Summary
Digitale holografiske mikroskopi (DHM) er en volumetrisk teknik, der tillader imaging prøver 50-100 X tykkere end brightfield mikroskopi på sammenlignelige opløsning, med fokusering udført post-processing. DHM bruges her til at identificere, tælle, og tracking mikroorganismer på meget lav tætheder og sammenlignet med optisk tæthed målinger, kimtal og direkte count.
Abstract
Præcist afsløre og tælle sparsomme bakteriel prøver har mange anvendelser i mad, drikkevarer, farmaceutiske forarbejdningsindustri, i medicinsk diagnostik og for livet påvisning af robot missioner til andre planeter og måner af solsystemet. I øjeblikket tælles sparsomme bakteriel prøver efter kultur plating eller epifluorescensmikroskop mikroskopi. Kultur plader kræver lange inkubation gange (dage til uger), og epifluorescensmikroskop mikroskopi kræver omfattende farvning og koncentration af prøven. Vi viser her, hvordan off-axis digitale holografiske mikroskopi (DHM) til at optælle bakterier i meget fortyndet kulturer (100-104 celler/mL). Først, opførelsen af den brugerdefinerede DHM er drøftet, sammen med detaljerede instruktioner om at bygge et billigt instrument. Principperne om holografi er drøftet, og en statistisk model bruges til at anslå, hvor lang tid videoer bør være at opdage celler, baseret på karakteristika for instrumentets optiske ydeevne og koncentrationen af den bakterielle løsning (tabel 2) . Video påvisning af celler på 105, 104, 103og 100 celler/mL er demonstreret i realtid ved hjælp af un-rekonstruerede hologrammer. Genopbygning af amplitude og fase billeder er vist ved hjælp af en open source-softwarepakke.
Introduction
Bestemmelse af nøjagtige bakteriel tæller i meget fortyndet prøver er afgørende i mange applikationer: et par eksempler er vand og mad kvalitet analyse1,2,3; påvisning af patogener i blod, cerebrospinalvæske eller sputum4,5; produktion af farmaceutiske produkter, herunder sterilt vand6; og miljømæssige samfund analyse i oligotrophic miljøer som det åbne hav og sedimenter7,8,9. Der også stigende interesse for påvisning af mulige bevarede mikrobielle liv på de iskolde måner af Jupiter og Saturn, især Europa10,11 og Enceladus12,13, 14, som er kendt for at have undergrunden flydende oceaner. Fordi ingen mission siden Viking i 1978 har forsøgt at finde bevarede liv på en anden planet, har der været begrænset udvikling af teknologier og instrumenter for bakteriel identifikation og tælling under plads missioner15.
Traditionelle metoder til kimtal finde kun bestemmelse celler, som kan repræsentere et mindretal af arter i miljøet stammer, undertiden < 1%16. Plader kræver dage eller uger af inkubation for maksimal succes, afhængigt af stammen. Epifluorescensmikroskop mikroskopi har stort set erstattet plade tæller som guldstandarden for hurtig og præcis mikrobielle optælling. Nukleinsyre-syre-mærkning fluorescerende farvestoffer såsom 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI), SYBR Green eller acridin orange der binder sig til nukleinsyrer er typisk farvestoffer brugt17,18,19 , selvom mange undersøgelser bruger fluorescerende indikatorer for Gram log20,21,22,23,24. Ved hjælp af disse metoder uden forudgående koncentration trin fører til detektionsgrænser (LoDs) ~ 105 celler pr. mL. Forbedringer i LoD er muligt ved hjælp af filtrering. En flydende er vakuum-filtreret på en membran, som regel polycarbonat og ideelt sort at reducere baggrund. Lav-baggrund farvestoffer såsom DNA pletter nævnt ovenfor kan anvendes direkte til filter25. For præcis optælling af øjet, ~ 105 celler er påkrævet per filter, hvilket betyder, at prøver mere fortyndet end ~ 105 celler pr. mL, betydelig prøve diskenheder skal indsamles og filtreret. Laser-scanning enheder er blevet udviklet for systematisk udforske alle regioner af filteret og dermed mindske antallet af celler, der kræves for at tælle, at skubbe detektionsgrænser ned til ~ 102 celler pr. mL26. Men disse er ikke tilgængelige i de fleste laboratorier, og kræver avancerede hardware såvel som software der tillader ekspert bekræftelse, der observeres partikler er bakterier og ikke snavs.
For reference, begynder voksne med sepsis normalt viser symptomer på < 100 celler/mL af blodet, og spædbørn på < 10 celler/mL. En blod draw fra en voksen tager 10 mL, og fra spæd, 1 mL. PCR-baserede metoder er hæmmet af tilstedeværelsen af menneskelige og ikke-patogene flora DNA og PCR-hæmmende komponenter i blod27,28. Trods en række nye teknikker fortsat kulturer guldstandarden til diagnosticering af infektioner i blodet, især i mere landlige områder eller udviklingslande. Til påvisning af liv på andre planeter, kan termodynamiske beregninger vurdere energi budget for liv og dermed den forventede mulige biomasse. 1 - 100 celler/mL forventes at være termodynamisk rimelig Europa29. Det kan let ses fra disse numre, registrering af et meget lille antal celler i store mængder af vandig opløsning er et vigtigt uløste problem.
I dette papir, vi vise påvisning af Serratia marcescens og Shewanella oneidensis (wild-type og ikke-motile mutant) i koncentrationer på 105, 104, 103og 100 celler/mL ved hjælp af en off-axis digitale holografiske mikroskop (DHM). Den vigtigste fordel ved DHM over traditionelle lysmikroskopi er den samtidige imaging af en tyk sample volumen med høj opløsning – i denne implementering i prøve salen var 0,8 mm tyk. Disse prøve afdelingerne blev bygget af den bløde-litografi af Polydimethylsiloxan (PDMS) fra en præcision-bearbejdet aluminium støbeform med en tolerance på ± 50 µm. Dette repræsenterer en ca 100-fold forbedring i dybde af felt over high-power lysmikroskopi. DHM indeholder også kvantitative fase oplysninger, giver mulighed for målinger af lysvej (produkt af brydningsindekset og tykkelse). DHM og lignende teknikker har været anvendt til overvågning af bakteriel og gær cellecyklus og beregning af bakteriel tør masse30,31,32; spredning forskelle kan endda bruges til at differentiere bakteriestammer33.
Det instrument, vi bruger er skræddersyet specielt til brug med mikroorganismer, som tidligere udgivne34,35, og dens design og konstruktion er vist og diskuteret. Vandige opløsninger er løbende leveret til en 0,25 µL volumen prøve salen via sprøjten pumpe; strømningshastigheden er bestemt af kamera billedhastighed for at sikre billeddannelse af hele prøven volumen. En statistisk beregning forudsiger antallet af prøven diskenheder, der skal være afbildet for at afsløre et betydeligt antal celler i en given koncentration.
For celle-opdagelse ansøgninger var genopbygning af hologrammer i amplitude og fase billeder ikke påkrævet; analyse blev udført på den rå hologram. Dette sparer betydelige beregningsmæssige ressourcer og diskplads: en 500 Mb hologram video vil være 1-2 Tb når rekonstrueret. Dog vi diskutere genopbygning gennem dybde af prøven til at bekræfte, at hologrammer repræsenterer den ønskede arter. Et vigtigt træk ved DHM er dens evne til at overvåge både intensitet og fase af billederne. Organismer, der er næsten gennemsigtige i intensitet (f.eks. de fleste biologiske celler) vises tydeligt i fase. Da det er en etiket-gratis teknik, anvendes ingen farvestoffer. Dette er en endvantage for mulige rumfart applikationer, eftersom farvestoffer ikke kan overleve betingelserne af en mission og — endnu vigtigere — ikke antages for at arbejde med udenjordiske organismer, som ikke kan bruge DNA eller RNA til kodning. Det er også en fordel for arbejde i ekstreme miljøer såsom Arktis og Antarktis, hvor farvestoffer kan være vanskeligt at bringe til den afsides beliggenhed og kan nedbrydes ved opbevaring. Genopbygning af billeder i fase og amplitude er udført ved hjælp af en open source-softwarepakke, som vi har stillet til rådighed på GitHub (SHAMPOO) eller ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vækst og tælling af bakterier
NOTE: Dette gælder for næsten enhver bakteriel stamme dyrkes i den passende medium 36. I vores eksempel, vi bruge tre stammer: Serratia marcescens som en fælles, let identificerbare lab stamme; og en mindre, stærkt motile miljømæssige belastning, Shewanella oneidensis hr.-1. Hvis du vil sammenligne påvisning af motile vs. ikke-motile celler, en ikke-motile Shewanella mutant, Δ FlgM, også bruges til sammenligning 37. Alle stammer, der dyrkes i lysogeny bouillon (LB).
- Forbered sterile LB medium (pr. liter destilleret vand: 10 g bacto trypton, 5 g bacto gær, 10 g NaCl; filter eller autoklave). Forberede standard 100 mm diameter LB-agar plader (samme opskrift som medium plus 15 g agar pr. liter, autoklave (121 ° C, 20 min) til at sterilisere og hæld når cool nok til at håndtere). Gemme medium og plader i køleskabet.
- Dagen før eksperimentet frø 5-6 mL af " Master " næringssubstratet fra en frisk bakteriel koloni, ved hjælp af korrekt sterile og biosikkerhed teknik. Ruger på en shaker (120 rpm) ved 30 ° C for ~ 12 h. inkubationstiden vil være afhængig af stamme og vækst sats. I vores forsøg og, inkuberes Shewanella stammer i 12 timer; Men, Serratia er høstet efter 8 timer, for at sikre kulturen udstiller midten af logaritmisk vækst.
- Dag i eksperimentet, tage en spektrofotometrisk læsning (OD 600) af bakterielle Master kultur, som forventes at blive i rækken af 0,6 til 0,7. Det skal i den logaritmiske vækstfase (som bestemt tidligere). Hvis ikke, subkultur 100 µL til 5 mL medium og tillade cellevækst på midten log fasen.
- Tage en prøve af Master kultur og tælle de celler direkte ved hjælp af en Petroff-Hausser tælle kammer. Dette vil optælle både levende og døde celler.
- Uddrag en 10 µL prøve af den ufortyndede kultur med en mikropipette og overføre til kammeret.
- Billede under en høj-dry objektive mikroskop (40 X eller 63 X, NA 0,7 - 0,8) ved hjælp af fasekontrast.
- Tæller bakterier i mindst 20 firkanter og gennemsnittet.
Bemærk: Tæl kun de bakterier, der er helt inden for et kvadrat og kun disse passage over toppen og venstre grænser (eller nederste og højre, hvis du foretrækker). Hvis pladser er adskilt af flere linjer, vælge en som en grænse. - Beregn koncentrationen som gennemsnittet af 20 firkanter x fortyndingsfaktoren. Bemærk, at direkte tæller ikke fungerer godt for koncentrationerne < 10 7 / mL.
- Gøre serielle fortyndinger af kultur til optælling af kolonidannende enheder (CFU). Dette vil optælle levende celler kun.
- Gør en seriel fortynding af hver af de valgte bakterielle prøver med steril 0,9% saltvand løsning. Overføre 20 µL af den bakterielle løsning og fortynd det med 180 µL saltvand. Gentag indtil den laveste koncentration er ~ 10 3 celler/mL.
- Tage 100 µL fra mindst to fortyndinger-foreslog er 10 3 og 10 4 /mL — og plade på en passende solid media plade. Fordelt med en steril sprederen. Udføre mindst 3 replikater af hver fortynding.
- Inkuberes ved en passende temperatur for din bakterier natten over eller indtil kolonier vokse.
- Tæller kolonier og beregne kolonidannende enheder (CFU) Ifølge (# af kolonier x fortyndingsfaktoren) / volumen forkromet = CFU/mL. Gennemsnitlig CFU over replikater.
2. Forberedelse af meget fortynde prøverne for DHM
- gøre serielle fortyndinger af Master kultur for DHM og post-DHM optælling af kolonidannende enheder på LB media plader (Se 1.4.1 - 1.4.4). Udføre denne dobbelt-blind, så den person, der udfører optagelserne er uvidende om koncentrationen i hver prøve, målte.
- Fortyndes bakterier ind i 10-15 mL af en minimal medium, der vil tilskynde motilitet (som relevant) men hæmmer celledelingen, således at koncentrationen af celler ikke ændrer mærkbart under eksperimentet. Dette kan være 0,9% saltvand eller en mere specifik motilitet medium. For eksempel, hvis du bruger Escherichia coli, skal motilitet medium indeholde EDTA 38. Til disse eksempler, bruger vi 0,9% saltvand.
3. Optagelse DHM videoer
- ved hjælp af en steril sprøjte, trækker i ca. 10 mL fortynding af interesse.
- Tilsluttes DHM prøve salen ved hjælp af steril fittings og rør sprøjten.
Bemærk: En custom-made mikrofluid kammer blev bygget for at tillade den sammenhængende strøm af prøven gennem den optiske transmissionslængde af instrumentet. Se afsnittet resultater for flere detaljer. Før forsøget, alle komponenter i prøve salen skal steriliseres ved autoklavering. - Flow prøve fra sprøjten gennem prøve salen løbende ved hjælp af en sprøjte pumpe.
Bemærk: Hensigtsmæssige flowhastigheder afhænger af fluidic kanal dimensioner, ønskede overførselshastighed samt data erhvervelse begrænsninger. - Som prøven er flød gennem i prøve salen, erhverve hologrammer fortløbende på en passende billedhastighed. Et tidsstempel fil vil blive oprettet som logs tidspunktet for hvert billede fange skal bruges senere under dataanalyse (protokollen afsnit 4). Få alle hologrammer ved stuetemperatur (23° C). Optage hologrammer af udfører en pre-skrevet C++ eksekverbare fil leveres af kameraproducenten.
Bemærk: Passende billedhastigheder afhænger af strømningshastigheden valgt. Dette eksperiment, det anbefales at bruge en framerate, således at en bakterie ville være afbildet > 2 gange som det rejste på tværs af instrumentet ' s synsfelt. - Giver mulighed for tilstrækkelig tid til at prøve at være flød gennem DHM hele 10 mL.
- Til at sikre, at bakterier ikke vokser eller dør under forsøgene, podes beriget media plader med 100 µL af brugte medier post-DHM billedoptagelse. Fordelt med en steril sprederen og inkuberes ved passende temp i 24 timer. tælle kolonier stede.
4. Beregning af celle tæthed og begrænsninger af påvisning
- med de erhvervede hologram videoer, analysere data for tilstedeværelsen af bakterier.
- Beregne medianen pixelværdi for en tidsserie af hologrammer og derefter fratrække denne median værdi fra hver respektive pixel at fjerne stationære artefakter i hologrammet. Dette kan gøres i ImageJ ved at udføre følgende trin:
- konvertere til 32-bit (billede-Type-32 bit)
- Beregn median (billede-Stack-Zproject-Median)
- trække median fra resten af stakken ( Process-ImageCalculator-Subtract)
- tælle antallet af synlige luftige ringe og i fokus celler manuelt. I ImageJ, dette gøres ved at pege på objekter med værktøjet punkt.
- Hver serie af hologrammer vil blive ledsaget af et tidsstempel fil (registreres på hologrammet retserhvervelsestidspunktet). Brug tidsstempel fil til at beregne den samlede prøve pumpes dengang billedet blev taget til fange.
- Beregne medianen pixelværdi for en tidsserie af hologrammer og derefter fratrække denne median værdi fra hver respektive pixel at fjerne stationære artefakter i hologrammet. Dette kan gøres i ImageJ ved at udføre følgende trin:
- Celle massefylden beregnes ved at dividere det samlede antal celler opdaget af det samlede volumen af prøven afbildet. Gennemsnitlig 5-10 rammer for nøjagtig statistik.
5. Billede genopbygning til Amplitude og fase
- Vælg repræsentative videoer med 10-200 celler pr. ramme. Indlæse rå (ikke median-trækkes) hologrammer i genopbygningen software (eksempler: ImageJ numeriske formering 39; SHAMPOO [GitHub]).
- Bruger ImageJ, gå til OD-numerisk formering-numerisk diffraktion.
- Ved prompten, tegne en Fourier maske for at vælge real eller virtuelt billede og fjerne enhver sinusformet støj funktioner.
- Genopbygge amplitude og fase ved passende z-trin ved at indtaste genopbygning afstanden.
- Median fratræk amplitude data til at reducere støj som 4.1.1.
- Plot data som en 3D-terning eller projektion. Gå til Plugins — volumen Viewer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne bør angive evne til at detektere levende og døde bakterier på et meget lavt niveau af DHM. Antallet af bakterier tælles bør stemme overens med resultaterne opnået ved hjælp af Petroff-Hauser tælle kammer og plade tæller. Standard statistiske metoder give oplysninger om nøjagtigheden af de forskellige registreringsmetoder ved forskellige bakterielle koncentrationer.
Figur 1 viser Petroff-Hausser tælle mødesalen er anvendt og mikrostruktur af tælle salen, der anvendes i den direkte tælling af celler. Figur 2A viser en typisk beriget kultur plade, der har fået tilstrækkelig tid til S. marcescens til grow kolonier (16 timer ved stuetemperatur). Figur 2B viser vækstkurver for alle stammer, der er brugt. Mens de nøjagtige Spektrofotometer målinger varierer, bør forholdet mellem OD600 og koloni tæller være lineært inden for spektrofotometrets; pålidelige rækkevidde Vi målte ~ OD600 = 0,1 som ~ 108/mL. Den direkte Petroff-Hausser tæller og koloni tæller bør tiltræde inden for 10% indtil cellerne begynder at dø som set af omsætningen i vækstkurven.
Figur 3 viser udformningen af de brugerdefinerede udsnit kamre. Brugerdefinerede mikrofluid kamre blev anvendt til dette eksperiment for at tillade den kontinuerlige strøm af prøven gennem synsfelt holografisk mikroskop. Standard mikrofluid teknikker og materialer blev brugt i opbygningen af prøven kamre. Stump spids rustfrit stål nåle med mandlige Luer-Lok fittings blev indsat i enheden mikrofluid at give indsugnings- og udstødningsporte at prøve salen. Mikrofluid kanal geometri blev etableret af den bløde litografi af Polydimethylsiloxan (PDMS) ved hjælp af en fræset aluminium master mold, som blev komprimeret via Aluminiumsrammer, mellem to optiske kvalitet glasvinduer. PDMS etablerer flow kanal geometrier samt sikrer kanyler, som giver væske transport til og fra flow-kanaler. Disse prøve kamre bruge PDMS udelukkende at etablere flow kanal geometri og dermed indeholder ingen PDMS i den optiske bane af instrumentet. Bemærk at på grund af en off-axis holografisk mikroskop optisk karakter to mikro-kanaler blev støbt parallelt med hinanden i prøve salen. Hensigten er at matche transmissionslængde længder mellem begge arme af interferometer (benævnt 'modellen' og 'reference' våben). Reference-kanal bør kun indeholde sterile medier, og bør ikke være underlagt flow.
Figur 4 viser en skematisk og billeder af den digitale holografiske mikroskop i laboratoriet gennemførelsen. Det drives af softwaren, der leveres med kameraet. Figur 5 viser repræsentative DHM data for bakteriel optællinger og deres korrespondance med forventet antal celler pr. synsfelt. Fra rå hologrammer, uden genopbygning, er det muligt at se og tælle cellerne af median subtraktion og manuel sporing. Dette reducerer den beregningsmæssige byrde i forhold til at genopbygge alle z-fly, som rå hologrammer Vis celler i hele dybden af salen. Udseendet af kulturer på forskellige koncentrationer og deres korrespondance med kimtal og Petroff-Hauser count er angivet. Cellen Total tæller bestemmes af antallet af celler ses i hver prøve volumen over det samlede antal bind afbildet i gennemsnit. Påvisningsgrænsen bestemmes af det samlede antal prøve diskenheder afbildet. I dette eksperiment sat vi en maksimumgrænse på denne værdi, med en maksimal samlet af 10 mL af prøven afbildet i 0,25 µL intervaller (i alt 40.000 billeder pr. sample). Optagelserne er stoppet før den maksimale samlede mængde opnås hvis celler er tydeligt observeres i hver ramme over en række af 20 frames. I en tidligere papir rapporterede vi en formel for estimering af antallet af prøven diskenheder kræves for at påvise bakterier på et 50% konfidensniveau i koncentrationer fra 1-105 celler/mL (tabel 1). Baseret på dette skøn, en undersøgelse af alle 40.000 rammer bør give mulighed for påvisning af celler på 1/mL, selvom denne beregning er meget beregningskrævende.
Figur 6 viser brugen af genopbygning software (Fiji)39. En enkelt hologrammet er åbnet og softwaren "OD-numerisk formering-numerisk diffraktion" køres. Imaging parametrene er angivet i dialogboksen. amplitude, intensitet og fase kan alle blive rekonstrueret. En enkelt z flyet kan vælges, eller batch rekonstruktioner kan bruges til at rekonstruere hele dybden.
Figur 7 viser rekonstruktioner af amplitude og fase billeder på forskellige dybder i stikprøver. Fourier maske brugt til at generere rekonstruktioner er vist, sammen med en median-trækkes intensitet billede, en fase billede, en maksimal projektion gennem fase stack og en volumen projektion af intensitet stakken.
Figur 1: direkte optælling af bakterieceller. Bakteriel koncentration i celler/mL beregnes ved at tælle antallet af bakterier i tælle kammer og skalering dette tal tegner sig for, at Petroff-Hauser kammer kun indeholder 20 nL af prøven. (A) den Petroff-Hausser tælle kammer. (B) billede af tælle kammer mikrostruktur under 10 X fasekontrast, viser bokse i forskellige størrelser nyttigt for optælling af celler i forskellige størrelser. (C) udseende af S. marcescens inden for tælle kammer mindste boksene. 40 x fasekontrast. (D) metode til optælling der udelukker celler falder på de øvre og højre kanter (N), men ikke lavere og venstre kanter (Y). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: tælle celler ved kolonien vækst og ekstinktionen. (A) S. marcescens inkuberes ved stuetemperatur i 16 timer. På den korrekte fortynding skal kultur pladerhar 20-200 kolonier til præcis optælling og statistik. Pladen vist er lidt for overfyldt til pålidelige optælling. (B) vækst kurver for de 3 stammer anvendes. En optisk tæthed på 0,1 svarer til ~ 108 celler/mL, men eksakte værdier varierer efter instrument. Direkte Petroff-Hauser tæller enig med plade tæller til under 10% inden for den lineære vækst. Fejllinjer udgør standardafvigelse på 5 uafhængige prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: prøve kammer design. (A) mikrofluid skematisk (modellen og reference microchannels mærket). (B) færdigsamlet prøve kammer. (C) eksploderede CAD Se viser gerningsindholdet i prøve salen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skematisk og billeder af den digitale holografiske mikroskop. (A) skematisk viser fire hovedelementer: kilden, prøven (modellen sti er mærket Spec. og reference sti er mærket Ref.), mikroskop, og sensoren. (B) fast model af hardware. Fiber-fed kilde forsamling er i bunden, og billedbehandling kameraet er på toppen. Mikroskop optik – består af de to asfærisk linser og relæ linse – er indeholdt i 300 mm lange linse rør. Den tre-akse fase mellem kilden mikroskop optik giver nem manuel manipulation af prøven under undersøgelsen. (C) fotografi af instrument i laboratoriet. Skalalinjen i den nederste del af billedet repræsenterer 1 tomme. Skemaer er igen trukket fra Wallace et al. 34. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: vækstkurver og repræsentative DHM data. (A) Predicted celler pr. synsfelt, baseret på en stikprøve volumen af 365 µm x 365 µm x 1 mm. Den optimale interval for DHM optælling er vist i rektanglet, og virkelige prøver er angivet som (B) og (C). (B) DHM hologram forestillende en Shewanella kultur på 8 x 105 celler/mL målt ved Petroff-Hauser og 7,7 x 105 celler/mL målt af kimtal; Dette billede viser 110 celler, en fremragende pasform til forudsigelse. (C) DHM hologram forestillende en Shewanella kultur på 2,0 ±0.1 x 105 celler/mL målt ved Petroff-Hauser og 2,0 ±0.3 x 105 celler/mL målt af kimtal; Dette billede viser 27 celler. Skalalinjen = 35 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: udføre rekonstruktioner. (A) åbne et hologram i Fiji. (B) køre numeriske formeringsmateriale og indtaste den bølgelængde og billede størrelse. Vælge z afstand tæt på 0 for at starte. (C) tegne en Fourier maske når bedt om at vælge det virkeligt eller virtuelt billede. (D) bad behandling giver mulighed for rekonstruktioner hele diskenheden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: udseendet af rekonstruktioner. Billeder af Serratia kultur på ~ 106 celler/mL. (A) rå hologram. (B) Fourier transform. Området inde i cirklen er området, der skal anvendes; resten er maskeret. (C) Amplitude genopbygning på et enkelt z-plan. (D) fase genopbygning på et enkelt z-plan; skalalinjen viser faseskift i grader. (E) maksimal intensitet projektion gennem alle z-fly i fase stakken. (F) volumen Se af fuld amplitude stack (365 x 365 x 800 µm). Skalalinjen = 35 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Koncentration [celler pr. mL] | Frames behov |
| 1.00E + 00 | 6,686 |
| 1.00E + 01 | 669 |
| 1.00E + 02 | 67 |
| 1.00E + 03 | 7 |
| 1.00E + 04 | 1 |
| 1.00E + 05 | 1 |
Tabel 1: Minimum antallet af påkrævede prøve diskenheder til at påvise bakterier af DHM (påvisning tillid på 50%).
| Ejendom | Værdi | Enhed |
| Opererer bølgelængde | 405 | nm |
| Objektive numerisk blænde | 0,3 | - |
| System forstørrelse | 20 | - |
| Lateral opløsning | 0,7 | Μm |
| Prøven Imaging volumen | 360 x 360 x 800 | Μm x μm x μm |
| Instrument længde | 400 | mm |
Tabel 2: Optisk og ydeevne specifikationer for den digitale holografiske mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Numeriske genopbygning af hologrammer: numeriske genopbygningen af hologrammer, metoden kantede spektrum (ASM) bruges. Dette indebærer foldning af hologram med den grønne funktion for DHM. Den komplekse wavefront af billedet i et bestemt brændplanet kan beregnes ved at ansætte Fourier foldning sætning som følger:
(1)
Hvor 
er operatoren Fourier Transform 
er matrixen hologram og 
er den grønne funktion af DHM, der defineres som:
(2)
Hvor 
er afstanden, langs den optiske akse, det ønskede brændplanet skal genopbygges, 
er belysning bølgelængde, 
og 
er antallet af pixels i x og y retninger, henholdsvis, og 
og 
er pixel størrelser (på detektor flyet) i x og y retninger, henholdsvis40.
Fra den komplekse bølge front, intensiteten kan beregnes af den størrelsesorden firkant af 
, og fasen kan opnås ved arcus tangens af kvotienten mellem den imaginære og reel del af .
Ændringer og fejlfinding
Eksperimenter, der involverer tælling af sparsomme bakteriel koncentrationer er meget modtagelige for forurening, falske positiver og falske negativer. For denne grund, vækst og tælling af bakterier, er samt forberedelse af stærkt fortyndede prøver til DHM kritisk trin i dette eksperiment. Forsigtighed skal træffes for at undgå forurening i dette eksperiment ved omhyggeligt at kontrollere det miljø, hvor bakterier er vokset og optalt. Ordentlig sterilisation teknikker, herunder autoklavering, hjælpe med at forhindre mod forurening samt falske positiver. For at forhindre yderligere mod falske positiver, blev bakterier udvalgt til dette eksperiment, der udviser relativt unikke karakteristika (f.eks. S. marcescens har en meget tydelig rød farve når kulturperler). For at forebygge mod falske negativer, blev bakterier valgt til dette eksperiment udvalgt således, at de ville være i stand til at vokse på beriget kultur plader, samt har karakteristiske figurer og/eller motilitet mønstre kan identificeres via DHM. Det er vigtigt at periodisk test for forurening og/eller uventede cellevækst ved plettering prøverne og kvantificere bakterier af kimtal.
Om at gennemføre dette eksperiment, forventes en datastørrelse på ca 2,4 GB per 1 mL af prøven. Dette nummer er naturligvis afhængig af kamera og fil format anvendes. Datastørrelsen rapporteret er ved brug af en 4 Mpx detektor og en standard TIFF-filformat. Efterbehandling af data kræver ca 6 min beregning pr. 1 mL af prøven. Denne behandling gang blev observeret mens du bruger en Intel i7 8-core processor på 3,5 GHz og 32 GB RAM. Disse beregninger kan parallelized til GPU, for stærkt reduceret sagsbehandlingstider, men var ikke gjort her.
Begrænsninger af teknikken
Mens det er muligt at bruge DHM til at opdage meget lave koncentrationer af bakterier, er denne metode ikke-specifikke. Morfologi alene er ikke et afgørende middel til at identificere bakteriestammer. Diagnostiske programmer vil fremlægge specifikke udfordringer på grund af tilstedeværelsen af ikke-målarter celler og aggregater. Fordelen ved dual-beam instrument præsenteres her er imidlertid, at det er i stand til billede bakterier i relativt uklare prøver. Evnen til at påvise bakterier i kliniske prøver og graden af forbehandling af prøver, der kræves, fortsat skal bestemmes.
Kritiske trin i protokollen
Trin 2: At opnå nøjagtig fortyndinger er afgørende for kvantitativ optælling. Enhver fortyndinger gjort bør være bakkes op af kimtal. Trin 3: valg af strømningshastigheden og tilsvarende ramme skal gøres omhyggeligt at sikre, at alle celler er set. Justering af pumpeparametre bør omhyggeligt afstemt før du udfører en grænse på opdagelse eksperiment. Trin 4: For meget lave bakteriel koncentrationer, er det afgørende at fange nok data for at være sikker på opdagelse. Det kan være nødvendigt at rekonstruere nogle data for at være sikker på, at celler og ikke snavs, er at blive set. I ekstreme tilfælde, kan mere end 10 mL af opløsning være påkrævet. Non-motile stammer er mere tilbøjelige til at være tvetydig end motile stammer. Trin 5: Hvis der er nogen tvetydighed i dataene, genopbygningen kan hjælpe med at demonstrere at hologrammer repræsentere celler og ikke snavs. Høj opløsning rekonstruktioner vil vise klassiske celle morfologier, og motilitet kan tydeligt ses i spor af motile stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Gordon og Betty Moore Foundation tilskud 4037 og 4038 til California Institute of Technology for finansiering af dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
- Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
- Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
- Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
- Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
- Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
- Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
- Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
- Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
- Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
- McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
- Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
- Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
- Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
- Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
- Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
- Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
- Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
- Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
- Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
- Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
- Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
- Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
- Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
- Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
- Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
- Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
- Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
- Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).
