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Bioengineering

कम सांद्रता पर सूक्ष्मजीवों को बढ़ाता डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोपी (DHM) का उपयोग

Published: November 1, 2017 doi: 10.3791/56343
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1
1Department of Medical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Jet Propulsion Laboratory, California Institute of Technology

Summary

डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोपी (DHM) एक volumetric तकनीक है कि इमेजिंग नमूनों की अनुमति देता है 50-तुलनीय संकल्प पर brightfield माइक्रोस्कोपी से मोटे 100X, के साथ प्रदर्शन के बाद प्रसंस्करण केंद्रित । यहाँ DHM की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है, गिनती, और बहुत कम घनत्व पर सूक्ष्मजीवों ट्रैकिंग और ऑप्टिकल घनत्व माप, प्लेट गिनती, और प्रत्यक्ष गिनती के साथ तुलना में.

Abstract

सही का पता लगाने और गिनती विरल जीवाणु नमूनों भोजन में कई आवेदन किया है, पेय, और दवा प्रसंस्करण उद्योगों, चिकित्सा निदान में, और अन्य ग्रहों और सौर प्रणाली के चंद्रमाओं के लिए रोबोट मिशन द्वारा जीवन का पता लगाने के लिए. वर्तमान में, स्पार्स बैक्टीरियल नमूनों संस्कृति चढ़ाना या epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा गिना रहे हैं । संस्कृति प्लेट लंबी गर्मी समय (सप्ताह के दिनों) की आवश्यकता है, और epifluorescence माइक्रोस्कोपी व्यापक धुंधला और नमूने की एकाग्रता की आवश्यकता है । यहां, हम प्रदर्शन कैसे बंद धुरी डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोप (DHM) का उपयोग करने के लिए बहुत पतला संस्कृतियों में बैक्टीरिया की गणना (100-104 कोशिकाओं/ सबसे पहले, कस्टम DHM के निर्माण पर चर्चा की है, साथ एक कम लागत साधन के निर्माण पर विस्तृत निर्देश के साथ । होलोग्रफ़ी के सिद्धांतों पर चर्चा कर रहे हैं, और एक सांख्यिकीय मॉडल का अनुमान लगाने के लिए कितनी देर वीडियो कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया जाना चाहिए, उपकरण के ऑप्टिकल प्रदर्शन विशेषताओं और बैक्टीरियल समाधान की एकाग्रता (तालिका 2) के आधार पर . 105, 104, 103, और १०० कोशिकाओं/एमएल में कोशिकाओं के वीडियो का पता लगाने के संयुक्त राष्ट्र के पुनर्निर्माण होलोग्राम का उपयोग कर वास्तविक समय में प्रदर्शन किया है । आयाम और चरण छवियों का पुनर्निर्माण एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर प्रदर्शन किया है ।

Introduction

बहुत पतला नमूनों में सटीक जीवाणु गिनती का निर्धारण कई अनुप्रयोगों में महत्वपूर्ण है: कुछ उदाहरण पानी और खाद्य गुणवत्ता विश्लेषण कर रहे हैं1,2,3; रक्त, मस्तिष्कमेरु द्रव, या थूक4,5में रोगजनकों का पता लगाने; दवा उत्पादों का उत्पादन, बाँझ पानी सहित6; और खुले महासागर और तलछट7,8,9के रूप में oligotrophic वातावरण में पर्यावरण समुदाय विश्लेषण । बृहस्पति और शनि के बर्फीले चंद्रमाओं पर संभव वद्यमान माइक्रोबियल जीवन का पता लगाने में भी रुचि बढ़ रही है, विशेष रूप से यूरोपा10,11 और Enceladus12,13, 14, जो उपसतह तरल महासागरों के लिए जाना जाता है । क्योंकि १९७८ में वाइकिंग के बाद से कोई मिशन के लिए एक और ग्रह पर वर्तमान जीवन खोजने का प्रयास किया है, वहां बैक्टीरियल पहचान के लिए प्रौद्योगिकियों और उपकरणों के सीमित विकास किया गया है और अंतरिक्ष मिशन के दौरान गिनती15।

थाली गिनती के पारंपरिक तरीकों केवल बंजरभूमि कोशिकाओं है, जो पर्यावरण उपभेदों में प्रजातियों में से एक अल्पसंख्यक का प्रतिनिधित्व कर सकते है लगता है, कई बार & #60; 1%16। प्लेट दिन या अधिकतम सफलता के लिए, तनाव पर निर्भर करता है की मशीन के सप्ताह की आवश्यकता है । Epifluorescence माइक्रोस्कोपी मोटे तौर पर तेजी से और सटीक माइक्रोबियल गणन के लिए सोने के मानक के रूप में प्लेट गिनती की जगह है । न्यूक्लिक-एसिड-इस तरह के 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), SYBR ग्रीन, या acridine नारंगी कि न्यूक्लिक एसिड के लिए बांध के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों लेबल कर रहे है विशिष्ट रंजक इस्तेमाल किया17,18,19 , हालांकि कई अध्ययनों से ग्राम साइन20,21,22,23,24के फ्लोरोसेंट संकेतक का उपयोग करें । पूर्व एकाग्रता चरणों के बिना इन तरीकों का उपयोग करना पता लगाने की सीमा की ओर जाता है (LoDs) के ~ 105 प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं । लोद में सुधार निस्पंदन का उपयोग कर संभव हैं । एक तरल नमूना वैक्यूम-एक झिल्ली पर फ़िल्टर, आमतौर पर पाली कार्बोनेट और आदर्श पृष्ठभूमि को कम करने के लिए काला है । इस तरह के डीएनए के दाग के रूप में कम पृष्ठभूमि रंजक फिल्टर25के लिए सीधे लागू किया जा सकता है । आंख से सटीक गिनती के लिए, ~ 105 कोशिकाओं के प्रति फ़िल्टर की आवश्यकता है, जिसका मतलब है कि नमूनों के लिए अधिक से अधिक पतला ~ प्रति मिलीलीटर 105 कोशिकाओं, महत्वपूर्ण नमूना मात्रा एकत्र और फ़िल्टर किया जाना चाहिए. लेजर स्कैनिंग उपकरणों के लिए व्यवस्थित फिल्टर के सभी क्षेत्रों का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है और इस तरह की गिनती के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या को कम करने, नीचे का पता लगाने की सीमा को धक्का ~ एमएल26प्रति 102 कोशिकाओं । हालांकि, इन सबसे प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हैं, और परिष्कृत हार्डवेयर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सॉफ्टवेयर है कि अनुमति विशेषज्ञ पुष्टि है कि मनाया कणों बैक्टीरिया और नहीं मलबे हैं परमिट की आवश्यकता है ।

संदर्भ के लिए, पूति के साथ वयस्कों आमतौर पर & #60 पर लक्षण दिखाने शुरू; १०० कोशिकाओं/एमएल रक्त, और शिशुओं पर & #60; 10 कोशिकाओं/ एक वयस्क से एक रक्त ड्रा 10 मिलीलीटर लेता है, और एक शिशु से, 1 मिलीलीटर । पीसीआर आधारित तरीकों मानव और गैर रोगजनक वनस्पति डीएनए की उपस्थिति और पीसीआर द्वारा बाधित कर रहे है रक्त में बाधा घटकों27,28। उभरती हुई तकनीकों की एक किस्म के बावजूद, संस्कृतियों खून के संक्रमण के निदान के लिए सोने के मानक, विशेष रूप से अधिक ग्रामीण क्षेत्रों या विकासशील देशों में रहते हैं । अंय ग्रहों पर जीवन का पता लगाने के लिए, ऊष्मा गणना जीवन के लिए ऊर्जा बजट का अनुमान है और इस तरह संभव बायोमास की उंमीद कर सकते हैं । 1-100 कक्ष/एमएलयूरोपा29 पर ऊष्मा उचित होने की संभावना है । यह आसानी से इन नंबरों से देखा जा सकता है कि जलीय समाधान की बड़ी मात्रा में कोशिकाओं की बहुत छोटी संख्या का पता लगाने एक महत्वपूर्ण अनसुलझी समस्या है ।

इस पत्र में, हम 105, 104, 103, और १०० कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता पर Serratia marcescens और Shewanella oneidensis (वंय-प्रकार और गैर-gram उत्परिवर्ती) का पता लगाने का प्रदर्शन एक ऑफ-एक्सिस डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोप (DHM) । पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर DHM का प्रमुख लाभ उच्च संकल्प पर एक मोटी नमूना मात्रा के एक साथ इमेजिंग है-इस कार्यांवयन में, नमूना चैंबर ०.८ mm मोटी थी । इन नमूना कक्षों polydimethylsiloxane (PDMS) के नरम-लिथोग्राफी ± ५० µm की सहनशीलता के साथ एक सटीक मशीन एल्यूमीनियम मोल्ड से निर्माण किया गया । यह एक लगभग १००-उच्च शक्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर क्षेत्र की गहराई में सुधार गुना का प्रतिनिधित्व करता है । DHM भी मात्रात्मक चरण जानकारी प्रदान करता है, ऑप्टिकल पथ लंबाई (अपवर्तन सूचकांक और मोटाई के उत्पाद) की माप के लिए अनुमति देता है । DHM और इसी तरह की तकनीक बैक्टीरियल और खमीर सेल चक्र और बैक्टीरियल ड्राई मास30,31,३२की गणना की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है; बिखरने मतभेदों को भी बैक्टीरियल उपभेदों३३अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

हम का उपयोग साधन कस्टम-सूक्ष्मजीवों के साथ प्रयोग के लिए विशेष रूप से निर्मित है, के रूप में पहले से प्रकाशित३४,३५, और इसके डिजाइन और निर्माण का प्रदर्शन कर रहे है और चर्चा की । जलीय समाधान लगातार सिरिंज पंप के माध्यम से एक ०.२५ µ एल मात्रा नमूना चैंबर के लिए आपूर्ति कर रहे हैं; प्रवाह दर कैमरा फ्रेम दर से निर्धारित है ताकि पूरे नमूना मात्रा की इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए । एक सांख्यिकीय गणना एक दिया एकाग्रता पर कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या का पता लगाने के लिए imaged होना चाहिए कि नमूना संस्करणों की संख्या की भविष्यवाणी की.

सेल पहचान अनुप्रयोगों के लिए, आयाम और चरण छवियों में होलोग्राम के पुनर्निर्माण की आवश्यकता नहीं थी; अपुष्ट होलोग्राम पर विश्लेषण प्रदर्शन किया गया । यह महत्वपूर्ण गणनात्मक संसाधनों और डिस्क स्थान बचाता है: एक ५०० एमबी होलोग्राम वीडियो खंगाला जब 1-2 टीबी हो जाएगा । लेकिन, हम नमूने की गहराई के माध्यम से पुनर्निर्माण पर चर्चा करने के लिए पुष्टि करते है कि होलोग्राम वांछित प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करते हैं । DHM की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह दोनों तीव्रता और छवियों के चरण की निगरानी करने की क्षमता है । जीवों कि तीव्रता में लगभग पारदर्शी रहे हैं (जैसे सबसे जैविक कोशिकाओं) चरण में स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं. के रूप में यह एक लेबल मुक्त तकनीक है, कोई रंजक उपयोग किया जाता है । यह एक एकdvantage संभव अंतरिक्ष उड़ान अनुप्रयोगों के लिए, के बाद से रंजक एक मिशन की शर्तों और अधिक महत्वपूर्ण बात नहीं बच सकता है-अलौकिक जीवों के साथ काम है, जो डीएनए या आरएनए के लिए उपयोग नहीं कर सकते है नहीं ग्रहण किया जा सकता है । यह भी ऐसे आर्कटिक और अंटार्कटिक के रूप में चरम वातावरण में काम के लिए एक फायदा है, जहां रंगों को दूरदराज के स्थान पर लाने के लिए मुश्किल हो सकता है और भंडारण पर नीचा हो सकता है । चरण और आयाम में छवियों का पुनर्निर्माण एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज है कि हम GitHub (शैंपू) या ImageJ का उपयोग पर उपलब्ध कराया है का उपयोग किया जाता है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. बैक्टीरिया की वृद्धि और गणना

< p class = "jove_content" > नोट: यह उचित माध्यम में उगाया लगभग किसी भी जीवाणु तनाव के लिए लागू है < सुप वर्ग = "xref" > ३६ . हमारे उदाहरण में, हम तीन उपभेदों का उपयोग करें: Serratia marcescens एक आम के रूप में, आसान पहचाने जाने योग्य प्रयोगशाला तनाव; और एक छोटे, उच्च gram पर्यावरण तनाव, Shewanella oneidensis एमआर-1 । का पता लगाने की तुलना करने के लिए gram vs non-gram cells, a non-gram Shewanella उत्परिवर्ती, & #916; FlgM, भी तुलना < सुप वर्ग = "xref" > 37 के लिए किया जाता है. सभी उपभेदों lysogeny शोरबा (पौंड) में बड़े हो रहे हैं ।

  1. तैयार बाँझ पौंड मध्यम (आसुत जल के प्रति लीटर: 10 ग्राम bacto tryptone, 5 ग्राम bacto खमीर, 10 ग्राम NaCl; फ़िल्टर या आटोक्लेव) । मानक १०० मिमी व्यास पौंड-आगर प्लेट तैयार करें (एक ही नुस्खा मध्यम से अधिक 15 ग्राम प्रति लीटर के रूप में; आटोक्लेव (१२१ & #176; C, 20 min) निष्फल करने के लिए और जब पर्याप्त संभाल करने के लिए ठंडा डालो) । स्टोर मध्यम और फ्रिज में प्लेटें ।
    2. प्रयोग के पहले दिन
  2. बीज 5-6 एमएल के & #34; मास्टर & #34; संस्कृति माध्यम एक ताजा बैक्टीरियल कॉलोनी से, सही बाँझ और सुरक्षा तकनीक का उपयोग कर. 30 & #176 पर एक शेखर (१२० rpm) पर मशीन; C के लिए ~ 12 h । मशीन समय तनाव और विकास दर पर निर्भर करेगा । हमारे प्रयोगों में, Shewanella उपभेदों 12 घंटे के लिए मशीन हैं; हालांकि, Serratia 8 घंटे के बाद काटा जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति के मध्य लघुगणकीय विकास का प्रदर्शन किया जाएगा ।
    3. प्रयोग के दिन
  3. , बैक्टीरियल मास्टर कल्चर का एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रीडिंग (OD ६०० ) लें, जो ०.६ से ०.७ की रेंज में होने की उम्मीद है । यह लघुगणकीय विकास चरण में होना चाहिए (जैसा कि पहले निर्धारित किया गया है) । यदि नहीं, तो उपसंस्कृति १०० & #181; L में 5 मिलीलीटर मध्यम और मध्य लॉग चरण के लिए सेल विकास की अनुमति दें ।
  4. मास्टर संस्कृति का एक नमूना लेते हैं और एक Petroff-Hausser मतगणना कक्ष का उपयोग कर कोशिकाओं को सीधे गिनती । यह दोनों जीवित और मृत कोशिकाओं की गणना करेगा ।
    1. Extract a 10 & #181; L नमूना एक micropipette के साथ अनपतला संस्कृति का है और चैंबर में स्थानांतरण.
      2. एक उच्च शुष्क उद्देश्य माइक्रोस्कोप के तहत
    2. छवि (40X & #160; या 63X, NA ०.७-०.८) चरण कंट्रास्ट का उपयोग कर.
    3. में जीवाणुओं की गिनती कम से 20 चौकों और औसत.
      नोट: केवल उन बैक्टीरिया जो एक वर्ग के भीतर पूरी तरह से कर रहे है गिनती और केवल ऊपर और बाईं सीमाओं पर उन पार (या नीचे और सही, अगर तुम पसंद करते हैं) । यदि चौकोर कई रेखाओं से अलग होते हैं, तो एक सीमा के रूप में चुनें ।
    4. 20 वर्गों एक्स कमजोर पड़ने कारक के औसत के रूप में एकाग्रता की गणना । ध्यान दें कि सीधी गिनती एकाग्रता के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करती & #60; 10 7 /mL.
  5. कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (CFU) की गिनती के लिए संस्कृति की धारावाहिक कमजोरियां बनाती हैं. यह केवल लाइव कक्षों की गणना करेगा ।
    1. बाँझ ०.९% खारा समाधान के साथ चयनित बैक्टीरियल नमूनों में से प्रत्येक के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाते हैं । Transfer 20 & #181; बैक्टीरियल सॉल्यूशन का l और इसे पतला करके १८० & #181; l खारा. दोहराएँ जब तक सबसे कम एकाग्रता है ~ 10 3 कोशिकाओं/एमएल
    2. कग १०० & #181; क L कम से दो कमजोरियां-सुझाए गए 10 3 और 10 4 /mL & #160; & #8212; और प्लेट पर एक उचित ठोस मीडिया प्लेट । एक बाँझ प्रसारकर्ता के साथ फैल गया. प्रदर्शन प्रत्येक कमजोर पड़ने के कम से कम 3 दोहराने ।
    3. अपने बैक्टीरिया के लिए एक उपयुक्त तापमान पर रात भर की मशीन या जब तक कालोनियों बढ़ता है ।
    4. गणना कालोनियों और गणना कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) के अनुसार (# कालोनियों के एक्स कमजोर पड़ने फैक्टर)/volume मढ़वाया = CFU/ दोहराने पर औसत CFU.
< p class = "jove_title" > 2. DHM के लिए अत्यधिक पतला नमूनों की तैयारी

  1. DHM और पोस्ट-DHM के लिए मास्टर संस्कृति के धारावाहिक कमजोर पड़ने की गिनती-पौंड मीडिया प्लेटों पर इकाइयों के गठन (देखें 1.4.1-1.4.4) । इस डबल अंधा प्रदर्शन ताकि रिकॉर्डिंग कर व्यक्ति प्रत्येक मापा नमूना में एकाग्रता से अनजान है ।
    1. एक न्यूनतम माध्यम है कि गतिशीलता प्रोत्साहित करेंगे के 10-15 मिलीलीटर में बैक्टीरिया को कमजोर (के रूप में उपयुक्त) लेकिन सेल विभाजन को बाधित, ताकि कोशिकाओं की एकाग्रता appreciably परिवर्तन नहीं करता है प्रयोग के दौरान. यह ०.९% खारा या एक अधिक विशिष्ट गतिशीलता माध्यम हो सकता है । उदाहरण के लिए, यदि ई कोलाई का उपयोग करते हैं, गतिशीलता मध्यम होना चाहिए EDTA < सुप वर्ग = "xref" > ३८ . इन उदाहरणों के लिए, हम ०.९% खारा का उपयोग करें.
< p class = "jove_title" > 3. रिकॉर्डिंग DHM वीडियो

  1. एक बाँझ सिरिंज का उपयोग कर, ब्याज के कमजोर पड़ने के बारे में 10 मिलीलीटर में खींचो.
  2. बाँझ फिटिंग और टयूबिंग का उपयोग कर DHM नमूना चैंबर के लिए सिरिंज कनेक्ट.
    नोट: साधन के ऑप्टिकल पथ के माध्यम से नमूना के अनुरूप प्रवाह की अनुमति देने के लिए एक कस्टम निर्मित microfluidic चैंबर का निर्माण किया गया था. अधिक विवरण के लिए परिणाम अनुभाग देखें । प्रयोग करने से पहले, नमूना चैंबर के सभी घटकों autoclaving.
    3. द्वारा निष्फल किया जाना चाहिए
  3. नमूना कक्ष लगातार एक सिरिंज पंप का उपयोग कर के माध्यम से सिरिंज से नमूना प्रवाह.
    नोट: उपयुक्त प्रवाह दरों द्रवित चैनल आयाम, वांछित प्रवाह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डेटा अधिग्रहण सीमाओं के आधार पर बदलती हैं ।
  4. नमूना चैंबर के माध्यम से प्रवाहित है के रूप में, एक उचित फ्रेम दर पर लगातार होलोग्राम प्राप्त । एक समय-स्टांप फ़ाइल बनाई जाएगी जो डेटा विश्लेषण (प्रोटोकॉल अनुभाग 4) के दौरान बाद में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक छवि कैप्चर के समय को लॉग करती है । परिवेश के तापमान पर सभी होलोग्राम प्राप्त करें (23 & #176; सी) । कैमरा निर्माता द्वारा प्रदान की गई एक पूर्व लिखा C++ निष्पादन योग्य फ़ाइल निष्पादित करके होलोग्राम रिकॉर्ड.
    नोट: उपयुक्त फ़्रेम दरें चुनी गई प्रवाह दर के आधार पर बदलती हैं । इस प्रयोग के लिए, किसी फ़्रेम दर का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है जैसे कि कोई जीवाणु imaged & #62; 2 बार के रूप में यह साधन के पार कूच & #39; s फ़ील्ड देखें ।
  5. DHM के माध्यम से प्रवाहित किया जा करने के लिए नमूने के पूरे 10 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें ।
  6. यह सुनिश्चित करने के लिए कि बैक्टीरिया नहीं बढ़ रहे हैं या प्रयोगों के दौरान मर रहे हैं, लगाना से समृद्ध मीडिया प्लेटें १०० & #181 के साथ, खर्च मीडिया पोस्ट के एल DHM छवि पर कब्जा. 24 घंटे के लिए उपयुक्त अस्थायी पर एक बाँझ प्रसारक और गर्मी के साथ प्रसार; काउंट कालोनियां मौजूद.
< p class = "jove_title" > 4. कोशिका घनत्व की गणना और पता लगाने की सीमा

  1. का अधिग्रहण होलोग्राम वीडियो के साथ, बैक्टीरिया की उपस्थिति के लिए डेटा का विश्लेषण.
    1. होलोग्राम की एक समय श्रृंखला के लिए औसत पिक्सेल मूल्य की गणना तो होलोग्राम में स्थिर कलाकृतियों को खत्म करने के लिए प्रत्येक संबंधित पिक्सेल से इस औसत मूल्य घटाना । यह निम्न चरणों का पालन करने से ImageJ में किया जा सकता है:
      1. ३२-bit (छवि-प्रकार-३२ बिट) में कनवर्ट करें
      2. औसत की गणना (छवि-स्टैक-Zproject-माध्य)
      3. स्टैक के शेष से माध्य घटाना ( प्रक्रिया-ImageCalculator-घटाना)
    2. दिखाई हवादार रिंग्स और इन-फोकस कक्षों की संख्या गिनना रूप. ImageJ में, यह बिंदु उपकरण के साथ ऑब्जेक्ट्स पर इंगित करके किया जाता है ।
      3. होलोग्राम की प्रत्येक श्रृंखला
    3. एक समय स्टांप फ़ाइल (होलोग्राम अधिग्रहण के समय में दर्ज) के साथ किया जाएगा । समय-स्टांप फ़ाइल का उपयोग करें जब छवि कैप्चर किया गया था पर पंप नमूना की कुल राशि की गणना करने के लिए ।
  2. सेल घनत्व की गणना कोशिकाओं की कुल संख्या नमूना imaged की कुल मात्रा के द्वारा पहचाने विभाजित करके । सटीक आँकड़े के लिए औसत 5-10 फ्रेम्स.
< p class = "jove_title" > 5. छवि पुनर्निर्माण करने के लिए आयाम और चरण

  1. फ्रेम प्रति 10-200 कोशिकाओं के साथ प्रतिनिधि वीडियो चुनें । कच्चे लोड (माध्य-घटाया नहीं) पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर में होलोग्राम (उदाहरण: ImageJ संख्यात्मक प्रचार < सुप वर्ग = "xref" > ३९ ; शैंपू [GitHub]).
    1. का उपयोग ImageJ, OD-संख्यात्मक प्रचार-संख्यात्मक विवर्तन.
      2. के लिए जाना
    2. में, असली या आभासी छवि का चयन करें और किसी भी sinusoidal शोर सुविधाओं को खत्म करने के लिए एक रूपान्तर मुखौटा ड्रा ।
    3. पुनर्निर्माण दूरी दर्ज करके उचित जेड कदम पर आयाम और चरण पुनर्निर्माण ।
  2. माध्य के रूप में शुू में शोर को कम करने के लिए आयाम डेटा घटाना ।
    3. 3 डी क्यूब या प्रोजेक्शन के रूप में प्लॉट डेटा
  3. । Plugins के लिए जाओ & #8212; Volume Viewer.

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Representative Results

परिणाम DHM द्वारा बहुत कम स्तर पर जीवित और मृत जीवाणुओं का पता लगाने की क्षमता का संकेत होना चाहिए. गिने बैक्टीरिया की संख्या Petroff-हौसर गिनती चैंबर और थाली गिनती का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के अनुरूप होना चाहिए. मानक सांख्यिकीय विधियों विभिन्न बैक्टीरियल सांद्रता पर अलग पहचान तरीकों की सटीकता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं ।

चित्रा 1 से पता चलता है Petroff-Hausser गिनती कक्ष के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपयोग किया जाता है कि गिनती चैंबर के microstructure कक्षों की सीधी गणन में किया जाता है । चित्र 2a एक ठेठ समृद्ध संस्कृति की थाली है कि एस marcescens के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दी गई है कालोनियों बढ़ने (कमरे के तापमान पर 16 घंटे) से पता चलता है । चित्र b सभी उपयोग किए जाने वाले उपभेदों के लिए विकास घटता दिखाता है । जबकि सटीक spectrophotometer माप बदलती हैं, आयुध डिपो६०० और कॉलोनी गणना के बीच संबंध spectrophotometer की विश्वसनीय रेंज के भीतर रैखिक होना चाहिए; हम मापा ~ OD600 = ०.१ के रूप में ~ 108/mL. प्रत्यक्ष Petroff-Hausser मायने रखता है और कॉलोनियों गिनती 10% के भीतर सहमत होना चाहिए जब तक कोशिकाओं के रूप में वृद्धि की अवस्था में कारोबार से देखा मर शुरू करते हैं ।

आरेख 3 कस्टम नमूना कक्षों के डिज़ाइन को दिखाता है । कस्टम microfluidic कक्षों इस प्रयोग के लिए उपयोग किया गया होलोग्राम माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र के माध्यम से नमूना के सतत प्रवाह की अनुमति है । नमूना कक्षों के निर्माण में मानक microfluidic तकनीकों और सामग्रियों का उपयोग किया गया । कुंद पुरुष Luer के साथ स्टेनलेस स्टील सुई इत्तला दे दी-लोक फिटिंग नमूना कक्ष के लिए प्रवेश और आउटलेट बंदरगाहों प्रदान करने के लिए microfluidic डिवाइस में डाला गया । microfluidic चैनल ज्यामिति polydimethylsiloxane के नरम लिथोग्राफी (PDMS) द्वारा स्थापित किया गया था एक मशीनी एल्यूमीनियम मास्टर मोल्ड का उपयोग कर, जो संकुचित था, एल्यूमीनियम फ्रेम के माध्यम से, दो ऑप्टिकल गुणवत्ता कांच खिड़कियों के बीच । PDMS प्रवाह चैनल geometries के रूप में अच्छी तरह के रूप में सुरक्षित hypodermic सुई, जो करने के लिए और प्रवाह चैनलों से तरल पदार्थ परिवहन प्रदान करता है स्थापित करता है । इन नमूना कक्षों केवल प्रवाह चैनल ज्यामिति स्थापित करने के लिए PDMS का उपयोग करें और इस प्रकार साधन के ऑप्टिकल पथ में कोई PDMS होते हैं । ध्यान दें कि एक बंद धुरी होलोग्राम माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल प्रकृति के कारण, दो सूक्ष्म चैनल नमूना चैंबर में एक दूसरे के समानांतर ढाला गया । यह इंटरफेरोमीटर के दोनों हथियारों के बीच ऑप्टिकल पथ लंबाई मैच (' नमूना ' और ' संदर्भ ' हथियार के रूप में संदर्भित) करना है । संदर्भ चैनल केवल बाँझ मीडिया शामिल होना चाहिए, और प्रवाह के अधीन नहीं होना चाहिए.

चित्रा 4 अपनी प्रयोगशाला कार्यांवयन में एक योजनाबद्ध और डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोप की छवियों से पता चलता है । यह कैमरे के साथ प्रदान की सॉफ्टवेयर द्वारा संचालित है । चित्र 5 दृश्य के प्रति फ़ील्ड की अनुमानित संख्याओं के साथ बैक्टीरियल गणन और उनके पत्राचार के लिए प्रतिनिधि DHM डेटा दिखाता है । कच्चे होलोग्राम से, पुनर्निर्माण के बिना, यह देखने के लिए और औसत घटाव और मैनुअल ट्रैकिंग द्वारा कोशिकाओं की गणना करने के लिए संभव है । यह बहुत गणना के बोझ को कम करता है सभी z-विमानों के पुनर्निर्माण की तुलना में, के रूप में कच्चे होलोग्राम चैंबर की गहराई भर में कोशिकाओं को दिखाते हैं । विभिंन सांद्रता और प्लेट गिनती और Petroff-हौसर गिनती के साथ उनके पत्राचार में संस्कृतियों की उपस्थिति संकेत मिले हैं । कुल कक्ष गणनाएं चित्र की कुल संख्या से अधिक प्रत्येक नमूना खंड में देखे गए कक्षों की संख्या औसत करके निर्धारित होती हैं । पता लगाने की सीमा नमूना संस्करणों की कुल संख्या के द्वारा निर्धारित किया जाता है imaged । इस प्रयोग में, हम इस मूल्य पर एक अधिकतम सीमा सेट, ०.२५ µ l वेतन वृद्धि में imaged नमूने के 10 मिलीलीटर की अधिकतम कुल के साथ (नमूना प्रति ४०,००० छवियों की कुल) । यदि कक्ष स्पष्ट रूप से 20 फ़्रेंस की एक श्रृंखला पर प्रत्येक फ़्रेम में स्वीकार्य हैं, तो रिकॉर्डिंग अधिकतम कुल वॉल्यूम हासिल करने से पहले रोक दी जाती है । पिछले एक पत्र में, हम 1-10 5 कोशिकाओं से लेकर सांद्रता पर ५०% विश्वास के स्तर पर जीवाणुओं का पता लगाने के लिए आवश्यक नमूना मात्रा की संख्या का आकलन करने के लिए एक सूत्र की सूचना दी(तालिका 1). इस अनुमान पर आधारित, सभी ४०,००० फ़्रेम की एक परीक्षा 1/एमएल पर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देनी चाहिए, हालांकि इस गणना की गणना गहन है ।

चित्रा 6 पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर (फिजी)३९का उपयोग दिखाता है । एक एकल होलोग्राम खोला और सॉफ्टवेयर "आयुध डिपो संख्यात्मक प्रचार-संख्यात्मक विवर्तन" चलाया जाता है । इमेजिंग पैरामीटर संवाद बॉक्स में दिए गए हैं; आयाम, तीव्रता, और चरण सभी खंगाला जा सकता है । एक एकल z विमान चुना जा सकता है, या बैच पुनर्निर्माण पूरी गहराई पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

चित्रा 7 एक चयनित नमूने में अलग गहराई पर आयाम और चरण छवियों के पुनर्निर्माण से पता चलता है. पुनर्निर्माण को उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है मास्क, एक औसत के साथ-घटाया तीव्रता छवि, एक चरण छवि, चरण स्टैक के माध्यम से एक अधिकतम प्रक्षेपण, और तीव्रता ढेर की एक मात्रा प्रक्षेपण के साथ दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: बैक्टीरियल कोशिकाओं के प्रत्यक्ष गिनती. कोशिकाओं में बैक्टीरियल एकाग्रता/एमएल गिनती चैंबर में बैक्टीरिया की कुल संख्या की गणना और इस तथ्य यह है कि Petroff-हौसर चैंबर केवल नमूने के 20 nL शामिल है कि संख्या के लिए लेखांकन स्केलिंग है । (क) Petroff-Hausser मतगणना कक्ष । (ख) 10x चरण कंट्रास्ट के अंतर्गत मतगणना कक्ष microstructure की छवि, विभिन्न आकारों की कोशिकाओं की गणना करने के लिए उपयोगी विभिन्न आकारों के बक्से दिखा रहा है । (ग) मतगणना कक्ष छोटे बक्से के भीतर एस marcescens की उपस्थिति; 40X चरण कंट्रास्ट । (D) उस गणना के लिए विधि जो ऊपरी और दाएं किनारों (N) पर गिरती हुई कक्षों को शामिल नहीं करती है, लेकिन निचले और बाएं किनारों (Y) पर नहीं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: कॉलोनी विकास और ऑप्टिकल घनत्व द्वारा गिनती कोशिकाओं. (क) एस marcescens 16 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । सही कमजोर पड़ने पर, संस्कृति प्लेटें चाहिएसटीक गिनती और आंकड़ों के लिए 20-200 कालोनियों है । दिखाया थाली कुछ भी विश्वसनीय गिनती के लिए भीड़ है । (ख) 3 उपभेदों के लिए विकास घटता इस्तेमाल किया । ०.१ के एक ऑप्टिकल घनत्व ~ 108 कोशिकाओं/एमएल से मेल खाती है, लेकिन सटीक मूल्यों साधन के अनुसार बदलती हैं । प्रत्यक्ष Petroff-हौसर काउंट्स प्लेट गिनती के साथ सहमत है 10% के भीतर रैखिक विकास रेंज के भीतर । त्रुटि पट्टियां 5 स्वतंत्र नमूनों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: नमूना चैंबर डिजाइन. (क) Microfluidic योजनाबद्ध (नमूना और संदर्भ microchannels लेबल). (ख) पूरी तरह नमूना चैंबर इकट्ठे । (C) नमूना कक्ष के घटक तत्वों को दिखा रहा सीएडी दृश्य विस्फोट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: योजनाबद्ध और डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोप की छवियाँ. (A) योजनाबद्ध चार मुख्य तत्व दिखा रहा है: स्रोत, नमूने (नमूना पथ कल्पना लेबल है । और संदर्भ पथ रेफरी लेबल है.), माइक्रोस्कोप, और सेंसर । (B) हार्डवेयर का ठोस मॉडल । फाइबर खिलाया स्रोत विधानसभा नीचे है, और इमेजिंग कैमरा शीर्ष पर है । माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी-दो ऐनक लेंस और रिले लेंस के शामिल-३०० मिमी लंबे लेंस ट्यूब के भीतर समाहित कर रहे हैं । तीन स्रोत माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी के बीच धुरी चरण अध्ययन के तहत नमूना के आसान मैनुअल हेरफेर प्रदान करता है । (ग) प्रयोगशाला में लिखत का फोटोग्राफ । छवि के निचले हिस्से में स्केल बार 1 इंच का प्रतिनिधित्व करता है । योजनाबद्ध पुनः वालेस एट अल से तैयार कर रहे हैं । ३४. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: विकास घटता और प्रतिनिधि DHM डेटा. (A) ३६५ µm x ३६५ µm x 1 मिमी का एक नमूना मात्रा पर आधारित दृश्य के प्रति फ़ील्ड कक्षों की अनुमानित । DHM गणन के लिए इष्टतम श्रेणी आयत में दिखाया गया है, और असली नमूने (B) और (C) के रूप में इंगित किए गए हैं । (ख) एक Shewanella संस्कृति के DHM होलोग्राम पर 8 x 105 कोशिकाओं/एमएल Petroff-हौसर और ७.७ x 105 कोशिकाओं/एमएल द्वारा मापा के रूप में प्लेट गिनती से मापा; इस छवि को ११० कोशिकाओं, भविष्यवाणी करने के लिए एक उत्कृष्ट फिट दिखाता है । (ग) एक Shewanella संस्कृति का DHM होलोग्राम २.० ± ०.१ x 105 कोशिकाओं/एमएल Petroff-हौसर और २.० ± ०.३ x 105 कोशिकाओं/एमएल द्वारा मापा के रूप में प्लेट गिनती से मापा; यह छवि 27 कक्षों से पता चलता है । स्केल बार = ३५ µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: पुनर्निर्माण प्रदर्शन. (क) फिजी में होलोग्राम खोलें. (B) संख्यात्मक प्रोपेगेशन चलाएं और तरंग दैर्ध्य और छवि आकार दर्ज करें । प्रारंभ करने के लिए 0 के करीब एक z दूरी चुनें । (C) वास्तविक या आभासी छवि का चयन करने के लिए संकेत दिए जाने पर एक रूपान्तर मास्क आरेखित करें । (D) स्नान संसाधन पूरे मात्रा में पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: पुनर्निर्माण का प्रकटन. पर Serratia संस्कृति की छवियां ~ 106 कोशिकाओं/ (क) कच्ची होलोग्राम. (B) रूपान्तर रूपांतरित करता है । वृत्त के अंदर का क्षेत्र उपयोग किया जाने वाला क्षेत्र है; बाकी नकाबपोश है । (C) किसी एकल z-विमान में आयाम पुनर्निर्माण । (D) एकल z-हवाई जहाज़ पर चरण पुनर्निर्माण; स्केल बार डिग्री में चरण बदलाव से पता चलता है । (E) चरण स्टैक में सभी z-विमानों के माध्यम से अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन । (च) पूर्ण आयाम स्टैक का वॉल्यूम दृश्य (३६५ x ३६५ x ८०० µm) । स्केल बार = ३५ µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एकाग्रता [प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं] फ़्रेम की आवश्यकता
1.00 ई + 00 ६,६८६
1.00 ई + 01 ६६९
1.00 ई + 02 ६७
1.00 ई + 03 7
1.00 ई + 04 1
1.00 ई + 05 1

तालिका 1: DHM द्वारा बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए आवश्यक नमूना संस्करणों की न्यूनतम संख्या (५०% का पता लगाने विश्वास).

संपत्ति मान इकाई
ऑपरेटिंग तरंग दैर्ध्य ४०५ एनएम
उद्देश्य संख्यात्मक एपर्चर ०.३ -
सिस्टम आवर्धन 20 -
पार्श्व संकल्प ०.७ μm
नमूना इमेजिंग वॉल्यूम ३६० x ३६० एक्स ८०० माइक्रोन एक्स माइक्रोन एक्स माइक्रोन
साधन लंबाई ४०० मिमी

तालिका 2: डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोप के लिए ऑप्टिकल और प्रदर्शन विनिर्देशों.

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Discussion

होलोग्रामके सांख्यिक पुनर्निर्माण के लिए: होलोग्राम के संख्यात्मक निर्माण के लिए, कोणीय स्पेक्ट्रम विधि (एएसएम) का प्रयोग किया जाता है । यह DHM के लिए है हरी समारोह के साथ होलोग्राम के कनवल्शनफ़िल्टर्स शामिल है । एक विशेष फोकल विमान में छवि के जटिल wavefront का रूपान्तर कनवल्शनफ़िल्टर्स प्रमेय के रूप में निम्नानुसार रोजगार द्वारा परिकलित किया जा सकता है:

Equation 21)

जहां रूपान्तर ट्रांस्फ़ॉर्म ऑपरेटर है, होलोग्राम मैट्रिक्स है, और DHM के हरे रंग का कार्य है, जो इस रूप में परिभाषित है: Equation 3 Equation 4 Equation 5

Equation 62)

जहां दूरी है, ऑप्टिकल अक्ष के साथ, वांछित फोकल विमान का पुनर्निर्माण किया जा करने के लिए, दीप्ति तरंग दैर्ध्य है, और एक्स और वाई दिशाओं में पिक्सल की संख्या, क्रमशः कर रहे हैं, और और Equation 7 Equation 8 Equation 9 Equation 10 Equation 11 Equation 12 पिक्सेल आकार (डिटेक्टर विमान में) एक्स और वाई दिशाओं में, क्रमशः४०रहे हैं ।

जटिल लहर सामने से, तीव्रता के परिमाण के चुकता द्वारा गणना की जा सकती है, और चरण के काल्पनिक और वास्तविक भागों के बीच गुणांक के स्पर्शज्या द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । Equation 13 Equation 13

संशोधन और समस्या निवारण
विरल बैक्टीरियल सांद्रता के गणन शामिल प्रयोगों अत्यधिक प्रदूषित करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, झूठी सकारात्मक, और झूठी नकारात्मक. इस कारण से, बैक्टीरिया की वृद्धि और गणना, साथ ही DHM के लिए अत्यधिक पतला नमूनों की तैयारी इस प्रयोग में महत्वपूर्ण कदम हैं । सावधानी इस प्रयोग में संदूषण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए सावधानी से पर्यावरण को नियंत्रित करने जहां बैक्टीरिया बड़े हो रहे है और गणना की । autoclaving सहित उचित नसबंदी तकनीक, दूषण के खिलाफ रोकने के साथ ही झूठी सकारात्मक मदद करते हैं । आगे झूठी सकारात्मक के खिलाफ रोकने के लिए, बैक्टीरिया इस प्रयोग है कि अपेक्षाकृत अद्वितीय विशेषताओं का प्रदर्शन के लिए चयन किया गया (जैसे, एस marcescens एक बहुत अलग लाल रंग है जब cultureed). झूठी नकारात्मकता के खिलाफ रोकने के लिए, इस प्रयोग के लिए चुना बैक्टीरिया इस तरह चुना गया है कि वे समृद्ध संस्कृति प्लेटों पर विकसित करने में सक्षम हो जाएगा, साथ ही साथ विशिष्ट आकार और/या गतिशीलता पैटर्न DHM के माध्यम से पहचाना जा करने के लिए है । यह नमूनों को चढ़ाना और प्लेट गिनती से बैक्टीरिया को बढ़ाता द्वारा प्रदूषित और/या अप्रत्याशित कोशिका वृद्धि के लिए समय पर परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

इस प्रयोग के संचालन में, लगभग २.४ GB का एक डेटा आकार प्रति 1 मिलीलीटर नमूना अपेक्षित है । यह संख्या, ज़ाहिर है, कैमरे और फ़ाइल स्वरूप इस्तेमाल पर निर्भर है । रिपोर्ट की गई डेटा का आकार एक 4 Mpx डिटेक्टर और एक मानक TIFF फ़ाइल स्वरूप के उपयोग द्वारा है । डेटा के बाद प्रसंस्करण के नमूने के 1 मिलीलीटर प्रति गणना के लगभग 6 मिनट की आवश्यकता है । यह प्रसंस्करण समय एक इंटेल i7 8-कोर प्रोसेसर पर ३.५ गीगा और रैम की ३२ GB का उपयोग करते हुए मनाया गया । इन गणना बहुत कम प्रसंस्करण समय के लिए GPU के लिए समानांतर किया जा सकता है, लेकिन यहां नहीं किया गया था ।

तकनीक की सीमाएं
जबकि बैक्टीरिया का बहुत कम सांद्रता का पता लगाने के लिए DHM का उपयोग संभव है, इस विधि गैर विशिष्ट है । आकृति विज्ञान अकेले बैक्टीरियल उपभेदों की पहचान करने का एक निर्णायक साधन नहीं है । नैदानिक अनुप्रयोगों गैर लक्ष्य कोशिकाओं और समुच्चय की उपस्थिति के कारण विशिष्ट चुनौतियों पेश करेंगे । हालांकि, यहां प्रस्तुत दोहरी बीम साधन का लाभ यह है कि यह अपेक्षाकृत पंकिल नमूनों में छवि बैक्टीरिया को सक्षम है । नैदानिक नमूनों में बैक्टीरिया का पता लगाने की क्षमता, और आवश्यक है कि नमूनों की पूर्व प्रसंस्करण की डिग्री, रहने के लिए निर्धारित किया जाएगा.

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण
चरण 2: सटीक कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए मात्रात्मक गणन के लिए आवश्यक है । किसी भी कमजोर पड़ने की थाली गिनती द्वारा संरक्षित किया जाना चाहिए । चरण 3: प्रवाह दर और इसी फ़्रेम दर का चयन सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी कक्ष देखे गए हैं । पंप मापदंडों का समायोजन सावधानी से पता लगाने की एक सीमा प्रदर्शन करने से पहले देखते होना चाहिए । चरण 4: बहुत कम बैक्टीरियल सांद्रता के लिए, यह पता लगाने के लिए पर्याप्त डेटा कैप्चर करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह कुछ डेटा का पुनर्निर्माण करने के लिए आवश्यक हो सकता है कि कुछ कोशिकाओं है, और नहीं मलबे, देखा जा रहा है । चरम मामलों में, समाधान के 10 मिलीलीटर से अधिक की आवश्यकता हो सकती है । गैर-gram उपभेदों की अपेक्षा gram उपभेदों से अस्पष्ट होने की संभावना होती है. चरण 5: यदि डेटा में कोई अस्पष्टता है, पुनर्निर्माण में मदद कर सकते है कि होलोग्राम कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते है और नहीं मलबे । उच्च संकल्प पुनर्निर्माण क्लासिक सेल morphologies दिखाएगा, और गतिशीलता स्पष्ट रूप से गतिशील उपभेदों की पटरियों में देखा जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन अनुदान ४०३७ और ४०३८ प्रौद्योगिकी के कैलिफोर्निया संस्थान को इस काम के धन के लिए स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast BD Biosciences 212750
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7710 Many options for purchase
Bacto Agar BD Biosciences 214010
10 cm Petri dishes VWR 10053-704
15 mL culture tubes Falcon (Corning Life Sciences) 352002 Loose-capped
Petroff-Hauser chamber Electron Microscopy Sciences 3920
10 mL syringes BD Biosciences 309604 Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting McMaster-Carr 51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow Nalgene 8000-0004 Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000
Sample Chamber Custom n/a See Materials Section
Holographic Microscope Custom n/a See Wallace et al.
Open-source software Custom https://github.com/bmorris3/shampoo

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References

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कम सांद्रता पर सूक्ष्मजीवों को बढ़ाता डिजिटल होलोग्राम माइक्रोस्कोपी (DHM) का उपयोग
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Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). J. Vis. Exp. (129), e56343, doi:10.3791/56343 (2017).

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