Summary
Dijital holografik mikroskobu (DHM) görüntüleme örnekleri 50-100 X daha aydınlık alan mikroskobu karşılaştırılabilir çözünürlükte odaklanarak daha kalın gerçekleştirilen son işlem sağlar hacimsel bir tekniktir. Burada DHM tanımlamak için sayma, kullanılır ve mikroorganizmalar, çok izleme yoğunluğu düşük ve optik yoğunluk ölçümleri, plaka sayısı ve doğrudan sayısı ile karşılaştırıldığında.
Abstract
Doğru tespit ve seyrek bakteriyel örnekleri sayma yiyecek, içecek ve ilaç işleme sanayi, birçok uygulamada tıbbi teşhis ve diğer gezegen ve uyduları güneş sisteminin robot görev tarafından hayatı algılama için vardır. Şu anda, seyrek bakteriyel örnekleri kültür kaplama veya epifluorescence mikroskobu tarafından dikkate alınır. Kültür plakaları gerektiren uzun kuluçka çarpı (gün hafta) ve epifluorescence mikroskobu geniş boyama ve örnek konsantrasyon gerektirir. Burada, eksen dışı dijital holografik mikroskobu (DHM) çok seyreltik kültürler (100-104 hücre/mL) bakterilerde numaralandırmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. İlk olarak, özel DHM inşası, bir düşük maliyetli araç oluşturma hakkında ayrıntılı yönergeler ile birlikte ele alınmıştır. Holografi prensipleri ele alınmıştır ve istatistiksel bir modelini ne kadar videoları gerekir tahmin etmek için kullanılan araç optik performans özellikleri ve bakteriyel çözüm (Tablo 2) konsantrasyonu dayalı hücreleri, algılamak için olmak . Hücreleri video algılama 10,5, 104, 103ve 100 hücre/mL un restore edilmiş hologram kullanarak gerçek zamanlı olarak gösterdi. Genlik ve faz görüntüleri yeniden inşası bir açık kaynak yazılım paketi kullanarak gösterilmiştir.
Introduction
Birçok uygulamada doğru bakteri sayıları çok seyreltik örneklerinde belirlenmesi önemlidir: birkaç örnektir: su ve gıda kalite analiz1,2,3; Kan, beyin omurilik sıvısı veya balgam4,5patojenler tespiti; eczacılık ürünleri, steril su6dahil olmak üzere üretim; ve çevre toplum analiz açık okyanus ve çökeller7,8,gibi9oligotrofik ortamlarda. Orada da mümkün kaybolmamış mikrobiyal yaşam Jüpiter ve Satürn, özellikle Europa10,11 ve Enceladus12,13, buzlu aylar tespiti ilgi artmaktadır 14, hangi yeraltı Sıvı okyanuslar var bilinmektedir. 1978 yılında Viking beri görev başka bir gezegende kaybolmamış hayat bulmaya çalıştı çünkü teknolojileri ve bakteriyel kimlik ve alan misyonlar15sırasında sayım için aygıtlar sınırlı gelişme oldu.
Plaka sayısı geleneksel yöntemlerle bulmak bir azınlık çevre suşları, türlerin bazen temsil edebilir yalnızca culturable hücreleri < %116. Plakalar zorlanma bağlı olarak en fazla başarı için günlerce ya da haftalarca, kuluçka gerektirir. Epifluorescence mikroskobu büyük ölçüde hızlı ve doğru mikrobiyal numaralandırma için altın standart olarak plaka sayar yerini aldı. Nükleik asitler için bağlama nükleik asit etiketleme floresan boyalar ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), SYBR yeşil veya akridin turuncu gibi kullanılan tipik boyalar17,18,19 vardır , birçok çalışma kullanın rağmen20,21,22,23,24Gram floresan göstergeleri imzalamak. Bu yöntemleri öncesi konsantrasyonu adımları olmadan kullanarak algılama (LoDs) sınırlarını ~ 105 hücre mL başına yol açar. LoD gelişmeler filtrasyon kullanarak mümkündür. Vakum filtre-bir membran, genellikle polikarbonat ve siyah arka plan azaltmak için ideal bir sıvı örneğidir. Yukarıda belirtilen DNA lekeleri doğrudan filtre25için uygulanabilir gibi düşük-arka plan boya. Doğru göz tarafından saymak, ~ 105 hücre başına örnekleri ~ 10 mL başına5 hücre daha seyreltik Yani filtresi, gerekli olan, önemli örnek birimleri toplanan ve filtre. Lazer tarama aygıtları sistematik filtresi bütün bölgeleri keşfetmek ve böylece hücre sayım için ~ 10 mL26başına2 hücre aşağı algılama sınırlarını zorlayan gerekli sayısını azaltmak için geliştirilmiştir. Ancak, bunlar çoğu laboratuvarlarda kullanılamaz ve bakteri ve enkaz değil gelişmiş donanım hem de yazılım parçacıklar gözlenen uzman onayı izin vardır gerektirir.
Başvuru için kan zehirlenmesi olan yetişkinler genellikle belirtiler, gösterilen başlar < 100 hücre/mL kan ve bebekler de < 10 hücre/mL. Bir yetişkin gelen kan alımı 10 mL, alır ve bir bebek, 1 mL. PCR temelli yöntemleri varlığı ile insan ve patojenik olmayan flora DNA ve kan27,28PCR inhibe bileşenlerinde tarafından inhibe. Ortaya çıkan teknikleri çeşitli rağmen kültürler kan dolaşımına enfeksiyonlar, özellikle içinde daha kırsal alanlarda ya da gelişmekte olan ülkelerden tanısında altın standart kalır. Diğer gezegenlerde hayat tespiti için termodinamik hesaplamalar hayat ve böylece beklenen olası Biyokütle enerji bütçesini tahmin edebilirsiniz. 1 - 100 hücre/mL Europa29tarihinde thermodynamically makul olması bekleniyor. O kolayca bu sayılardaki miktarda sulu çözüm hücrelerin çok küçük sayılar tespiti önemli bir çözülmemiş sorun olduğunu görülebilir.
Bu yazıda, biz 10 konsantrasyonlarda Serratia marcescens ve Shewanella Corynebacterium (vahşi tipi ve hareketli mutant) algılama göstermek5, 104, 103ve bir eksen dışı kullanarak 100 hücre/mL Dijital holografik mikroskop (DHM). Anahtar DHM geleneksel ışık mikroskobu üzerinde kalın numune hacmi yüksek çözünürlükte eşzamanlı görüntüleme avantajdır — bu uygulamasında örnek odası 0.8 mm kalınlığında oldu. Bu örnek odaları tolerans ± 50 µm ile yumuşak litografi, polydimethylsiloxane (PDMS) bir hassas işlenmiş alüminyum kalıp üzerinden tarafından inşa edildi. Bu yüksek güçlü ışık mikroskobu alan derinliği yaklaşık 100-fold bir iyileşme gösterir. DHM optik yol uzunluğu (Ürün kalınlığı ve Kırılma indisi) ölçülerini izin nicel faz bilgi de sağlar. DHM ve benzer teknikler bakteri ve Maya hücre döngüsü ve bakteriyel kuru kitle30,31,32hesaplanması izlemek için kullanılmıştır; saçılma farklılıklar bile bakteri suşları33ayırt etmek için kullanılır.
Kullandığımız enstrüman özel olarak daha önce yayımlanmış34,35, mikroorganizmalar ile kullanmak için özel olarak oluşturulmuş ve onun tasarım ve inşaat gösterdi ve tartışıldı. Sulu çözümler sürekli bir 0,25 µL birim örnek odasına şırınga pompa ile sağlanır; akış hızı tüm numune hacmi görüntüleme sağlamak için kamera kare hızı tarafından belirlenir. İstatistiksel bir hesaplama hücreleri belirli bir konsantrasyon, önemli sayıda algılamak için yansıma gerekir örnek birim sayısı öngörür.
Hücre algılama uygulamaları için hologram yeniden inşası genlik ve faz görüntüler içine gerekli değildi; analiz ham hologram üzerinde gerçekleştirildi. Bu önemli miktarda Hesaplamalı kaynak ve disk alanı kazandırır: 500 Mb hologram video 1-2 ne zaman yeniden Tb olacak. Ancak, biz yeniden inşası ile derinlik hologram istenen tür temsil onaylamak için örnek tartışıyorlar. Bir önemli DHM yoğunluğu ve faz görüntüleri izlemek için onun yetenek özelliğidir. Yoğunluk (gibi birçok biyolojik hücreleri) neredeyse şeffaf organizmalar açıkça aşamasında görünür. Etiket içermeyen bir teknik olduğu gibi hiçbir boyalar kullanılır. Bu bir birdvantage boyalar bir görev şartları sağ çıkamayız beri mümkün uzay uçuşu uygulamalar için ve — daha da önemlisi — DNA veya RNA kodlamak için kullanamazsınız dünya dışı canlılar ile çalışmak için kabul edilemez. Da Arktik ve Antarktika, nerede boyalar uzak konuma getirmek zor olabilir ve depolama düşebilir gibi aşırı ortamlarda çalışmak için bir avantajdır. Görüntüleri yeniden inşası aşamasında ve genlik üzerinde GitHub (şampuan) kullanılabilmesini sağladığınız bir açık kaynak yazılım paketi veya ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. büyüme ve bakteri numaralandırma
Not: Bu içinde uygun orta 36 büyüdü neredeyse herhangi bir bakteriyel zorlanma için geçerlidir. Bizim örneğimizde, biz üç suş kullanın: Serratia marcescens olarak bir ortak, kolay tanımlanabilir laboratuvar yük; ve daha küçük, son derece hareketli çevre zorlanma, Shewanella Corynebacterium Bay-1. Hafiye-in karşılaştırmak için hareketli hareketli olmayan hücreleri, hareketli Shewanella mutant, Δ vs. FlgM, ayrıca kullanılan karşılaştırma 37 için. Tüm suşların lysogeny suyu (LB) yetiştirilmektedir.
- Hazırla steril LB orta (distile su litre başına: 10 g bacto tryptone, 5 gr bacto Maya, 10 g NaCl; filtre veya basınçlı kap). Standart 100 mm çap LB-Ağar kaplamalar (aynı tarifi orta artı 15 g agar litre başına olarak; otoklav (121 ° C, 20 dk) sterilize ve soğuyunca yeterince işlemek için dökmek) hazırlayın. Buzdolabında saklamak orta ve plakalar.
- Bir gün önce deney tohum 5-6 mL " Master " doğru steril ve Biyogüvenlik tekniği kullanarak bir taze bakteriyel koloni kültür ortamından. ~ 12 h. kuluçka süresi zorlanma ve büyüme oranına bağlı olacaktır için bir shaker (120 rpm) 30 ° c üzerinde kuluçkaya. Bizim deneylerde Shewanella suşları için 12 saat inkübe; Ancak, Serratia kültür orta-Logaritmik büyüme sergileyen emin olmak için 8 saat sonra hasat edilir.
- Deneme, gün al bakteriyel spektrofotometrik okuma (OD 600) ana kültür, 0,6-0,7 aralığında olacağı tahmin edilmektedir. (Önceden belirlendiği gibi) Logaritmik büyüme aşamasında olması gerektiği. Değil, alt kültür 100 µL Eğer içine 5 mL orta ve orta log fazı hücre büyümesine izin.
- Ustanın bir örnek almak kültür ve doğrudan bir Petroff-Hausser sayma kullanarak Oda hücreleri saymak. Bu canlı ve ölü hücreleri Numaralandırılacak.
- Bir micropipette ve transfer odası içine su katılmamış kültür 10 µL örneği ayıklamak.
- Görüntü mikroskopla yüksek kuru objektif (40 X ya da 63 X, NA 0,7 - 0,8) faz kontrast kullanarak.
- Saymak en az 20 kareler ve ortalama bakteri.
Not: tamamen bir kare ve yalnızca çaprazlanarak üst ve sol sınırları (veya alt ve eğer sen tercih etmek değil, içinde) olan bakteri say. Kareler birkaç çizgilerle ayrılır, bir sınır olarak seçin.
Seyreltme faktörü x - Hesapla konsantrasyon ortalama olarak 20 kareler. Sayıları de konsantrasyonları için işe yaramazsa doğrudan Not < 10 7 / mL.
- Seri dilutions koloni oluşturan sayımı için kültür yapmak birimleri (CFU). Bu yalnızca canlı hücreleri Numaralandırılacak.
- Yapmak bir seri seyreltme her seçili bakteriyel örnekleri steril % 0,9 serum fizyolojik ile çözüm. Bakteriyel çözüm 20 µL aktarmak ve 180 µL serum sulandırmak. En düşük konsantrasyon ~ 10 3 hücre/mL gelene kadar bunu tekrarlayın.
- Al 100 µL en az iki dilutions önerilen 10 vardır 3 ve 10 4 /mL — ve plaka bir uygun sağlam medya plaka üzerinde. Steril bir ayırıcı ile yayıldı. Her seyreltme en az 3 çoğaltır gerçekleştirmek.
- , Bakteriler için uygun bir sıcaklıkta gecede veya koloniler büyümek kadar kuluçkaya.
- Saymak kolonileri ve birimleri (CFU) (# kolonileri seyreltme faktörü x) göre oluşturan colony hesaplamak / birim kaplama CFU/mL =. Ortalama CFU çoğaltır.
2. Son derece seyreltik örnekleri hazırlanması DHM için
- olun seri dilutions ustanın kültür DHM ve post-DHM saymak için koloni oluşturan birimler LB medya plakaları (bakınız 1.4.1 - 1.4.4). Kayıtları yapan kişinin konsantrasyon ölçülen her örnek habersiz olması bu çift-kör gerçekleştirmek.
- Seyreltik bakteri 10-15 mL (hangisi uygunsa) hareketliliği teşvik ama hücre bölünmesi, inhibe bir en az orta böylece hücre konsantrasyonu kayda değer deneme sırasında değişmez. Bu % 0,9 serum ya da daha özel bir hareketliliği ortam olabilir. Örneğin, Escherichia coli kullanıyorsanız, motilite orta EDTA 38 içermesi gerekir. Bu örnekler için % 0,9 serum fizyolojik kullanıyoruz.
3. DHM videoları kayıt
- steril bir Ģırınga kullanarak, Çek faiz seyreltme yaklaşık 10 mL.
- Bağlanmak şırınga steril bağlantı parçaları kullanarak ve boru DHM örnek odası için.
Not: Örnek enstrümanın optik yolundan tutarlı akışının izin için ısmarlama mikrosıvısal odası inşa edilmiştir. Daha fazla ayrıntı için sonuçlar bölümüne bakın. Deney öncesinde örnek odasının tüm bileşenleri tarafından ısıyla sterilize. - Akışı sürekli olarak bir şırınga pompa kullanarak örnek odası aracılığıyla şırıngadan örnek.
Not: Uygun akış oranları sıvı kanal boyutları, istenen işlem hacmi gibi veri alma sınırlamaları bağlı olarak değişir.
Örnek örnek odası akan gibi - hologram bir uygun kare hızında arka arkaya alın. Bir zaman damgası dosya daha sonra veri analizi (iletişim kuralı Bölüm 4) sırasında kullanılacak zaman her görüntünün hangi günlükleri yakalama oluşturulur. Ortam sıcaklığı (23 ° C), tüm hologramlar edinin. Kayıt hologramlar kamera üreticisi tarafından sağlanan önceden yazılı C++ yürütülebilir dosyayı yürüterek.
Not: Seçilen akış hızı bağlı olarak uygun kare hızları değişir. Bu deneme için bu bir bakteri görüntüsü şekilde bir kare hızı kullanmak için tavsiye edilir > 2 kez alet seyahat gibi ' s alan bakış. - Yeterli zaman tanımak için örnek DHM akan tüm 10 mL.
- Bakteri değil büyüyor veya deneyler sırasında ölen aşılamak sağlamak için medya plakaları 100 µL harcanan medya mesaj-DHM görüntü yakalama ile zenginleştirilmiş. Steril bir ayırıcı ile yayıldı ve uygun sıcaklığında 24 saat boyunca kuluçkaya; saymak kolonileri hediyesi.
4. Hücre yoğunluğu ve algılama sınırları hesaplanması
- ile alınan hologram videoları, bakteri varlığı için veri analiz.
- Zaman Serisi hologram olarak medyan piksel değeri hesaplamak sonra sabit hologram aktarımında ortadan kaldırmak için ilgili her pikseli medyan bu değerden çıkarmak. Bu ImageJ içinde aşağıdaki adımları uygulayarak yapılabilir:
- (resim-türü-32 bit) 32-gem-e dönüştürmek
- Calculate medyan (resim-yığın-Zproject-medyan)
- yığını (geri kalan orta çıkarma Process-ImageCalculator-Subtract)
- görünür havadar halkalar ve odaktaki hücreleri sayar el ile. ImageJ içinde bu noktaya aracıyla nesne gelerek yapılır.
- Hologramlar her dizi (hologram edinme anda kayıtlı) bir zaman damgası dosyası tarafından eşlik edecek. Kullanım örnek toplam miktarı pompalanır zaman görüntü hesaplamak için zaman damgası dosya yakalandı.
- Zaman Serisi hologram olarak medyan piksel değeri hesaplamak sonra sabit hologram aktarımında ortadan kaldırmak için ilgili her pikseli medyan bu değerden çıkarmak. Bu ImageJ içinde aşağıdaki adımları uygulayarak yapılabilir:
- Hücre hacmi yansıma örnek tarafından algılanan toplam sayısı bölünmesi ile hücre yoğunluğu hesaplamak. Doğru istatistikler için 5-10 kare ortalama.
5. Görüntü yeniden yapılmasına genlik ve faz
- Seç temsilcisi video çerçeve başına 10-200 hücreleri ile. Ham hologramlar (değil medyan düşülen) imar yazılım yük (örnekler: ImageJ sayısal yayma 39; ŞAMPUAN [GitHub]).
- Kullanarak ImageJ, OD sayısal yayma sayısal kırınım gidin.
- İsteminde gerçek veya sanal görüntü seçin ve herhangi bir sinüsoidal gürültü özellikleri ortadan kaldırmak bir Fourier maske çizim yapın.
- Yeniden genlik ve uygun z-adımları aşamasında yeniden yapılanma mesafe girerek.
- Ortanca 4.1.1 olduğu gibi gürültüyü azaltmak için genlik veri çıkarma.
- Çizim verisini bir 3D olarak küp veya yansıtıcı. Eklentileri gidin — Volume Viewer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonuçları canlı ve ölü bakteriler DHM tarafından çok düşük seviyelerde algılama yeteneğini gösterir. Sayılan bakteri sayısı Petroff-Hauser sayım odası ve plaka sayıları kullanarak elde edilen sonuçlar ile tutarlı olması gerekir. Standart istatistiksel yöntemler farklı algılama yöntemleri çeşitli bakteri konsantrasyonlarda doğruluğu hakkında bilgi sağlar.
Şekil 1 Petroff-Hausser sayım odası Mikroyapı hücreleri doğrudan numaralandırmasında kullanılan Sayım odasının yanı sıra kullanılan gösterir. Şekil 2A gösterir yeterli izin bir tipik zenginleştirilmiş kültür plaka koloniler (16 saat oda sıcaklığında) büyümeye S. marcescens süre. Şekil 2B kullanılan tüm suşları için büyüme eğrileri gösterir. Tam Spektrofotometre ölçümleri değişir, OD600 ve koloni sayısı arasındaki ilişki Spektrofotometre güvenilir aralığında doğrusal olmalıdır; şiddetindeydi ~ OD600 ~ 108/mL = 0.1. Doğrudan Petroff Hausser sayar ve koloni sayıları %10 kadar hücreleri içinde devir oranı, büyüme eğrisi tarafından görüldüğü gibi ölmeye başlar katılıyorum.
Şekil 3 özel örnek chambers tasarımı göstermektedir. Özel mikrosıvısal chambers bu deneme için örnek holografik mikroskop görüş alanı aracılığıyla sürekli akışı sağlamak için kullanılmıştır. Standart mikrosıvısal teknikleri ve malzemeleri örnek odaları yapımında kullanılmıştır. Künt uçlu paslanmaz çelik iğneler erkek radarı-Lok bağlantı parçaları ile örnek odasına giriş ve çıkış bağlantı noktaları sağlamak için mikrosıvısal cihazın içine eklenmiş. Mikrosıvısal kanal geometri iki optik kalite cam pencereler arasında alüminyum çerçeve ile sıkıştırılmış olan, bir işlenmiş alüminyum ana kalıp kullanarak polydimethylsiloxane (PDMS) yumuşak litografi tarafından kurulmuştur. PDMS akışı kanal geometrileri kurar yanı sıra Hipodermik iğneler, sıvı taşıma için ve akış kanallardan sağlayan güvenlik altına alır. Bu örnek odaları PDMS sadece ve böylece hiçbir PDMS enstrümanın optik yolundaki içeren akış kanal geometri kurmak için kullanın. Bir eksen dışı holografik mikroskop optik yapısı nedeniyle, iki mikro-kanal kalıplanmış Not örnek odasında birbirlerine paralel. Bu optik yol uzunlukları ('örnek' ve 'başvuru' silah adlandırılır) Girişmölçeri her iki silah arasında maç için tasarlanmıştır. Referans kanal yalnızca steril ortam içermelidir ve akış tabi olmamalıdır.
Şekil 4 bir şematik ve dijital holografik mikroskop görüntülerini onun laboratuvar uygulaması gösterir. Bu fotoğraf makinesi ile sağlanan yazılım tarafından işletilmektedir. Şekil 5 bakteriyel numaralandırma ve görüş alanı başına hücre öngörülen sayıda onların yazışma için temsilcisi DHM verileri gösterir. Yeniden yapılanma, olmadan ham hologram üzerinden görmek ve medyan çıkarma ve el ile izleme tarafından hücreleri saymak mümkündür. Bu büyük ölçüde ham hologram odası derinliği boyunca hücreleri gösterir gibi tüm z-uçaklar, yeniden yapılandırma için karşılaştırıldığında Hesaplamalı yükünü azaltır. Kültürler farklı konsantrasyonları ve onların yazışma plaka sayısı ve Petroff-Hauser sayısı ile görünümünü belirtilir. Toplam hücre sayısı her numune hacmi görüntüsü birimlerin toplam sayısı üzerinden görmüş hücreleri Sayı ortalaması alınarak belirlenir. Algılama sınırı yansıma örnek birimlerin toplam sayısı tarafından belirlenir. Bu deneyde, bu değer, en fazla 10 mL 0,25 µL artışlarla (örnek başına 40.000 görüntülerin toplam) yansıma örnek üzerinde bir üst sınır koymak. Eğer hücre açıkça her çerçevede 20 kare bir dizi üzerinde gözlenen en fazla toplam hacim elde edilir önce kayıtları durdurulur. Bir önceki yazıda, 1-105 hücre/mL (Tablo 1) değişen konsantrasyonlarda % 50 güven düzeyinde bakteri tespit etmek için gerekli örnek birim sayısı tahmin etmek için bir formül bildirdi. Bu hesaplama yoğun hesaplama olmasına rağmen bu tahmini bağlı olarak, tüm 40.000 çerçeveleri incelenmesi 1/mL, hücreleri algılanması için izin vermelidir.
Şekil 6 imar yazılım (Fiji)39kullanımını göstermektedir. Tek bir hologram açtı ve "OD sayısal yayma sayısal kırınım" yazılımı çalıştırmak. Görüntü parametreleri iletişim kutusunda verilmiştir; genlik, yoğunluk ve faz tüm yeniden. Bir tek z uçak seçmiş olabilirsiniz veya toplu rekonstrüksiyonlar tüm derinlik yeniden oluşturmak için kullanılan.
Şekil 7 rekonstrüksiyonlar genlik ve faz görüntülerin farklı derinliklerde seçili bir örnek gösterir. Fourier maskeyi rekonstrüksiyonlar oluşturmak için kullanılan, bir medyan düşülen yoğunluk görüntüsü, bir faz görüntü, faz yığını üzerinden en fazla bir projeksiyon ve yoğunluk yığını bir ses projeksiyon ile birlikte gösterilir.
Şekil 1: bakteriyel hücreler sayma doğrudan. Hücre/ml bakteri konsantrasyonu bakteriler odası sayma ve bu sayı muhasebe gerçeği Petroff-Hauser odası sadece 20 içerir için ölçekleme toplam sayısı sayılarak hesaplanır nL örneği. (A)Petroff-Hausser odası sayma. Sayma (B) görüntü altında 10 X faz kontrast, Mikroyapı kutularını farklı boyutlarda farklı boyutlarda hücreleri numaralandırma için yararlı gösteren odası. (C) görünümünü S. marcescens sayım odası en küçük kutular içinde; 40 x faz kontrast. Bu sayım için (D) yöntemi üst ve sağ kenarları (N), ama değil alt ve sol kenarları (Y) düşen hücreleri hariç. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: koloni büyüme ve optik yoğunluk tarafından hücre sayım. (A) S. marcescens on altı saat oda sıcaklığında inkübe. Doğru seyreltme kültür plakaları gerekir20-200 colonies doğru sayma ve istatistikleri için var. Gösterilen plaka biraz gibi güvenilir sayım için çok kalabalık. (B) büyüme kullanılan 3 suşları için eğrileri. Bir optik yoğunluk 0.1 ~ 108 hücre/mL için karşılık gelen, ama tam değerleri araç tarafından farklı. Doğrudan Petroff-Hauser sayıları için plaka sayıları %10 doğrusal büyüme Aralık içinde içinde katılıyorum. Hata çubukları 5 bağımsız örnekleri standart sapması temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: örnek odası tasarım. (A)mikrosıvısal şematik (etiketli örnek ve referans mikro). (B) tam olarak oluşturulmuş örnek odası. (C) CAD patladı görüntülemek örnek odası kurucu unsurları gösterilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: şematik ve dijital holografik mikroskop görüntülerini. (A)şematik gösterilen dört ana element: kaynak, örnek (numune yol belirtimi etiketli ve başvuru yolu Ref. etiketli), mikroskop ve sensör. (B) katı modeli donanım. Fiber beslenen kaynak derleme alt kısmında ve görüntüleme kameranın üst kısmında. İki asferik lens ve geçiş mercek – oluşan mikroskop optik-300 mm uzun lens tüp içinde yer alan. Üç eksenli sahne arada kaynak mikroskop optik numune altında eğitim kolay manuel manipülasyon sağlar. (C) fotoğraf Laboratuvarı enstrümanın. Ölçek çubuğu görüntü alt kısmında 1 inç temsil eder. Şemaları Wallace ve ark. yeniden çizilir 34. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: büyüme eğrileri ve temsilcisi DHM veri. (A)öngörülen hücreleri 365 µm x 365 µm örnek hacmi dayalı görüş alanı başına 1 mm x. DHM numaralandırma için optimum menzili dikdörtgende gösterilir ve gerçek örnekleri (B) belirtilir ve (C). Bir Shewanella (B) DHM hologramıdır5 hücre/mL olarak plaka sayısına göre ölçülen 8 x 105 hücre/mL Petroff-Hauser göre ölçülen ve 7,7 x 10 kültür; Bu görüntü 110 hücreleri, tahmin için mükemmel bir uyum gösterir. (C) DHM hologram 2.0 ±0.1 x 105 hücreleri/Petroff-Hauser ve 2.0 ±0.3 x 105 hücreleri/plaka sayısına göre ölçülen mL tarafından ölçülen mL adlı bir Shewanella kültürün; Bu resim 27 hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu 35 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: rekonstrüksiyonlar gerçekleştirme. (A)açık bir hologram Fiji'de. (B) çalıştırmak sayısal yayma ve dalga boyu ve görüntü boyutu girin. Z uzaktan başlatmak için 0 yakın seçin. (C) çizmek gerçek veya sanal görüntü seçmek için istendiğinde bir Fourier maske. (D) banyo işleme sağlar rekonstrüksiyonlar birimin boyunca için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: rekonstrüksiyonlar görünümünü. Serratia kültür ~ 106 hücre/mL, görüntüleri. (A)ham hologram. (B) Fourier dönüşümü. Daire içindeki alan kullanılacak alandır; geri kalan maskelenir. (C) genlik imar adlı tek bir z uçağı. (D) faz imar adlı tek bir z uçağı; Ölçek çubuğu faz kayması derece cinsinden gösterir. (E) maksimum yoğunluk projeksiyon faz yığınındaki tüm z-uçaklar aracılığıyla. (F) birimi görüntüleyin tam genlik yığının (800 µm x 365 x 365). Ölçek çubuğu 35 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Konsantrasyon [mL başına hücre] | Gerekli çerçeveleri |
| 1.00E + 00 | 6,686 |
| 1.00E + 01 | 669 |
| 1.00E + 02 | 67 |
| 1.00E + 03 | 7 |
| 1.00E + 04 | 1 |
| 1.00E + 05 | 1 |
Tablo 1: Bakteriler DHM (algılama güven % 50) tarafından tespit etmek için gerekli örnek birimlerin en az sayı.
| Özelliği | Değer | Birim |
| Dalga boyu işletim | 405 | NM |
| Objektif sayısal diyafram | 0,3 | - |
| Sistem büyütme | 20 | - |
| Yanal çözünürlük | 0,7 | Mikron |
| Örnek görüntüleme birimi | 360 x 360 x 800 | Mikron x μm x μm |
| Araç uzunluğu | 400 | mm |
Tablo 2: Dijital holografik mikroskop görme duyusuyla ilgili ve performans spesifikasyonları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hologram sayısal yeniden inşası: hologram sayısal yeniden inşası için açısal spektrum yöntemi (ASM) kullanılır. Bu hologram DHM için Green fonksiyonu ile evrişim içerir. Belgili tanımlık imge vasıl belirli bir odak düzlem karmaşık wavefront Fourier evrişim teoremi istihdam ederek aşağıdaki gibi hesaplanabilir:
(1)
Nerede 
Fourier dönüşümü operatörü 
hologram Matrix ve 
olarak tanımlanan DHM Green fonksiyonudur:
(2)
Nerede 
optik ekseni, yeniden olabilir için istenen odak düzlem boyunca mesafe 
aydınlatma dalga 
ve 
piksel x vardır ve y yön, sırasıyla, ve 
ve 
(at dedektörü uçak) piksel boyutları vardır x ve y yön,40içinde anılan sıraya göre.
Karmaşık dalga önden, büyüklük, kare yoğunluğu hesaplanabilir 
, ve faz hayali ve gerçek kısımları arasındaki sayının ark tanjantını tarafından elde edilebilir .
Değişiklikler ve sorun giderme
Seyrek bakteriyel konsantrasyonları numaralandırma içeren deneyler kirlenme, yanlış pozitif ve yanlış negatifler için son derece duyarlı. Bu nedenle, büyüme ve bakterilerin numaralandırma için yanı sıra son derece seyreltik örnekleri hazırlanması DHM için kritik bu deneyde adımlardır. DİKKAT bakteri nerede büyüdü ve numaralandırılan çevrenin dikkatli bir şekilde kontrol ederek bu deneyde kirlenmesini önlemek için alınmalıdır. Isıyla, dahil olmak üzere uygun sterilizasyon teknikleri, yanlış pozitif yanı sıra kirlenme karşı önlemeye yardımcı olur. Daha fazla karşı yanlış pozitif durumlar önlemek için bakteri nispeten benzersiz özellikleri (Örneğin, S. marcescens kültürlü bir çok farklı kırmızı renk vardır) sergilemek bu deneme için seçildi. Öyle ki onlar yanı sıra zenginleştirilmiş kültür Tabaklarda büyümek karakteristik şekilleri ve/veya hareketliliği desenleri DHM tespit edilmesi mümkün olacaktır karşı yanlış negatifleri önlemek için bu deneme için seçilen bakteri seçildi. Örnekleri kaplama ve plaka sayısına göre bakteri miktarının kirlenme ve/veya beklenmeyen hücre büyümesi için düzenli aralıklarla test etmek önemlidir.
Bu deney olarak, Örnek 1 mL başına yaklaşık 2,4 GB veri boyutunu bekleniyor. Bu sayı, tabii ki, kullanılan kamera ve dosya biçimi üzerinde bağlıdır. Rapor veri boyutu 4 Mpx dedektörü ve standart bir TIFF dosya biçimi tarafından kullanılır. Post-processing veri kabaca 6 dk 1 mL başına hesaplama örneği gerektirir. Bu işlem süresi 3,5 GHz ve 32 GB RAM Intel i7 8 çekirdekli işlemci kullanırken gözlendi. Bu hesaplamalar için GPU için büyük ölçüde işlem süreleri azaltılmış ama burada bitmedi parallelized.
Teknik sınırlamaları
Çok düşük konsantrasyonlarda bakterilerin algılamaya DHM kullanarak mümkün olmakla birlikte, bu yöntem belirsiz. Morfoloji yalnız bakteri suşları belirlenmesi için kesin bir yol değil. Tanı uygulamaları olmayan hedef hücreleri ve toplamları varlığı nedeniyle belirli zorluklar sunacak. Ancak, burada sunulan çift kiriş enstrüman görüntü bakteri nispeten bulanık örneklerinde mümkün avantajdır. Klinik örnekler ve gereklidir, ön işleme örnekleri derecesini bakteri algılama yeteneğini kalır belirlenecek.
İletişim kuralı kritik adımlar
Adım 2: Doğru dilutions elde etmek için nicel numaralandırma esastır. Yapılan herhangi bir dilutions plaka sayısına göre yedeklenmelidir. Adım 3: akış hızı ve karşılık gelen kare hızı seçimi tüm hücreleri görülür emin olmak için dikkatle yapılmalıdır. Pompa parametreleri ayarlama dikkatle algılama deneme sınırı gerçekleştirmeden önce ayarlanmış. Adım 4: bakteriyel çok düşük konsantrasyonlarda için hafiye-in emin olmak için yeterli veri yakalamak önemlidir. Hücreleri ve enkaz değil, görünmekten emin olmak için bazı verileri yeniden oluşturmak gerekli olabilir. Aşırı durumlarda, birden fazla 10 mL çözüm-ebilmek var olmak gerekli. Sigara hareketli suşları daha hareketli suşları belirsiz olması muhtemeldir. Adım 5: veri herhangi bir belirsizlik varsa imar hologramlar hücreleri ve değil enkaz temsil ettiğini göstermek yardımcı olabilir. Yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonlar klasik hücre türleri Morfoloji gösterecektir ve motilite hareketli suşları parça açıkça görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Gordon ve Betty Moore Vakfı Hibe 4037 ve bu eser finansmanı için California Institute of Technology için 4038 kabul edersiniz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7710 | Many options for purchase |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| 10 cm Petri dishes | VWR | 10053-704 | |
| 15 mL culture tubes | Falcon (Corning Life Sciences) | 352002 | Loose-capped |
| Petroff-Hauser chamber | Electron Microscopy Sciences | 3920 | |
| 10 mL syringes | BD Biosciences | 309604 | Luer-Lok tip not necessary |
| Male Luer to 1/16” barbed fitting | McMaster-Carr | 51525K291 | |
| Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow | Nalgene | 8000-0004 | Sold by length, purchase accordingly |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Sample Chamber | Custom | n/a | See Materials Section |
| Holographic Microscope | Custom | n/a | See Wallace et al. |
| Open-source software | Custom | https://github.com/bmorris3/shampoo |
References
- Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
- Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
- Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
- Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
- Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
- Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
- Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
- Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
- Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
- Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
- Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
- Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
- Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
- McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
- Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
- Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
- Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
- Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
- Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
- Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
- Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
- Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
- Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
- Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
- Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
- Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427 (2014).
- Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
- Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049 (2009).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
- Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
- Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700 (2016).
- Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
- Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
- Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
- Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
- Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85 (2002).
