Summary

Knockdown condicional de expressão gênica em linhas de células de câncer para estudar o recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do Tumor

Published: November 23, 2017
doi:

Summary

Este protocolo serve como um esquema para a criação de um sistema funcional de Tet-ON em linhas de células de câncer e sua utilização posterior, em especial para estudar o papel das proteínas derivado de células de tumor no recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do tumor.

Abstract

siRNA e mediada por shRNA derrubar métodos (KD), de regular a expressão gênica são ferramentas inestimáveis para compreender a função do gene e proteína. No entanto, no caso que o KD da proteína de interesse tem um efeito letal sobre as células ou o efeito esperado o KD é dependente do tempo, incondicionais métodos KD não são adequados. Sistemas condicionais são mais adequados nestes casos e têm sido alvo de muito interesse. Estes incluem sistemas de superexpressão isoinokosterone-inducible, de sistema de indução do citocromo P-4501, e a tetraciclina regulada sistemas de expressão do gene.

O sistema de expressão de gene de tetraciclina regulada permite controle reversível sobre a expressão da proteína por indução da expressão de shRNA na presença de tetraciclina. Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental usando o sistema funcional de Tet-ON em linhas de células cancerosas humanas para condicional regulação da expressão génica. Então, vamos mostrar o uso deste sistema no estudo da interação célula-monócito de tumor.

Introduction

Tumor associado os macrófagos (TAMs) contribuam para o desenvolvimento de tumor, promovendo o crescimento do tumor, metástase e regulação da resposta imune2. As células cancerosas recruta monócitos inflamatória, que se infiltrar o tumor e se diferenciar em pro-oncogenicidade TAMs3. Infiltração do tumor com TAMs correlaciona-se com resultado clínico ruim e tem sido associada à função imunossupressora de macrófagos4,5. No entanto, os mecanismos de recrutamento de macrófagos para o tumor não são bem explorados e uma melhor compreensão das vias envolvidas é crucial para o avanço mais do campo e terapias promissoras. Um dos desafios no estudo de interações entre células tumorais e as células normais no microambiente do tumor (TME) é a complexidade dos mecanismos e de células envolvidas, exigindo abordagens em vitro que permitem que a dissecação do crosstalk. Aqui apresentamos uma metodologia versátil que pode ser aplicada para estudar o efeito parácrina de um cancro derivado de células, proteína secretada na migração de outros tipos de células como macrófagos, em vitro. Usando um sistema onde a expressão do shRNA contra um cancro derivado de células da proteína envolvida no recrutamento de monócitos está sob o controle do promotor inducible tetraciclina, o efeito de parácrina da proteína secretada em monócitos é quantificado. Neste protocolo, clonagem de shRNA sequências em vetor regulamentado é apresentado a tetraciclina seguido pela geração de linhas de células de câncer estável. Além disso, a purificação de monócitos humanos primários e um ensaio de câmara Boyden são usados para analisar o efeito parácrina uma proteína derivada de célula cancerosa na migração de monócitos.

Downregulation de proteína codificação de genes é comumente aplicado com técnicas de siRNA e shRNA, embora não sem limitações no seu uso. O longo prazo knock-down (KD) de genes pode eliciar respostas adaptativas secundárias das células que interferem com os resultados experimentais. Falta de controle temporal sobre a expressão dos genes torna desafiador para estudar o papel dinâmico de uma proteína ao longo do tempo ou o papel de uma proteína essencial para a sobrevivência da pilha. Esta questão é especialmente importante nas configurações na vivo , onde o papel de uma proteína no desenvolvimento do tumor e progressão pode exigir downregulation da expressão da proteína de interesse, só depois o tumor é estabelecida. KD condicional tem a vantagem de evitar um efeito letal cedo de KD a células e para permitir a análise do papel da proteína dentro de diferentes estágios de crescimento do tumor, enquanto KD incondicional pode resultar em falta de desenvolvimento do tumor.

Um número de condicional KD sistemas foram desenvolvido para resolver as limitações de KD estável. Os sistemas de expressão do gene condicional incluem isoinokosterone-inducible superexpressão sistemas, o citocromo P-450 indução sistema1, e tetraciclina regulada sistemas de expressão do gene. Os sistemas de expressão do gene tetraciclina-regulado permitem controle sobre a expressão do shRNA sobre adição da antibiótico tetraciclina (ou seu análogo mais estável – doxiciclina). Em sistemas de Tet-ON, a expressão de shRNA é induzida na presença de tetraciclina/doxiciclina, resultando em uma expressão de gene KD, enquanto em sistemas de Tet-OFF, a expressão de shRNA é suprimida na presença de tetraciclina, resultando na expressão gênica. Uma desvantagem do sistema tetraciclina-inducible é relatados anteriormente a baixos níveis de expressão de shRNA na ausência de doxiciclina – so-called leakiness6,7. No Tet-ON sistema descrito aqui, após administração de tetraciclina, a ligação da proteína do repressor (juntos) tetraciclina constitutivamente expressa à sequência de elemento (TRE) Tet-responsivo na região promotora do shRNA de interesse é o H1 suprimida. Isso resulta em expressão de shRNA e inibição da tradução da proteína de interesse em uma maneira dependente de tetraciclina8,9.

Outros sistemas de Tet-ON disponíveis incluem bater-em simultâneo do TetO começar a sequência entre caixa TATA e elemento de sequência proximal (PSE) e entre a transcrição e caixa TATA site desenvolvido por Chan et al. 10 este sistema requer menos de doses tóxicas de tetraciclina para regular a expressão de shRNA, no entanto, sob um estado de não-induzida, níveis baixos de shRNA são expressos. A caixa Krüppel-associado (CASCUDO) com base em Tet-ON sistema11 inclui CASCUDO, uma proteína do dedo do zinco, que genes de indivíduos localizados dentro de um intervalo de 3 kb do sítio de ligação do CASCUDO supressão transcricional. A tTRKRAB de proteínas quiméricas pode ligar para o TetO, e devido a grande gama de capacidade controlável de DNA, TetO não precisa ser limitado entre a transcrição iniciar o site e o promotor e tem baixo impacto sobre a atividade do promotor. Sob o estado de não-induzida, este sistema de interferência de RNA controlável foi relatado para mostrar um nível inferior de expressão vazada de shRNA11,12; no entanto, requer uma abordagem de clonagem sequencial, dois-vector. Em comparação com anteriormente condicional KD sistemas desenvolvidos tais como o sistema de isoinokosterone-inducible superexpressão ou sistema de indução do citocromo P-450, o sistema de tetraciclina-regulado tem a vantagem de sua robustez e reversibilidade e, portanto, é o mais utilizado, rotineiramente, sistema13. O sistema utilizado no presente protocolo tem a vantagem sobre o TetO batida-em sistema dual e CASCUDO Tet-ON sistema como exige para a frente, o único vetor de clonagem, permitindo a rápida geração de vários clones, e apresenta níveis muito baixos de leakiness na ausência de doxiciclina.

TME é fundamental para o desenvolvimento de câncer. Para facilitar o crescimento do tumor, as células cancerosas recrutam inflamatórios monócitos através da secreção de proteínas Quimiotáticos. Os monócitos recrutados infiltrar o tumor e diferenciarem em pro-oncogenicidade TAMs que contribuem para o crescimento do tumor e metástases. Estudos in vitro do recrutamento celular imune utilizam ensaios de migração, com Boyden ensaio de câmara, sendo amplamente usado14,15,16,17. Neste ensaio, a fonte de proteína quimiotático, por exemplo, as células cancerosas, ou uma proteína purificada, é colocada na câmara inferior. Células do sistema imunológico são colocadas na câmara superior, separada por uma membrana porosa do compartimento inferior. Migrando para o gradiente crescente de quimiotático e aqueles encontrados no lado inferior da membrana de células são manchadas e contadas sob o microscópio. Aqui nós testamos a função quimiotático de plasminogênio ativador inibidor 1 (PAI-1) em monócitos por gerar linhas de células de câncer estável, inducible onde a expressão de PAI-1 é regulada pela adição de doxiciclina. Nós usamos humanos primários monócitos no ensaio de migração de Boyden câmara para avaliar o papel de PAI-1 em migração de monócitos. Diferenças entre humanos primários monócitos e linhas de célula monocítica amplamente utilizada como THP1 têm sido relatadas e incluem citocinas diferentes padrões de expressão18; por exemplo, aumento de 5-10 vezes nos níveis de expressão de TNF-α por células THP1 comparado com monócitos humanos19. As células THP1 são derivados de células de leucemia humana monocítica, são fáceis de manter e se proliferam com uma média de tempo de 19-50 h20de duplicação. Pelo contrário, os monócitos humanos caracterizam-se por uma vida curta na ausência de fatores de crescimento. Uma vez que os monócitos são purificados de sangue de doadores, uma quantidade razoável de variabilidade ocorre entre os indivíduos e, dependendo do método de purificação, pode ocorrer contaminação com outros tipos de células. Não obstante, monócitos primários são relevantes e foi recomendado para usar ou confirmar os resultados obtidos com as linhas de célula monocítica usando monócitos primários em pesquisas biológicas19. Aqui descrevemos um protocolo para a purificação do humanos primários monócitos do sangue periférico. Métodos alternativos de purificação monócito incluem protocolos de aderência e gradiente de densidade e procedimento de dois passos com único gradientes de Ficoll-Hypaque seguido por um gradiente de Percoll21. A pureza da população monócitos obtida por esses intervalos de métodos entre 70-90%. O método descrito aqui usa um gradiente de densidade, seguido por uma seleção negativa imune22 e permite a purificação de monócitos humanos sem contacto directo com os anticorpos, assim, evitando a sua activação acidental e resultando em um > 95% da população pura de monócitos.

O protocolo apresentado aqui é usado para configurar um sistema funcional de Tet-ON para expressão gênica KD em linhas de células cancerosas humanas para estudar o efeito quimiotático da câncer-derivado secretada proteína PAI-1 em monócitos. PAI-1 é overexpressed por uma variedade de tumores e sua expressão, paradoxalmente, correlaciona-se com resultado clínico ruim23,24. O papel pro-oncogenicidade do PAI-1 é um resultado de sua pro-angiogênico e anti-apoptotic funções25,26. PAI-1 tem demonstrado contribuir para a inflamação, promovendo o recrutamento de macrófagos para o local da inflamação,27. PAI-1 foi mostrado para promover o músculo liso cellmigration28,29 e participar no Mac-1 dependente macrófago migração30. PAI-1 superexpressão também mostrou significativamente melhorar o recrutamento de macrófagos 264.7 crus para de tumores de melanoma B16F1031. No entanto, o papel de PAI-1 em migração TAM não tem sido pesquisado em detalhe. Nós usamos o protocolo descrito para responder à pergunta de se o PAI-1 atrai monócitos para células cancerosas. Esta metodologia permite que a dissecação do crosstalk entre tumor e TME silenciar a proteína secretada em células cancerosas e analisando os componentes do TME.

Protocol

A seção de protocolo que usa monócitos humanos obtidos de voluntários sadios segue as diretrizes do Hospital Los Angeles humano pesquisa Comitê das crianças de ética e foi aprovada pelo Conselho de revisão institucional sob o Material humano Número do protocolo: ICC 08-00208. 1. preparação de linhas de células de câncer com tetraciclina-regulado shRNA expressão Clonagem de shRNA PAI-1 em vetor Tet-pLKO-puro 8 , <sup cl…

Representative Results

Três sequências de shRNA foram testadas para KD mais eficiente de PAI-1. Por isso, sequências de shRNA contra PAI-1 e ovos mexidos (tabela 1) foram clonadas em vetor de expressão Tet-pLKO-puro seguindo o protocolo descrito acima. A linha de celular HT-1080 Fibrossarcoma foi estàvel transfected com construções geradas e as células foram tratadas com doxiciclina por 3 dias. A expressão de PAI-1 foi verificada pela mancha de (Fi…

Discussion

Composto por uma variedade de tipos de células, o TME é crucial para o desenvolvimento de câncer. Para verificar as condições ideais de crescimento, as células cancerosas atraem monócitos através da secreção de Fatores Quimiotáticos. Aqui nós apresentamos um protocolo para o estudo do mecanismo de recrutamento de monócitos por tumor células em vitro. Para este efeito, uma combinação do sistema de expressão de gene inducible, purificação de monócitos humanos primários e como um exemplo de um …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de acusar Jacqueline Rosenberg para revisão do manuscrito. Este trabalho foi financiado nos nacional/departamento de saúde e serviços humanos institutos de saúde com uma subvenção para YA Santos (conceder 5R01 CA 129377) e o TJ Martell Foundation. Kubala MH é o destinatário de um prêmio de bolsa de desenvolvimento de carreira de pesquisa do Instituto de pesquisa de Saban L.a. às crianças Hospital.

Materials

Tet-pLKO-puro lentiviral vector Addgene 21915
FBS (Tetracycline-free) Omega Scientific FB-15
Histopaque Sigma 10771-500ML
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell 19059
EasySep Magnet StemCell 18002
EcoRI HF NEB R3101S
AgeI HF NEB R3552S
Cut Smart buffer NEB B7200S
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System PROMEGA A9281
psPAX vector Addgene 12260
pMD2.G vector Addgene 12259
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher Scientific C737303
Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain Protocol 123-869
HEK293 cells ATCC CRL-1573
PBS Corning 21-031-CV
XhoI restriction enzyme NEB R0146S
Ligase NEB M0202S
Ligase buffer NEB M0202S
EDTA 0.5 M solution Thermo Fisher Scientific R1021
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
The Big Easy" EasySep Magnet Stem Cell 18001
0.1% Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S7670
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
0.45 μM syringe filters VWR International 28145-479
NaOH Sigma-Aldrich S5881-500g
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Invitrogen 15504-020
Sodium Chloride(NaCl) Sigma-Aldrich S7653-5 kg
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266-100g
dithioerythritol (DTE) Sigma-Aldrich B8255-5g
ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich 792780
tryptone Amresco J859-500g
yeast extract Fluka 70161-500g
Bacto agar BD 214010
ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5g
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Corning 10-013-CV
phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-031-CV
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
puromycin Sigma-Aldrich P9620
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Corning 10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0 Thermo Fisher Scientific R1021
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane Becton Dickinson 353097
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cotton-Tipped Applicator  Medline MDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack  Fisher Scientific Company 123-869
Resolve Immersion Oil, High Viscosity Richard Allan Scientific M4004
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122

References

  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
  4. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
  7. Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
  8. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  9. Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
  10. Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
  11. Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
  12. Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
  13. Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
  14. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  15. Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
  16. Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
  17. Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
  18. Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
  19. Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
  20. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  21. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  22. Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
  23. Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
  24. Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
  25. Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
  26. Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
  27. Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
  28. Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
  29. Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
  30. Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
  31. Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
  32. Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
  33. Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
  34. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
  35. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  36. Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).

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Cite This Article
Kubala, M. H., DeClerck, Y. A. Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (129), e56333, doi:10.3791/56333 (2017).

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