Ultradünne derzei-elastischen Hydrogele als eine biomimetische Basalmembran für Dual Zellkultur
Summary
Aktuelle Bilayer Kultur Modelle erlauben nicht funktioneller in-vitro- Studien, die in Vivo Mikroumgebungen zu imitieren. Mit Polyethylenglykol und Zinkoxid Template Methode, beschreibt dieses Protokoll die Entwicklung der eine ultradünne biomimetische Basalmembran mit einstellbaren Steifigkeit, Porosität und biochemische Zusammensetzung, die eng in Vivo imitiert extrazellulären Matrizen.
Abstract
Die Basalmembran ist ein wichtiger Bestandteil der zellulären Bilayer, die Steifigkeit, Zusammensetzung, Architektur und Porosität variieren können. In-vitro- Studien der endothelialen epithelialen Bilayer haben traditionell auf durchlässigen Support-Modelle, die Bilayer Kultur zu ermöglichen, sondern durchlässig unterstützt sind begrenzt in ihrer Fähigkeit, die Vielfalt der menschlichen Keller Membranen zu replizieren. Im Gegensatz dazu Hydrogel-Modelle, für die chemische Synthese erforderlich sind höchst abstimmbaren und Modifikationen von der Steifigkeit des Materials und die biochemische Zusammensetzung über Einbeziehung biomimetische Peptide oder Proteine ermöglichen. Jedoch sind traditionelle Hydrogel-Modelle in der Funktionalität begrenzt, weil sie Poren für Zell-Zell-Kontakte und funktionellen in Vitro Migrationsstudien fehlt. Zusätzlich, aufgrund der Dicke der traditionelle Hydrogele wurde Einbeziehung der Poren, die sich über die gesamte Dicke der Hydrogele schwierig. In der vorliegenden Studie verwenden wir poly-(ethylene-glycol) (PEG) Hydrogele und eine neuartige Zink Oxid Template Methode um die bisherigen Mängel der biomimetischen Hydrogele. Dadurch stellen wir eine ultradünne, Basalmembran-wie Hydrogel, das die Kultur der konfluierende zellulären Bilayer auf eine anpassbare Gerüst mit variabler Pore Architekturen, mechanischen Eigenschaften und biochemische Zusammensetzung ermöglicht.
Introduction
Extrazelluläre Matrizen (ECM) bilden die Protein-Gerüste, die Zellhaftung unterstützen und dienen als Barrieren zwischen verschiedenen Zelltypen und sind ein wesentlicher Bestandteil der komplexen Geweben und Organen. Im Gegensatz zum interstitiellen Bindegewebe ist der Basalmembran (BM) eine spezielle Art von ECM, das wirkt als Barriere gegen Gewebe Kompartimente voneinander trennen. BMs sind etwa 100 µm dick und erlauben daher für direkte und indirekte Kommunikation zwischen den Zellen auf beiden Seiten. Zwei typische Beispiele für BMs sind vaskuläre BMs, gefunden in der mikrovaskuläre Wand zwischen Perizyten und Endothelzellen und Atemwege BMs, die zwischen den Endothelzellen und epithelialen Zellen gefunden werden. BMs dienen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellfunktion, wie Zellpolarität und Migration, Gesundheit und Krankheit. 1 Zusammensetzung, Steifigkeit, Architektur und Porosität von BMs variiert Organsysteme unterschiedliche physiologische Funktionen zu erleichtern. BM Poren sind beispielsweise wichtig für die Aufrechterhaltung der Zell-Zell-Kommunikation, lösliche Moleküle Verbreitung und Migration von Immunzellen bei Entzündungen oder Bakterien während der Infektion. In den Atemwegen umfassen Poren die volle Stärke des BM, mit Durchmessern von 0,75 bis 3,86 µm.2
Die dünne Natur des BM gewährleistet die obwohl Zelltypen physisch voneinander getrennt sind, interzelluläre Kommunikation über Signalisierung parakrine und Kontakte vermittelt. So haben Forscher um menschliche Krankheit in-vitro- Studie auf porösen durchlässigen Träger Einsätze zu zellulären Bilayer Kultur verlassen. 3 diese Modelle wurden entscheidend für das Verständnis der zellulären Kommunikation, die in Gesundheit und Krankheit eine Rolle spielt. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 durchlässig Unterstützung Einsätze erfüllen die Grundvoraussetzungen für das Verständnis, wie physiologische Prozesse, z. B. Leukozyten Rekrutierung und bakterieller Infiltration regelt Zellezelle signalisieren; jedoch die Einsätze haben erhebliche Einschränkungen und nicht um eine menschliche BM Permeable Unterstützung zu imitieren Einsätze fehlen mechanischen und biochemischen Einstellbarkeit und die vereinfachende poröse Struktur ist nicht imitieren die faserige Struktur, die die unregelmäßigen Poren schafft typisch für BMs. Daher gibt es ein wachsendes Bedürfnis nach einstellbaren Systeme, die die native BM-Eigenschaften neu zu erstellen, die zelluläre Prozesse zu beeinflussen.
Polymer-basierten Substrate sind ideale Kandidaten für die Entwicklung von Biomimetic BMs zellulären Bilayer in einem Kontext zu studieren, die die in-Vivo -Umwelt genauer imitiert. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 Polymere sind mechanisch einstellbaren und chemisch geändert werden können, um biomimetische Peptid-Fragmente. zu integrieren 11 , 12 , 13 Bioinert Polymer-Polyethylenglykol (PEG) kann verwendet werden, um biomimetische BMs zu konstruieren, und neuere Arbeiten hat die Synthese von mechanisch einstellbaren PEG Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) Gele mit porösen Netzwerke, die Zelle Wachstum unterstützen detaillierte und entzündlichen Zelle Chemotaxis. 14 obwohl PEG-basierte veröffentlicht Substrate zur Verfügung gestellt eines realistischeren Modells der menschlichen ECM als durchlässige unterstützt, viele dieser Modelle sind extrem dick, mit einer Tiefe von rund 775 µm, das begrenzt die Fähigkeit Bilayer Kulturen mit Zellezelle erstellen Kontakte. 14
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Schaffung einer PEG Polymer-basierten BM Mimik, die viele der Einschränkungen der aktuellen Zelle Bilayer Kulturtechnologien überwindet. Haben wir eine Template-Methode, die das Polymer während der Synthese und Vernetzung, die anschließend und selektiv entfernt Zinkoxid, eine extensiv genutzte Material für die Herstellung der mikrokristallinen Produktion berücksichtigt die daraus resultierende Masse Polymer. Dieser Prozess generiert ein zufälliges porösen Netzwerk, gewunden und vernetzten Pore-Netzwerk von menschlichen BMs imitiert. Darüber hinaus kann die Porosität durch Ändern der Größe und Form von Zinkoxid Mikrokristalle über Änderung der Stöchiometrie der Reaktion während der Nadel Produktion geändert werden. Hier entwickelte Technik schafft eine ultradünne Hydrogel, das die Dicke der menschlichen BM schließlich, die Mechanik, die Porosität nachahmt, und die biochemische Zusammensetzung diese BM-ähnliche Konstrukte kann leicht geändert werden, um eine Mikroumgebung zu generieren die meisten ähnlich wie die gesehen in Vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll hier konnten wir einen einstellbaren PEG Hydrogel, dienen als Gerüst biomimetische BM erstellen. Insbesondere kann von unterschiedlichen Molekulargewichte der PEG, Peptid Konjugation Strategien und Zinkoxid mikrokristalline Strukturen oder Konzentrationen, der Elastizitätsmodul, biochemische Eigenschaften und poröse Struktur die Hydrogele, bzw. geändert werden. Das ultradünne PEG-Gerüst verfügt über eine höhere Dichte der Pore und eine kleinere Porendurchmesser, die mehr mimetischen Funktionen in <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Prof. Paul Van Tassel und Prof. Chinedum Osuji für ihre nachdenkliche Gespräche und Materialwissenschaft Know-how danken. Diese Arbeit wurde von den Dubinsky neue Initiative Award und den nationalen Instituten der Gesundheit NIBIB BRPR01 EB16629-01A1 finanziert.
Materials
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
