Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor
Summary
Este protocolo serve como um esquema para a criação de um sistema funcional de Tet-ON em linhas de células de câncer e sua utilização posterior, em especial para estudar o papel das proteínas derivado de células de tumor no recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do tumor.
Abstract
siRNA e mediada por shRNA derrubar métodos (KD), de regular a expressão gênica são ferramentas inestimáveis para compreender a função do gene e proteína. No entanto, no caso que o KD da proteína de interesse tem um efeito letal sobre as células ou o efeito esperado o KD é dependente do tempo, incondicionais métodos KD não são adequados. Sistemas condicionais são mais adequados nestes casos e têm sido alvo de muito interesse. Estes incluem sistemas de superexpressão isoinokosterone-inducible, de sistema de indução do citocromo P-4501, e a tetraciclina regulada sistemas de expressão do gene.
O sistema de expressão de gene de tetraciclina regulada permite controle reversível sobre a expressão da proteína por indução da expressão de shRNA na presença de tetraciclina. Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental usando o sistema funcional de Tet-ON em linhas de células cancerosas humanas para condicional regulação da expressão génica. Então, vamos mostrar o uso deste sistema no estudo da interação célula-monócito de tumor.
Introduction
Tumor associado os macrófagos (TAMs) contribuam para o desenvolvimento de tumor, promovendo o crescimento do tumor, metástase e regulação da resposta imune2. As células cancerosas recruta monócitos inflamatória, que se infiltrar o tumor e se diferenciar em pro-oncogenicidade TAMs3. Infiltração do tumor com TAMs correlaciona-se com resultado clínico ruim e tem sido associada à função imunossupressora de macrófagos4,5. No entanto, os mecanismos de recrutamento de macrófagos para o tumor não são bem explorados e uma melhor compreensão das vias envolvidas é crucial para o avanço mais do campo e terapias promissoras. Um dos desafios no estudo de interações entre células tumorais e as células normais no microambiente do tumor (TME) é a complexidade dos mecanismos e de células envolvidas, exigindo abordagens em vitro que permitem que a dissecação do crosstalk. Aqui apresentamos uma metodologia versátil que pode ser aplicada para estudar o efeito parácrina de um cancro derivado de células, proteína secretada na migração de outros tipos de células como macrófagos, em vitro. Usando um sistema onde a expressão do shRNA contra um cancro derivado de células da proteína envolvida no recrutamento de monócitos está sob o controle do promotor inducible tetraciclina, o efeito de parácrina da proteína secretada em monócitos é quantificado. Neste protocolo, clonagem de shRNA sequências em vetor regulamentado é apresentado a tetraciclina seguido pela geração de linhas de células de câncer estável. Além disso, a purificação de monócitos humanos primários e um ensaio de câmara Boyden são usados para analisar o efeito parácrina uma proteína derivada de célula cancerosa na migração de monócitos.
Downregulation de proteína codificação de genes é comumente aplicado com técnicas de siRNA e shRNA, embora não sem limitações no seu uso. O longo prazo knock-down (KD) de genes pode eliciar respostas adaptativas secundárias das células que interferem com os resultados experimentais. Falta de controle temporal sobre a expressão dos genes torna desafiador para estudar o papel dinâmico de uma proteína ao longo do tempo ou o papel de uma proteína essencial para a sobrevivência da pilha. Esta questão é especialmente importante nas configurações na vivo , onde o papel de uma proteína no desenvolvimento do tumor e progressão pode exigir downregulation da expressão da proteína de interesse, só depois o tumor é estabelecida. KD condicional tem a vantagem de evitar um efeito letal cedo de KD a células e para permitir a análise do papel da proteína dentro de diferentes estágios de crescimento do tumor, enquanto KD incondicional pode resultar em falta de desenvolvimento do tumor.
Um número de condicional KD sistemas foram desenvolvido para resolver as limitações de KD estável. Os sistemas de expressão do gene condicional incluem isoinokosterone-inducible superexpressão sistemas, o citocromo P-450 indução sistema1, e tetraciclina regulada sistemas de expressão do gene. Os sistemas de expressão do gene tetraciclina-regulado permitem controle sobre a expressão do shRNA sobre adição da antibiótico tetraciclina (ou seu análogo mais estável – doxiciclina). Em sistemas de Tet-ON, a expressão de shRNA é induzida na presença de tetraciclina/doxiciclina, resultando em uma expressão de gene KD, enquanto em sistemas de Tet-OFF, a expressão de shRNA é suprimida na presença de tetraciclina, resultando na expressão gênica. Uma desvantagem do sistema tetraciclina-inducible é relatados anteriormente a baixos níveis de expressão de shRNA na ausência de doxiciclina – so-called leakiness6,7. No Tet-ON sistema descrito aqui, após administração de tetraciclina, a ligação da proteína do repressor (juntos) tetraciclina constitutivamente expressa à sequência de elemento (TRE) Tet-responsivo na região promotora do shRNA de interesse é o H1 suprimida. Isso resulta em expressão de shRNA e inibição da tradução da proteína de interesse em uma maneira dependente de tetraciclina8,9.
Outros sistemas de Tet-ON disponíveis incluem bater-em simultâneo do TetO começar a sequência entre caixa TATA e elemento de sequência proximal (PSE) e entre a transcrição e caixa TATA site desenvolvido por Chan et al. 10 este sistema requer menos de doses tóxicas de tetraciclina para regular a expressão de shRNA, no entanto, sob um estado de não-induzida, níveis baixos de shRNA são expressos. A caixa Krüppel-associado (CASCUDO) com base em Tet-ON sistema11 inclui CASCUDO, uma proteína do dedo do zinco, que genes de indivíduos localizados dentro de um intervalo de 3 kb do sítio de ligação do CASCUDO supressão transcricional. A tTRKRAB de proteínas quiméricas pode ligar para o TetO, e devido a grande gama de capacidade controlável de DNA, TetO não precisa ser limitado entre a transcrição iniciar o site e o promotor e tem baixo impacto sobre a atividade do promotor. Sob o estado de não-induzida, este sistema de interferência de RNA controlável foi relatado para mostrar um nível inferior de expressão vazada de shRNA11,12; no entanto, requer uma abordagem de clonagem sequencial, dois-vector. Em comparação com anteriormente condicional KD sistemas desenvolvidos tais como o sistema de isoinokosterone-inducible superexpressão ou sistema de indução do citocromo P-450, o sistema de tetraciclina-regulado tem a vantagem de sua robustez e reversibilidade e, portanto, é o mais utilizado, rotineiramente, sistema13. O sistema utilizado no presente protocolo tem a vantagem sobre o TetO batida-em sistema dual e CASCUDO Tet-ON sistema como exige para a frente, o único vetor de clonagem, permitindo a rápida geração de vários clones, e apresenta níveis muito baixos de leakiness na ausência de doxiciclina.
TME é fundamental para o desenvolvimento de câncer. Para facilitar o crescimento do tumor, as células cancerosas recrutam inflamatórios monócitos através da secreção de proteínas Quimiotáticos. Os monócitos recrutados infiltrar o tumor e diferenciarem em pro-oncogenicidade TAMs que contribuem para o crescimento do tumor e metástases. Estudos in vitro do recrutamento celular imune utilizam ensaios de migração, com Boyden ensaio de câmara, sendo amplamente usado14,15,16,17. Neste ensaio, a fonte de proteína quimiotático, por exemplo, as células cancerosas, ou uma proteína purificada, é colocada na câmara inferior. Células do sistema imunológico são colocadas na câmara superior, separada por uma membrana porosa do compartimento inferior. Migrando para o gradiente crescente de quimiotático e aqueles encontrados no lado inferior da membrana de células são manchadas e contadas sob o microscópio. Aqui nós testamos a função quimiotático de plasminogênio ativador inibidor 1 (PAI-1) em monócitos por gerar linhas de células de câncer estável, inducible onde a expressão de PAI-1 é regulada pela adição de doxiciclina. Nós usamos humanos primários monócitos no ensaio de migração de Boyden câmara para avaliar o papel de PAI-1 em migração de monócitos. Diferenças entre humanos primários monócitos e linhas de célula monocítica amplamente utilizada como THP1 têm sido relatadas e incluem citocinas diferentes padrões de expressão18; por exemplo, aumento de 5-10 vezes nos níveis de expressão de TNF-α por células THP1 comparado com monócitos humanos19. As células THP1 são derivados de células de leucemia humana monocítica, são fáceis de manter e se proliferam com uma média de tempo de 19-50 h20de duplicação. Pelo contrário, os monócitos humanos caracterizam-se por uma vida curta na ausência de fatores de crescimento. Uma vez que os monócitos são purificados de sangue de doadores, uma quantidade razoável de variabilidade ocorre entre os indivíduos e, dependendo do método de purificação, pode ocorrer contaminação com outros tipos de células. Não obstante, monócitos primários são relevantes e foi recomendado para usar ou confirmar os resultados obtidos com as linhas de célula monocítica usando monócitos primários em pesquisas biológicas19. Aqui descrevemos um protocolo para a purificação do humanos primários monócitos do sangue periférico. Métodos alternativos de purificação monócito incluem protocolos de aderência e gradiente de densidade e procedimento de dois passos com único gradientes de Ficoll-Hypaque seguido por um gradiente de Percoll21. A pureza da população monócitos obtida por esses intervalos de métodos entre 70-90%. O método descrito aqui usa um gradiente de densidade, seguido por uma seleção negativa imune22 e permite a purificação de monócitos humanos sem contacto directo com os anticorpos, assim, evitando a sua activação acidental e resultando em um > 95% da população pura de monócitos.
O protocolo apresentado aqui é usado para configurar um sistema funcional de Tet-ON para expressão gênica KD em linhas de células cancerosas humanas para estudar o efeito quimiotático da câncer-derivado secretada proteína PAI-1 em monócitos. PAI-1 é overexpressed por uma variedade de tumores e sua expressão, paradoxalmente, correlaciona-se com resultado clínico ruim23,24. O papel pro-oncogenicidade do PAI-1 é um resultado de sua pro-angiogênico e anti-apoptotic funções25,26. PAI-1 tem demonstrado contribuir para a inflamação, promovendo o recrutamento de macrófagos para o local da inflamação,27. PAI-1 foi mostrado para promover o músculo liso cellmigration28,29 e participar no Mac-1 dependente macrófago migração30. PAI-1 superexpressão também mostrou significativamente melhorar o recrutamento de macrófagos 264.7 crus para de tumores de melanoma B16F1031. No entanto, o papel de PAI-1 em migração TAM não tem sido pesquisado em detalhe. Nós usamos o protocolo descrito para responder à pergunta de se o PAI-1 atrai monócitos para células cancerosas. Esta metodologia permite que a dissecação do crosstalk entre tumor e TME silenciar a proteína secretada em células cancerosas e analisando os componentes do TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
Composto por uma variedade de tipos de células, o TME é crucial para o desenvolvimento de câncer. Para verificar as condições ideais de crescimento, as células cancerosas atraem monócitos através da secreção de Fatores Quimiotáticos. Aqui nós apresentamos um protocolo para o estudo do mecanismo de recrutamento de monócitos por tumor células em vitro. Para este efeito, uma combinação do sistema de expressão de gene inducible, purificação de monócitos humanos primários e como um exemplo de um …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de acusar Jacqueline Rosenberg para revisão do manuscrito. Este trabalho foi financiado nos nacional/departamento de saúde e serviços humanos institutos de saúde com uma subvenção para YA Santos (conceder 5R01 CA 129377) e o TJ Martell Foundation. Kubala MH é o destinatário de um prêmio de bolsa de desenvolvimento de carreira de pesquisa do Instituto de pesquisa de Saban L.a. às crianças Hospital.
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
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