Summary
Ce protocole sert un régime pour la mise en place d’un système fonctionnel de Tet-ON dans les lignées cellulaires cancéreuses et leur utilisation ultérieure, en particulier pour étudier le rôle des protéines de culture cellulaire tumorale dans le recrutement des monocytes/macrophages pour le microenvironnement tumoral.
Abstract
siARN et médiation shARN démantelez méthodes (KD) de régulation de l’expression des gènes sont des outils précieux pour comprendre la fonction de gènes et des protéines. Toutefois, dans le cas que le KD de la protéine d’intérêt a un effet létal sur les cellules ou les effets anticipés de la KD sont dépendante du temps, inconditionnels des méthodes KD ne conviennent pas. Conditionnelles systèmes conviennent mieux dans ces cas et ont fait l’objet de beaucoup d’intérêt. Il s’agit de systèmes de surexpression inductible par l’Ecdysone, Cytochrome P-450 induction système1, et la tétracycline régulé systèmes d’expression de gène.
Le système d’expression de gène tétracycline réglementé permet contrôle réversible surexpression de la protéine par induction de l’expression de shARN en présence de tétracycline. Dans ce protocole, nous présentons un modèle expérimental à l’aide de système fonctionnel de Tet-ON dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines conditionnelle règlement d’expression de gène. Ensuite, nous montrent l’utilisation de ce système dans l’étude de l’interaction cellule-monocyte tumeur.
Introduction
Macrophages (EAPV) de la tumeur associée contribuent au développement de la tumeur en favorisant la croissance des tumeurs, métastases et régulation de la réponse immunitaire2. Monocytes inflammatoire recrue, qui infiltrent la tumeur et se différencient en pro-tumorigènes TAMs3en cellules cancéreuses. Infiltration de la tumeur avec TAMs est en corrélation avec des résultats cliniques pauvres et a été liée au rôle immunosuppresseur sur les macrophages4,5. Cependant, les mécanismes du recrutement de macrophages à la tumeur ne sont pas bien explorés et une meilleure compréhension des voies impliquées est cruciale pour davantage d’avancement du champ et de thérapies prometteuses. Un des défis dans l’étude des interactions entre cellules tumorales et des cellules normales dans le microenvironnement tumoral (TME) est la complexité des mécanismes et des cellules impliquées, nécessitant des approches in vitro permettant la dissection de la diaphonie. Nous présentons ici une méthodologie polyvalente qui peut être appliquée à l’étude de l’effet paracrine d’un cancer en culture cellulaire, la protéine sécrétée sur la migration des autres types de cellules comme les macrophages, in vitro. En utilisant un système où l’expression de la shARN contre une protéine de culture cellulaire du cancer impliquée dans le recrutement des monocytes est sous le contrôle du promoteur inductible tétracycline, l’effet paracrine de la protéine sécrétée sur des monocytes est quantifié. Dans ce protocole, clonage des séquences de shARN dans la tétracycline réglementée vecteur est présenté suivie de génération de lignées cellulaires cancéreuses stable. En outre, la purification des monocytes humains primaires et un dosage de chambre de Boyden servent à analyser l’effet paracrine d’une protéine dérivée de cellules cancéreuses sur la migration des monocytes.
Diminution de l’expression des gènes de codage de protéine est couramment appliquée par des techniques siRNA et shARN, mais non sans restrictions dans son utilisation. La précipitation à long terme (KD) des gènes peut-être déclencher des réactions adaptatives secondaires de cellules qui interfèrent avec les résultats expérimentaux. Absence de contrôle temporel sur l’expression génique rend difficile d’étudier le rôle dynamique d’une protéine avec le temps ou le rôle d’une protéine cruciale pour la survie des cellules. Cette question est particulièrement importante dans in vivo des paramètres, où le rôle d’une protéine dans le développement de tumeurs et la progression peut nécessiter une diminution de l’expression de la protéine d’intérêt seulement après que tumeur est établie. KD conditionnel présente l’avantage d’éviter un effet létal trop tôt de la KD sur les cellules et pour permettre l’analyse du rôle de la protéine dans les différentes étapes de la croissance de la tumeur, tandis que KD inconditionnelle pourrait entraîner en l’absence de développement de la tumeur.
Un certain nombre de systèmes de KD conditionnels ont été développé pour traiter les restrictions de KD stable. Les systèmes d’expression de gène conditionnelle incluent inductibles par l’Ecdysone surexpression systèmes, le Cytochrome P-450 induction système1, et tétracycline régulé systèmes d’expression de gène. Les systèmes d’expression génique réglé par la tétracycline permettent un contrôle sur l’expression de la shARN lors de l’addition de l’antibiotique tétracycline (ou son analogue plus stable - doxycycline). Dans les systèmes de Tet-ON, l’expression des shARN est induite en présence de tétracycline/doxycycline, résultant en une expression de gène KD, tandis que dans les systèmes de Tet-OFF, l’expression de shARN est supprimée en présence de tétracycline, ayant pour résultat l’expression des gènes. Un inconvénient du système inductible par la tétracycline est rapportés précédemment à faibles niveaux d’expression des shARN en l’absence de doxycycline - perméabilité dite6,7. Dans le Tet-ON système décrit ici, par voie de tétracycline, la liaison de la protéine de répresseur (Tite) tétracycline constitutivement exprimé à la séquence d’éléments (TRE) Tet-sensible dans le H1 est de la région promotrice de la shARN d’intérêt supprimée. Cela se traduit par l’expression de shARN et inhibition de la traduction de la protéine d’intérêt dans une façon dépendante de la tétracycline8,9.
Autres systèmes de Tet-ON disponibles incluent simultanée knock-in de la TetO séquence entre boîte TATA et élément de séquence proximale (PSE) et entre la transcription et de la boîte TATA start site développé par Chan et al.. 10 ce système nécessite moins de doses toxiques de tétracycline pour réguler l’expression de shARN, toutefois, soumis à l’état non induite, de faibles niveaux de shARN sont exprimés. La boîte Krüppel-associés (KRAB) fondé Tet-ON système11 comprend KRAB, une protéine de doigt de zinc, qui sujets gènes situés dans un rayon de 3 Ko de l’accepteur KRAB à répression transcriptionnelle. La protéine chimère tTRKRAB pouvez lier à TetO, et en raison de la large-gamme de capacité contrôlable de l’ADN, TetO ne doivent être limité entre la transcription démarrer le site et le promoteur et ont faible impact sur l’activité du promoteur. En vertu de l’état non induite, ce système de brouillage de RNA contrôlable a été signalé à montrer un niveau inférieur d’expression fuite de shARN11,12; Cependant, elle nécessite une approche séquentielle, deux vecteurs de clonage. Par rapport aux systèmes KD développés antérieurement conditionnelles comme l’Ecdysone inductibles par système de surexpression ou système d’induction du Cytochrome P-450, le système réglé par la tétracycline a l’avantage de sa robustesse et de la réversibilité et par conséquent est les plus couramment utilisés système13. Le système utilisé dans le présent protocole a l’avantage sur la TetO knock-in bicourant et système KRAB Tet-ON que requiere clonage avant droite, seul vecteur, ce qui permet la génération rapide de plusieurs clones, et il présente des niveaux très bas de perméabilité dans le absence de doxycycline.
TME est essentiel pour le développement du cancer. Pour faciliter la croissance de la tumeur, les cellules cancéreuses recrutent des monocytes inflammatoires en sécrétant des protéines chimiotactiques. Monocytes recrutés s’infiltrer dans la tumeur et se différencient en pro-tumorigènes TAMs qui contribuent à la croissance des tumeurs et des métastases. Des études in vitro du recrutement des cellules immunitaires utilisent les tests de migration, avec Boyden, test de chambre étant largement utilisé14,15,16,17. Dans ce test, la source de protéine facteur chimiotactique, par exemple, les cellules cancéreuses, ou une protéine purifiée, est placée dans le bas du réservoir. Les cellules immunitaires sont placés dans la chambre haute, séparée par une membrane poreuse du compartiment inférieur. Migrer vers la pente croissante du facteur chimiotactique et ceux que l'on trouve sur la face inférieure de la membrane des cellules sont colorées et comptés sous le microscope. Ici, nous testons la fonction de facteur chimiotactique des PAI 1 (PAI-1) sur les monocytes en générant des lignées cellulaires de cancer stable, inductible où expression de PAI-1 est régulée par l’addition de la doxycycline. Nous utilisons des monocytes humains primaires dans le test de migration de chambre de Boyden pour évaluer le rôle de PAI-1 dans la migration des monocytes. Différences entre des monocytes humains primaires et lignées monocytaire largement utilisé comme THP1 ont été signalés et incluent l’expression de différentes cytokines modèles18; par exemple, 5 à 10 fois plus dans les niveaux d’expression de TNF-α par les cellules THP1 par rapport aux monocytes humains19. Les cellules THP1 proviennent des cellules de la leucémie humaine monocytaire, sont faciles à entretenir et se multiplient avec une moyenne de temps de 50-19 h20. Au contraire, les monocytes humains sont caractérisés par une durée de vie courte en l’absence de facteurs de croissance. Étant donné que les monocytes sont purifiées à partir de sang de donneurs, une bonne quantité de variabilité se produit entre les individus et selon la méthode de purification, contamination avec les autres types de cellules peut se produire. Néanmoins, monocytes primaires sont pertinentes et il a été recommandé d’utiliser ou de confirmer les résultats obtenus avec les lignées monocytaire utilisant des monocytes primaires dans la recherche biologique,19. Nous décrivons ici un protocole pour la purification des humains primaires monocytes du sang périphérique. Autres méthodes de purification de monocyte incluent les protocoles adhésion et gradient de densité et de la procédure en deux étapes avec seul gradient de Ficoll-Hypaque suivie d’un gradient de Percoll21. La pureté de la population de monocyte obtenue par ces gammes de méthodes entre 70 et 90 %. La méthode décrite ici utilise un gradient de densité, suivi d’une sélection immunitaire négative22 et permet la purification des monocytes humains sans contact direct avec des anticorps, ainsi pour éviter leur activation accidentelle et résultant en un > 95 % population pure des monocytes.
Le protocole présenté ici est utilisé pour la mise en place d’un système fonctionnel de Tet-ON pour l’expression des gènes KD en lignées cellulaires cancéreuses humaines pour étudier l’effet chimiotactique de la protéine sécrétée dérivé du cancer PAI-1 sur les monocytes. PAI-1 est surexprimé par une variété de tumeurs et de son expression paradoxalement en corrélation avec des résultats cliniques pauvres23,24. Le rôle de pro-tumorigène de PAI-1 est le résultat de ses pro-angiogénique et anti-apoptotique fonctions25,26. PAI-1 s’est avéré contribuent à l’inflammation en favorisant le recrutement de macrophages sur le site de l’inflammation,27. PAI-1 a été montré pour promouvoir le muscle lisse cellmigration28,29 et de participer à la Mac-1 charge macrophage migration30. Surexpression de PAI-1 a été également démontrée à améliorer considérablement le recrutement de macrophages Raw 264.7 dans B16F10 mélanome tumeurs31. Cependant, le rôle de PAI-1 dans la migration de TAM n'a pas été étudié en détail. Le protocole décrit nous permet de répondre à la question de savoir si PAI-1 attire les monocytes, cellules cancéreuses. Cette méthodologie permettant une dissection de la diaphonie entre la tumeur et TME en faisant taire la protéine sécrétée dans les cellules cancéreuses et en analysant les composants de la TME.
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Protocol
La section protocole qui utilise des monocytes humains obtenus à partir des volontaires en bonne santé suit les directives de hôpital Los Angeles Human Research Ethics Committee l’HME et a été approuvée par l’Institutional Review Board sous le matériel humain Numéro de protocole : CCI 08-00208.
1. préparation des lignées de cellules cancéreuses avec réglé par la tétracycline shARN Expression
- Clonage de shARN PAI-1 en vecteur de Tet-pLKO-puro 8 , 9
- Concevoir des oligomères de shARN qui contiennent l' âgedu site EcoRI clivage et j’ai à l’extrémité 5', la séquence de sens, une boucle de 6 séquences de nucléotides et la séquence anti-sens.
Remarque : Les oligonucléotides typiques sont conçues comme suit : oligo avant : CCGG - bp 19-21 5' sens - CTCGAG - 19-21 bp antisens - TTTTT, oligo Reverse : 5' AATTAAAAA-19-21 bp sens - CTCGAG - 19-21 antisens de bp 3'. On trouvera un protocole détaillé pour la conception de l’oligomère dans 8. Dans cette étude, 3 séquences de shARN contre PAI-1 ont été testés pour l’effet plus silencieux : shARN 132, shRNA 2, shRNA 333et brouillés33 figurent dans le tableau 1. - Recuire les oligomères de shARN et brouillés shARN oligomères.
- Reconstituer les oligonucléotides à 100 µM dans l’eau et mélanger oligonucléotide avant de 1 µL, oligonucléotide inverse de 1 µL et 8 µL H2O.
- Pour recuire les oligonucléotides, mélanger ce qui suit : 1 mélange d’oligonucléotide µL, 5 µL tampon 10 mM Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris) pH 7.5, 50 mM, 10 mM du chlorure de Sodium (NaCl), le chlorure de magnésium (MgCl2), 1 mM dithioérythritol (DTE) et 44 µL H 2 O.
- Incuber le mélange dans un thermocycleur PCR (amplification) de polymérase à 95 ° C pendant 5 min, éteindre l’appareil et attendez que la température ambiante (RT) est atteint.
- Des oligonucléotides recuits précipitées en ajoutant 5 µL 3M acétate de Sodium pH 5,2 à 50 µL recuit oligonucléotides.
- Ajouter 100 µL froide 100 % d’éthanol (EtOH) et incuber 30 min à-80 ° C. Centrifuger dans une centrifugeuse de paillasse à vitesse maximale pendant 30 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant, ajouter 500 µL froid 70 % EtOH, centrifuger pendant 30 min, retirez le surnageant et dissoudre les granulés dans 20 µL H2O.
- Évaluer la concentration des oligonucléotides recuits par spectrophotométrie, mesurer l’absorbance à 260 nm. Oligonucléotides diluées à la concentration finale de 1 ng/µL.
- Préparer le milieu Luria Bertani (LB) et des plaques de gélose LB.
- Pour milieu LB, dissoudre 10 g tryptone, 5 g Extrait de levure, 10 g de NaCl dans 1 L d’eau. Ajuster le pH du milieu à pH 7.0 à l’aide de 1 N NaOH et autoclave.
- Pour les boîtes de gélose LB, ajouter 15 g/L d’agar dans un milieu LB. Autoclave et laissez refroidir à 50 ° c environ. Ajouter des antibiotiques et versez les plaques.
- Ensemencer les bactéries transduites avec un vecteur Tet-pLKO-puro (voir la Table des matières) sur LB gélosé complété avec de l’ampicilline 100 µg/mL et incuber pendant la nuit (O/N) à 37 ° C.
- Ensemencer le milieu LB 100 mL avec de l’ampicilline µg/mL 100 (LB/ampicilline) avec 1 colonie de la plaque et grandir O/N avec agitation à 37 ° C.
- IsolateTet-pLKO-puro de culture bactérienne 100 mL à l’aide d’un kit d’isolation de plasmide.
- Préparer la réaction de restriction pour le vecteur de Tet-pLKO-puro avec des enzymes de restriction EcoRI et AgeI comme suit : 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, 5 µL de tampon de x 10, 1 µL l’ADN plasmidique (1 µg), 42 µL H2O. Incuber 1 h à 37 ° C. Pour obtenir assez de vecteur clivé, préparer des réactions jusqu'à 5 x 50 µL.
- Gel d’agarose à 1 % permet de purifier clivée vecteur du gel d’agarose à l’aide d’un kit de purification de l’ADN. Pour augmenter le rendement de l’ADN, minimiser l’agarose à rapport d’ADN dans le gel à l’aide d’un peigne de gel d’agarose pour grands puits et en enlevant soigneusement la plupart de l’agarose de la bande à l’aide d’un scalpel.
- Préparer le mélange de réaction de ligature comme suit : 1 oligonucléotides ng recuit, 50 ng clivées vecteur, 2 µL de tampon de ligase x 10, 1 ligase µL et de l’eau jusqu'à 20 µL. ligaturer le vecteur avec des oligonucléotides de shARN recuit à 16 ° C O/N.
- Préparer par ailleurs, une réaction de contrôle négatif sans oligonucléotides pour tenir compte de vecteur clivé, partiellement clivé et individu-ligaturé qui se traduira par des colonies positifs fausses.
- Utilisant les techniques de transformation standard, transformer des mélanges de ligature des cellules bactériennes chimiquement compétents visant à empêcher la recombinaison des vecteurs LENTIVIRAUX contenant des répétitions directes.
- Cultiver des bactéries sur les plaques avec de l’ampicilline O/N à 37 ° C.
Remarque : En cas de croissance des colonies satellites, répéter la transformation et croissance des bactéries à 30 ° C pour ralentir la croissance et donc d’empêcher les colonies satellites. - Pour vérifier la ligature réussie, choisir entre 10-20 colonies individuelles, inoculer mL 2 LB/ampicilline cultures et une plaque d’ampicilline comme une plaque de stock (pour être utilisé comme un clone positif plus tard). Cultiver des cultures liquides avec agitation O/N à 37 ° C. Incuber la plaque O/N à 37 ° C.
- Sceller la plaque avec parafilm et magasin à 6 ° C.
- Isoler l’ADN plasmidique des cultures liquides à l’aide d’un kit d’isolation de plasmide.
- Effectuer l’analyse de l’ADN plasmidique isolée de colonies résistantes à l’ampicilline avec XhoI enzyme de restriction. Pour chaque clone, préparer le mélange de la réaction suivante : 0,5 µL XhoI, 2,5 µL de tampon de x 10, 1 µL l’ADN plasmidique (0,5 µg) et 21 µL H2O. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Analyser le résultat de la réaction de restriction en exécutant la réaction sur un gel d’agarose à 1 %.
Remarque : L’analyse de Restriction du vecteur WT clivé par XhoI va générer 3 fragments : 8 447, 1 800 et 200 bp. La séquence de stuffer en Tet-pLKO-puro vecteur de 1 800 bp n’est pas présent dans les clones positifs contenant shARN-PAI-1 et le digest XhoI se traduira par des fragments d’ADN de taille : 8 447, 190 et 130 bp. Tel qu’illustré à la Figure 1, les 2 000 PB ne se trouve pas dans l’ADN isolé du nombre de colonies résistantes à l’ampicilline : 3, 8 et 11. Selon la conception d’oligonucléotides, la longueur et le nombre de fragments obtenus dans l’ADN de colonies positives peuvent varier. - Vérifier l’insertion correcte des séquences shARN dans le vecteur de Tet-pLKO-puro par séquençage8,9.
- Ensemencer 100 mL culture LB/ampicilline avec la colonie contenant le clone correct et croître O/N à 37 ° C.
- Isoler l’ADN de plasmide à l’aide d’un kit d’isolation de plasmide.
- Concevoir des oligomères de shARN qui contiennent l' âgedu site EcoRI clivage et j’ai à l’extrémité 5', la séquence de sens, une boucle de 6 séquences de nucléotides et la séquence anti-sens.
- Génération de particules lentivirus.
- Enduire un plat de culture de tissu de 15 cm avec la Poly-L-Lysine en recouvrant la surface du plat avec une solution d’eau stérile de 0,01 % Poly-L-Lysine et en incubant à RT pendant 15 min. Retirer la solution par aspiration et sécher la vaisselle.
- Semences 5 x 106 293 de rein embryonnaire humain cellules (HEK293) dans le plat de la Poly-L-Lysine-enduit de 15 cm, et la culture dans un milieu d’aigle modifié de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 10 % de SVF et 1 % mélange de pénicilline/streptomycine (Pen/Strep) à 37 ° C, 5 % CO 2 avant d’avoir atteint 70 % confluence.
- Pour produire des particules virales, transfecter les cellules HEK293 avec imprimante pLKO-Tet-sur-shARN 25 µg, 25 µg psPAX, (emballage plasmide) et 5 µg pMD2.G plasmides (plasmide exprimant son enveloppe) utilisant le réactif de transfection.
Remarque : les plasmides psPAX et pMD2.G sont un cadeau du laboratoire Didier Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Suisse). - Induire les cellules HEK293 le lendemain en changeant le milieu DMEM additionné de 10 mM de sodium butyrate et 20 mM HEPES pH 7,2 et culture pendant 8 h.
- Laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 25 mL de frais DMEM moyen contenant 20 mM 4 acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES) pH 7,2. Après incubation à 37 ° C pendant 48 h, soigneusement recueillir le milieu contenant du virus en pipettant également ; éviter les déversements.
- Le support collecté de filtration à travers un filtre de seringue de 0,45 µM pour éliminer les cellules HEK293. Le support contenant des particules virales peut être utilisé immédiatement ou stocké à-80 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Génération de cellules transfectées stablement
- HCT116 cellules de cancer du côlon et les cellules MDA-MB-231 mammaires cancéreuses à 50 000 cellules/puits dans le milieu DMEM additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % de semences Pen/Strep dans une plaque de 12 puits. Incuber à 37 ° C à 5 % de CO2 jusqu'à ce que les cellules soient confluente de 60-70 %.
- Laver les cellules avec du PBS et ajouter 1 mL de contenant le virus moyen au cancer des cellules et incuber O/N à 37 ° C à 5 % de CO2. Comme contrôle, ajouter 1 mL de milieu DMEM frais additionné de 10 % de SVF et 1 % Pen/Strep à 2 puits avec les cellules cancéreuses.
- Retirer délicatement le milieu contenant du virus par aspiration. Laver les cellules avec du PBS et modifier le milieu DMEM avec 10 % (v/v) exempt de tétracycline FBS (Tet-libre) et 1 % Pen/Strep.
- Après 72 h, laver les cellules avec du PBS et remplacez le milieu DMEM 10 % exempt de Tet FBS 1 % Pen/Strep, puromycine de 1 µg/mL pour la sélection des cellules transfectées virus.
- Selon la lignée cellulaire utilisée, ajuster la concentration de puromycine pour une sélection optimale en testant la gamme des concentrations de puromycine (0,1, 0,5, 1, 2 et 5 µg/mL) dans les cellules non-transduites et choisir la plus faible concentration où ne survivre aucune cellule de contrôle après 3 jours de culture.
- Sélectionnez les cellules transduites-virus en cultivant des cellules en présence de puromycine de 3 à 14 jours. En tant que contrôles, préparer deux puits supplémentaires avec les cellules non-transduites, une avec un milieu contenant la puromycine et l’autre sans la puromycine. Observer partielle mise à mort des cellules par la puromycine dans le puits avec cellules transduites-virus par rapport aux puits de contrôle.
Remarque : Les cellules transduites Non ne croîtront pas en présence de la puromycine. - Vérifier l’efficacité de la KD conditionnelle dans le cancer du côlon de HCT116 résistant à la puromycine et les cellules MDA-MB-231 mammaires cancéreuses.
Remarque : La concentration efficace de doxycycline variera selon la lignée cellulaire utilisée et doit être titrée (typiquement de 100 ng/mL à 2 µg/mL).- Déterminer la concentration de doxycycline qui n’est pas toxique pour les cellules mais efficace dans la diminution de l’expression de la protéine d’intérêt. Dans ce protocole, 1 µg/mL a été avec succès utilisés in vitro.
- La culture des cellules pendant 72 h en présence et en absence de doxycycline µg/mL 0,1, 1 et 2. Vérifier le niveau d’expression de la protéine diminuée (en l’occurrence, PAI-1) dans le lysat cellulaire par Western blot analyse. Comparer les cellules HCT116 et MDA-MB-231 conditionnellement exprimant shARN d’hématies brouillés.
- Préparation du milieu conditionné
- Semences 1 x 106 cellules transfectées de façon stable avec la doxycycline réglé lentivirus contenant pLKO-shARN dans les plats de 10 cm.
- Cultiver des lignées de cellules dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec 10 % exempt de Tet FBS et 1 % Pen/Strep en absence et en présence de 1 doxycycline µg/mL pendant 72 h à 37 ° C à 5 % de CO2, ajout de doxycycline frais tous les jours.
Remarque : Milieu RPMI est compatible avec les conditions de culture des monocytes. La doxycycline est un léger composé sensible. Protéger les cultures cellulaires de la lumière en revêtement de papier d’aluminium et éviter de travailler sous l’exposition à la lumière directe. - Recueillir le milieu en pipettant également, filtrer sur un filtre de 0,45 µm et congeler à-80 ° C dans les parties aliquotes.
2. isolement des Monocytes du sang humain
- Isoler les monocytes du sang périphérique humain.
Remarque : Des monocytes humains primaires sont isolées de 7 mL de globules blancs concentrés dans un filtre de leucocytes provenant de donneurs de plaquettes en bonne santé. Selon le donateur, un filtre de leucocyte se produit entre 1 x 109 et 2 x 109 de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), environ 10 %, qui constituent des monocytes.- Préparer le poste de travail dans le flux laminaire.
- Stériliser les ciseaux et le flux laminaire avec la lumière ultraviolette (UV) pendant 30 min.
- Vaporiser le filtre de leucocytes avec 70 % EtOH et séchage à l’air à l’intérieur du flux laminaire.
- Couper les deux extrémités du filtre leucocytes avec des ciseaux et vider le contenu du filtre dans un tube de 50 mL.
- Diluer à 90 mL en ajoutant PBS contenant 1 % (v/v) de SVF (PBS/BF).
- Préparer les tubes de 3 x 50 mL avec 15 mL de solution gradient de densité. Couche lentement 30 mL de sang de PBS/FBS dilué sur la densité de gradient solution utilisant un pipeteur mises sur le flux gravitationnel pour éviter le mélange des couches.
- Centrifuger à un rotor de swing à 400 x g à RT sans freins pendant 25 min.
- Jeter la couche supérieure et transférer la couche intermédiaire contenant les PBMC à un tube frais 50 mL.
- Ajouter QUE PBS/FBS jusqu'à 50 mL et centrifuger à x 120 g à RT pendant 10 min. Retirez le surnageant contenant des plaquettes. Répétez cette étape deux fois plus.
- Resuspendre le culot dans 50 mL de PBS/FBS et compter les PBMC utilisant un hémocytomètre. Centrifuger à 120 g à RT et Resuspendre le culot dans PBS/FBS contenant 1 mM d’acide tétraacétique (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) à une concentration finale de 5 x 107 cellules/mL.
- Utiliser un kit de sélection négative pour enrichir les monocytes par épuisement des cellules non-monocytaire.
Remarque : Le kit de sélection négative utilise un cocktail d’anticorps (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 et glycophorine A) T cellules NK cellules, neutrophiles, B cellules, granulocytes et érythrocytes. Les complexes anticorps se lient à la surface de ces cellules non-monocytaire et les particules magnétiques de dextran. Lorsque le tube est placé dans un aimant, les perles adhérant aux parois du tube et retirer les cellules non-monocytaire de la solution.- Ajouter 50 µL de l’anticorps cocktail dans 1 mL de 5 x 107 PBMC/mL, mélanger avec une pipette et incuber pendant 10 min à billes magnétiques de RT. Ajouter 50 µL des PBMC avec l’anticorps cocktail, mélanger avec une pipette et incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Ajouter PBS/FBS/EDTA jusqu'à 25 mL et lieu le mélange PBMC dans un aimant qui peut recevoir un tube de 50 mL. Incuber pendant 10 min à RT. magnétique perles vont adhérer aux parois du tube et séquestrer les cellules non-monocytaire de la solution.
- À l’aide d’une pipette 25 mL, supprimer la solution contenant les monocytes du tube dans l’aimant. Veillez à ne pas toucher les parois du tube à l’aide de la pipette.
- Centrifuger la solution à 250 x g à RT, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot contenant les monocytes dans le milieu RPMI contenant 10 % exempt de Tet FBS et 1 % Pen/Strep.
3. Boyden chambre Migration test
- Préparer la solution d’albumine sérique bovine (BSA) 1 % (p/v) dissoudre 1 g de BSA dans 100 mL d’eau ultrapure et filtrer à travers une taille de pores de 0,2 µm pour stériliser.
- Incuber les inserts membrane poreuse en solution de BSA stérile 1 % O/N pour une meilleure adhérence des macrophages à la membrane. Pour les monocytes/macrophages, utilisez 5-8 µm pore taille insertions.
- Remplir une boîte de Petri stérile tissu avec la solution de BSA 1 % et placer les inserts dans le plat. Appliquer 200 µL de solution de BSA 1 % à l’intérieur de l’insert.
- Laver les plaquettes deux fois en les plaçant dans un plat rempli de PBS stérile et PBS s’appliquant à l’intérieur du filtre.
- 40 000 cellules HCT116 ou MDA-MB-231 dans un milieu RPMI 0,5 mL contenant 10 % exempt de Tet FBS et 1 % de semences Pen/Strep / puits, dans une plaque 24 puits, en trois exemplaires. Sinon, placer 0,5 mL de milieu conditionné généré précédemment dans le puits comme source de facteur chimiotactique.
- Le lendemain, monocytes plaque 8 000 dans les préparés insérer en volume de 0,3 mL du milieu RPMI contenant 10 % exempt de Tet FBS et 1 % Pen/Strep, en triple exemplaire et incuber à 37 ° C à 5 % de CO2.
- Recueillir les inserts après 48 h.
Remarque : La longueur d’une expérience doit être optimisée selon les conditions spécifiques et les cellules utilisées, en effectuant une expérience temporelle où les insertions sont collectées à des moments différents de l’incubation.- Secouez l’excès du milieu et de glisser avec précision la surface intérieure avec un coton-tige pour éliminer les cellules qui n’ont pas migré.
- Colorer le côté extérieur des inserts à l’aide de la méthode Wright-Giemsa.
- Soigneusement monter 3 inserts/lame dans une huile d’immersion de microscope de haute viscosité, en vous assurant que le côté du filtre avec des macrophages migrés vers le haut.
- Les diapositives à l’aide d’un microscope optique avec objectif 20 X de l’image. Prendre des photos des champs 9/filtre. Compter des macrophages migrés dans 9 domaines/filtre.
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Representative Results
Trois séquences de shARN ont été testés pour le KD plus efficace de PAI-1. Pour ce faire, séquences de shARN contre PAI-1 et brouillés (tableau 1) ont été clonées dans le vecteur d’expression de Tet-pLKO-puro suivant le protocole décrit ci-dessus. La lignée de cellules HT-1080 Fibrosarcome a été transfectée stablement avec constructions générées et les cellules ont été traitées avec la doxycycline pendant 3 jours. L’expression du PAI-1 a été vérifiée par Western Blot ()Figure 2 a) et l’intensité des bandes correspondant aux PAI-1 et de la tubuline a été analysée par densitométrie. En utilisant la séquence de KD plus efficace (shARN 2), nous avons généré plus de cellules d’Adénocarcinome mammaire épithéliale MDA-MB-231 (Figure 2 b) et les cellules de carcinome colorectal HCT116 (Figure 2) stablement transfectées avec un réglé par la tétracycline pLKO-shRNA2-PAI-1 expression vector (et shARN brouillés comme témoin). Nous avons obtenu une baisse de 74 % de PAI-1 expression dans la lignée de cellules MDA-MB-231 (Figure 2 b) et diminution de 17,5 % dans la lignée de cellules HCT116 en présence de la doxycycline (1 µg/mL)()Figure 2) tel qu’évalué par Western Blot et analyse densitométrique de les bandes. Le dosage de chambre de Boyden a été utilisé pour quantifier la migration des monocytes vers les cellules cancéreuses. Nous avons émis l’hypothèse que le cancer du PAI-1 culture cellulaire favorise la migration des monocytes vers des cellules tumorales et donc moins de migration est observés lors de PAI-1 est diminuée par l’addition de la doxycycline. Les cellules cancéreuses ont été traités avec la doxycycline pendant 3 jours et ont été ensemencées dans le fond d’une plaque 24 puits à 40 000 cellules par puits. Purifiée des monocytes humains primaires ont été appliqués dans la chambre supérieure du dosage et après 24h, les monocytes attachés à la partie inférieure de la membrane étaient tachés et comptés sous le microscope. Nous avons démontré qu’en l’absence de doxycycline et donc la présence de PAI-1, MDA-MB-231 et HCT116 cellules (PAI-1 shARN et contrôles brouillés), considérablement augmenté la migration des monocytes humains (Figure 3). La migration des monocytes est alors inhibée par 33 % et 74 % quand doxycycline a été ajouté aux cultures co et la production de PAI-1 par les cellules tumorales a été diminuées (Figure 3 a, C). Aucune inhibition de la migration des monocytes a été observée avec des cellules tumorales transduites avec les commandes de shARN brouillés, qui a également indiquent que doxycycline n’avait pas d’effet inhibiteur sur la migration des monocytes. Des résultats similaires ont été obtenus lorsque le milieu conditionné des cellules cancéreuses traitées doxycycline a été placé dans le fond des puits comme source de chimioattractants (Figure 3 b, D).
Figure 1 . XhoI analyse de restriction de l’ADN extrait de colonies bactériennes 16. L’ADN a été extrait de 16 colonies bactériennes et soumis à restriction réaction avec de l’enzyme XhoI. Les fragments d’ADN obtenus ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Clones positifs (pistes 3, 8 et 11) qui n’ont pas le fragment de 2 kb après XhoI Sommaire de restriction sont marqués par des flèches. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Expression conditionnelle KD de PAI-1 dans les lignées cellulaires cancéreuses. Western blotting analyse d’expression de PAI-1 dans les lignées cellulaires stablement transfected avec réglé par la tétracycline pLKO-shARN-PAI-1 (1-3 shARN) et brouillés vecteur d’expression après 3 jours de traitement doxycycline. (A) HT1080. (B) MDA-MB-231. (C) HCT116. La densitométrie analyse des bandes est indiqué sous les voies du Western blots quotient de l’intensité de PAI-1 sur l’intensité de bande de tubuline. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . PAI-1 favorise la migration des macrophages. La migration des monocytes humains vers MDA-MB-231 (A) et (C) HCT116 cellule lignes stablement transfected avec vecteur exprimant conditionnellement shARN 2 contre PAI-1 et shARN brouillé, mesurée par le dosage de chambre de Boyden. Les cellules cancéreuses ont été traités avec la doxycycline pendant 3 jours et ensemencées dans une plaque 24 puits en triple exemplaire. Des monocytes humains primaires ont été appliqués sur le dessus de l’insert. Après 24h, monocytes sur le côté inférieur du filtre ont été colorées et comptés sous le microscope. Migration des monocytes humains vers un milieu conditionné a généré plus de 72 h par MDA-MB-231 (B) et (D) des lignées de cellules HCT116 conditionnellement exprimant PAI-1 en présence et en absence de doxycycline. Les données représentent la moyenne des techniques réanalysés [+/-écart-type (SD)]. Pour chaque répétition, monocytes migrées ont été dénombrées dans 9 domaines en 20 X grossissement objectif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom de l’Oligo | Séquence | ||||
| shARN 1 (anti-PAI-1 séquence 1 - 8 ) | Avant : | shPAI-1 a 5 ' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT 3' | |||
| Verso : | shPAI-1 b 5' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG 3' | ||||
| shARN 2 : (anti-PAI-1 séquence 2) | Avant : | shPAI - 1C 5'-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3' | |||
| Verso : | shPAI - 1D 5'-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3' | ||||
| shARN 3 (anti-PAI-1 séquence - 3 9) | Avant : | shPAI-1E 5'-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3' | |||
| Verso : | shPAI-1F 5'-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3' | ||||
| Scramble (brouiller la séquence - 4 9) | Avant : | Scramble 1 5'-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3' | |||
| Verso : | Scramble 2 5'-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3' | ||||
Table 1. séquences de shRNA. Ici 3 séquences de shARN contre PAI-1 ont été testés pour l’effet plus silencieux : shARN 1, shRNA 2, shRNA 3 et brouillé
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Discussion
Composé d’une variété de types de cellules, le TME est crucial pour le développement du cancer. Afin de déterminer les conditions optimales de croissance, les cellules cancéreuses attirent les monocytes par sécrétion de facteurs chimiotactiques. Nous présentons ici un protocole pour l’étude du mécanisme de recrutement de monocytes par des cellules tumorales in vitro. À cette fin, une combinaison de système d’expression de gène inductible, purification des monocytes humains primaires et à titre d’exemple d’un test de migration, l’essai de chambre de Boyden, est utilisée.
La première étape critique dans le protocole présenté est de confirmer le clonage correct des séquences shARN dans le vecteur de Tet-ON, qui doit toujours être évaluée par séquençage. Création des lignées cellulaires Tet-ON stables fonctionnelles doit être confirmé en testant le KD en présence de la doxycycline par Western Blot. Le montant de la doxycycline appliquée peut varier entre les lignées de cellules, et c’est pourquoi il est conseillé de tester les concentrations effectives de KD et de toxicité sur les cellules. Un inconvénient connu du système inductible par la tétracycline est leur perméabilité6,7. La quantité de protéine détectée en présence et en absence de doxycycline doit être mesurée et comparée aux contrôles brouillés pour tenir compte de cet effet. Dans les expériences in vitro , un faible niveau de perméabilité est observé avec le KD shRNA2 et shRNA3, comme le montre la Figure 2. En outre, il est important de toujours utiliser sérum exempt de tétracycline in vitro pour éviter une diminution du taux de protéines dans des conditions de contrôle. Le système utilisé dans le présent protocole a des avantages par rapport aux autres systèmes de Tet-ON car il nécessite un clonage unique vecteur, permet la génération rapide de plusieurs clones et montre des niveaux très bas de perméabilité.
Une étape cruciale dans l’obtention des monocytes humains primaires du sang est l’obtention de bonne séparation de gradient, qui repose sur la superposition lente du sang dilué sur le gradient de densité. Une autre étape cruciale du protocole est d’estimer correctement le nombre de cellules avant l’étape de sélection négative car elle déterminera la quantité d’anticorps cocktail et magnétique de perles ajoutées à la suspension de sang. Afin d’assurer la reproductibilité des expériences, plus d’un donneur de sang doit être utilisé dans des expériences répétées. Cette technique est supérieure aux alternatives existantes de purification monocyte, y compris un gradient de densité et protocole adhérence34 et une procédure en deux étapes avec des gradients unique21, car il garantit que la contamination des lymphocytes bas niveau et de haute pureté (> 95 %) des monocytes obtenus. Étant donné que les types de cellules non-monocytaire sont retirés du mélange PBMC par sélection négative, les monocytes n’entrent pas en contact direct avec les anticorps présents dans le cocktail d’anticorps et donc le risque de monocytes deviennent activés par interaction avec les anticorps est minime. Autres applications des cellules obtenues peuvent inclure la différenciation des monocytes en macrophages grâce à des expériences in vitro et in vivo , où des monocytes humains sont injectées à des souris immunodéficientes. Modifications du protocole comprennent généralement utiliser le tampon de lyse des globules rouges pendant les étapes de lavage de PBMC. Cette modification vise à un retrait supplémentaire des globules rouges en appliquant la pression osmotique. Limites de la technique comprennent un nombre limité de macrophages qui peuvent être obtenues à l’aide d’un montant déterminé des réactifs.
Le test de migration de chambre de Boyden est un moyen rapide et simple d’analyser si une protéine sécrétée ou une lignée cellulaire stimule la migration des autres types de cellules. Les pièges de ce test sont faible sensibilité et ne tenant ne pas compte des cellules subissant la mort cellulaire. Les moyens de répondre à ces préoccupations seraient confirmant les résultats avec un dosage différent comme un microfluidique basée test ainsi qu’une expérience temporelle où la migration est mesurée sur une période plus courte. À l’exception de petites populations, monocytes matures ne prolifèrent pas in vivode35,36; Cependant si les autres cellules sont utilisées, un délai plus court que leur cycle de division devrait être choisi pour éviter une augmentation dans le nombre de cellules. Alternativement, les réactifs bloquant la division cellulaire devraient être utilisés pour éviter de changer le nombre de cellules initialement plaqué.
Le protocole présenté ici peut être facilement adapté à l’étude des autres protéines sécrétées par les cellules cancéreuses et leurs fonctions paracrine. Une des applications possibles des lignées cellulaires de cancer conditionnelles KD étudie le rôle des protéines dont KD est toxique pour les cellules non seulement in vitro , mais aussi en vivo, où les lignées cellulaires Tet réglementés sont transplantées chez des souris, et le KD est induite après la mise en place de la tumeur par l’ajout de doxycycline à l’eau potable.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Jacqueline Rosenberg pour la relecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le US Department of Health and Human Services/National Institutes of Health grâce à une subvention à YA DeClerck (Don 5R01 CA 129377) et la Fondation de Martell TJ. MH Kubala est le récipiendaire d’une bourse de développement de carrière de chercheur de l’Institut de recherche de Saban à la Hospital de Los Angeles de l’enfance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
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