico en la obtención primarias monocitos humanos de sangre está obteniendo buena separación gradiente, que se basa en capas lenta de la sangre diluida sobre el gradiente de densidad. Otro paso fundamental del protocolo es estimar correctamente el número de células antes de la etapa de selección negativo porque va a determinar la cantidad de anticuerpo cóctel y magnético cuentas añadido a la suspensión de la sangre. Para asegurar la reproducibilidad de los experimentos, más de un donante de sangre debe utilizarse en la realización de experimentos repetidos. Esta técnica es superior a las alternativas existentes de purificación monocito incluyendo un gradiente de densidad y protocolo basado en la adhesión de34 y un procedimiento de dos pasos con gradientes solo21, porque garantiza la contaminación baja del linfocito nivel y de alta pureza (> 95%) de los monocitos obtenidos. Puesto que los tipos no-monocytic células se extraen de la mezcla PBMC por selección negativa, no vienen en contacto directo con los anticuerpos presentes en el cóctel de anticuerpos y por lo tanto el riesgo de convertirse en activa interacción con anticuerpos de monocitos monocitos es mínima. Usos alternativos de las células obtenidas pueden incluir la diferenciación de monocitos a macrófagos a través de experimentos in vitro e in vivo en monocitos humanos se inyectan en ratones inmunodeficientes. Modificaciones del protocolo comúnmente incluyen uso del buffer de lisis de glóbulos rojos durante los pasos de lavado de PBMCs. Esta modificación tiene como objetivo adicional eliminación de glóbulos rojos mediante la aplicación de presión osmótica. Limitaciones de la técnica incluyen un número limitado de los macrófagos que pueden obtenerse con una cantidad específica de los reactivos.
El ensayo de migración cámara de Boyden es una manera rápida y sencilla para analizar si una proteína secretada o una línea celular estimula la migración de otros tipos de células. Las trampas de este ensayo son sensibilidad baja y no representa las células que experimentan la muerte celular. Las maneras de abordar esas preocupaciones confirmando los resultados con un análisis diferente, como un microfluídicos a base de ensayo y un experimento del curso del tiempo donde la migración se mide en períodos más cortos de tiempo. Excepción de pequeñas poblaciones, monocitos maduros no proliferan en vivo35,36; sin embargo si se utilizan otras células, una línea de tiempo más corto que el ciclo de división debe elegirse para evitar un aumento en el número de células. Como alternativa, puede usarse reactivos bloqueando la división celular para evitar cambiar el numero de celular originalmente plateado.
El protocolo presentado aquí puede ser fácilmente adaptado a los estudios de otras proteínas secretadas por las células cancerosas y sus funciones paracrinas. Una de las posibles aplicaciones de líneas de células de cáncer de KD condicionales está estudiando el papel de las proteínas cuya KD es tóxico para las células en vitro , pero también en vivo, donde líneas celulares regulados por Tet son xenotransplantadas en ratones, y se induce el KD después del establecimiento del tumor mediante la adición de doxiciclina al agua potable.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer Jacqueline Rosenberg para corregir el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los nosotros Departamento de salud y servicios humanos/nacional institutos de salud con una subvención YA DeClerck (concesión 5R01 CA 129377) y la TJ Martell Foundation. MH Kubala es el receptor de un premio de beca de desarrollo de carrera de investigación del Instituto de investigación de Saban en el Hospital Los Angeles de los niños.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
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