Summary
Actuele modellen van de cultuur van de dubbelgelaagde toegestaan niet voor functionele in vitro studies die in vivo microenvironments na te bootsen. Met behulp van polyethyleenglycol en een methode van zinkoxide templating, beschrijft dit protocol de ontwikkeling van een uiterst dunne biomimetische kelder membraan met afstembare stijfheid, porositeit en biochemische samenstelling die nauw samen van de Nabootsers van in vivo extracellulaire matrices.
Abstract
De membraan van de kelder is een essentieel onderdeel van de cellulaire bilayers die in de stijfheid, samenstelling, architectuur en poreusheid variëren kan. In vitro studies van endotheel-epitheliale bilayers traditioneel hebben vertrouwd op doorlaatbare steun modellen waarmee dubbelgelaagde cultuur, maar doorlaatbare ondersteunt zijn beperkt in hun vermogen om te repliceren de diversiteit van menselijke kelder membranen. Daarentegen hydrogel modellen waarvoor chemische synthese zijn zeer afstembare en zorgen voor wijzigingen van de materiële stijfheid én de biochemische samenstelling via opneming van peptiden biomimetische of eiwitten. Traditionele hydrogel modellen zijn echter beperkt in functionaliteit wegens hun gebrek aan poriën voor cel contacten en functionele in vitro migratie studies. Bovendien, als gevolg van de dikte van de traditionele hydrogels, heeft opneming van poriën die zich uitstrekken over de volledige dikte van de hydrogels geweest uitdagend. In de huidige studie gebruiken we poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels en een roman zinkoxide templating methode om de vorige tekortkomingen van biomimetische hydrogels. Dientengevolge, presenteren we een uiterst dunne, kelder membraan-achtige hydrogel waartoe de cultuur van confluente cellulaire bilayers op een aanpasbare steiger met variabele porie platforms, mechanische eigenschappen en biochemische samenstelling.
Introduction
Extracellulaire matrices (ECM) make-up de eiwit-steigers die het ondersteunen van cel bijlage en dienen als de barrières tussen de verschillende celtypen en zijn een essentieel onderdeel van complexe weefsels en organen. In tegenstelling tot interstitiële bindweefsel is de kelder membraan (BM) een gespecialiseerde vorm van ECM die als een barrière fungeert voor het verdelen van weefsel compartimenten van elkaar. BMs ongeveer 100 µm dik zijn, en daarom zorgen voor directe en indirecte communicatie tussen cellen aan weerszijden. Twee veelvoorkomende voorbeelden van BMs zijn vasculaire BMs, gevonden in de microvasculaire muur tussen pericytes en endotheliale cellen, en luchtweg-BMs die zijn gevonden tussen endotheel en epitheliale cellen. BMs dienen een belangrijke rol bij het reguleren van de functie van de cel, zoals cel polariteit en migratie, in gezondheid en ziekte. 1 de samenstelling, stijfheid, architectuur en porositeit van BMs verschilt orgaansystemen te vergemakkelijken van verschillende fysiologische functies. Bijvoorbeeld, zijn BM poriën cruciaal voor het behoud van cel-cel communicatie, oplosbare molecuul diffusie, en voor de migratie van immuuncellen tijdens ontsteking of bacterie tijdens de infectie. In de luchtwegen uitstrekken poriën over de volledige dikte van de BM, met een diameter variërend van 0,75 tot 3.86 µm.2
De dunne aard van de BM garandeert dat hoewel celtypes fysiek van elkaar gescheiden zijn, intercellulaire communicatie via het paracrine - en contact-bemiddelde signalering behouden blijft. Dus, om te studeren ziekten bij de mens in vitro, onderzoekers hebben vertrouwd op poreuze doorlaatbare steun inzetstukken aan cultuur cellulaire bilayers. 3 deze modellen zijn cruciaal voor het begrip van de cellulaire communicatie een rol in gezondheid en ziekte speelt. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 doorlaatbare steun inzetstukken voldoen aan de basisvereisten voor het begrijpen van hoe cel signalering regelt fysiologische processen, zoals leukocyte werving en bacteriële infiltratie; echter de inserts aanzienlijke beperkingen hebben en niet na te bootsen van een menselijke BM. Permeable ondersteuning inzetstukken ontbreken zowel mechanische en biochemische tunability, en de simplistische poreuze structuur doet niet na te bootsen de vezelige structuur waarmee de onregelmatige poriën typisch van BMs. Daarom is er een groeiende behoefte aan afstembare systemen die de inheemse BM eigenschappen die van invloed zijn cellulaire processen kunt recreëren.
Polymeer gebaseerde substraten zijn ideale kandidaten voor de ontwikkeling van biomimetische BMs te bestuderen van cellulaire bilayers in een context die nauwer de omgeving in vivo bootst . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polymeren worden mechanisch afstembare en chemisch kunnen worden aangepast voor het nemen van biomimetische peptide fragmenten. 11 , 12 , 13 het bioinert polymeer polyethyleenglycol (PEG) kan worden gebruikt voor het construeren van biomimetische BMs en recente werk is de synthese van mechanisch afstembare PEG arginine-glycine-asparaginezuur (RGD) gels met poreuze netwerken die ondersteuning bieden voor celgroei gedetailleerde en inflammatoire cel chemotaxis. 14 hoewel gepubliceerd PEG gebaseerde substraten verstrekt een realistischer model voor een menselijke ECM dan permeabele ondersteunt, veel van deze modellen zijn zeer dikke, met een diepte van ongeveer 775 µm die beperkt het vermogen dubbelgelaagde culturen maken met cel-cel contactpersonen. 14
Hier presenteren we een protocol voor de oprichting van een PEG polymeer gebaseerde BM mimic overwint veel van de beperkingen van de huidige cel dubbelgelaagde cultuur technologieën. Hebben we een templating methode waarin zinkoxide, een veel gebruikt materiaal voor de vervaardiging van microkristallijne productie, in het polymeer tijdens de synthese en crosslinking, dat vervolgens en selectief verwijderd is van de resulterende bulk polymeer. Dit proces genereert een willekeurige poreuze netwerk, het nabootsen van de porie van het moeizame en onderling verbonden netwerk van menselijke BMs. Verder kan de porositeit worden gewijzigd door het veranderen van de grootte en vorm van de zinkoxide microcrystals via wijziging van de reactie stoichiometrie tijdens de productie van de naald. De techniek ontwikkeld hier maakt u een uiterst dunne hydrogel die de dikte van een menselijke BM. ten slotte, de monteurs, de poreusheid bootst, en de biochemische samenstelling van deze BM-achtige constructies kan gemakkelijk worden veranderd voor het genereren van een communicatie die het meest vergelijkbaar met dat gezien in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lees Material Safety Data Sheet (MSDS) van alle materialen vooraf tijden om te gebruiken en veiligheidsmaatregelen op alle.
1. synthese van zinkoxide naalden
- Bereiden van 250 mL een 0,04 M Zn (3)2* 6 H2O-oplossing door het toevoegen van 2.9749 g van zink nitraat aan 250 mL water.
- 150 mL 1 M NaOH voorbereiden door 6 g NaOH aan 150 mL water toe te voegen.
- Instellen van een minerale oliebad op een hete plaat met roerder en een maatkolf van 500 mL ronde onderkant onderdompelen in het oliebad bij kamertemperatuur.
- Voeg 250 mL Zn (3),2* 6 H2O aan op de maatkolf en beginnen met het roeren van de reactie.
- Voeg 150 mL NaOH-oplossing (een witte neerslag zal kort vormen en dan verdwijnen als de twee oplossingen blijven mengen). Roer gedurende 2 uur ontdekt.
- Verhit de kolf tot 55-60 ° C en blijven roeren gedurende 24 uur.
- Zet van het vuur en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en roeren.
- Filtreer de oplossing op een Büchner trechter met een poriegrootte 11 µm en laten drogen overnachting, vanuit een ongedekte positie. Wanneer het koffiefilter niet langer nat van de gegoten oplossing is en een wit poeder heeft gevormd over de gaten van de trechter, worden de deeltjes volledig gedroogd.
- ZnO naalden verzamelen en voorbereiden van scanning elektronen microscopie (SEM) om te bevestigen de naald-achtige morfologie. Kort, mount carbon tape op een pin-stub en gebruik een metalen spatel om uitstrijkje de ZnO naalden op de koolstof-tape. Jas met 8 mm iridium bij een dichtheid van 22.4 g/cm3 sputter en verwerven van beelden op 10 kV.
2. toevoeging van opofferende zinklaag op Microscoop dia's voor HCl geïnduceerde Release van PEG
- Bereid zink acetaat oplossing door ontbinding 1.756 g van zink acetaat in 200 mL methanol.
- Schoon 3 "x 1" gewone Microscoop dia's met 70% ethanol en een disposable doekje. Laat lucht droog gedurende 10 minuten.
- Plaatsen van een 150-mm glas petrischaal op een warm bord en verwarm tot 150-160 ° C.
- Een glazen pipet met een pipet lamp, houdt het glas dia's met pincet en vacht glijbanen door 5 druppels van zink acetaat, vorming van een laagje verspreid op de dia toe te passen. Toestaan dat overtollige oplossing te druppelen terug in stock oplossing.
- Plaats de dia in de voorverwarmde petrischaal (150-160 ° C) met de zink acetaat gecoate zijde naar boven. Laat op de kookplaat gedurende 15 minuten.
- De dia verwijderen met een pincet en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. De dia wordt weergegeven om te worden bekleed met witte strepen.
- Verwijder alle overtollige zink, dat is nog op de dia's met een disposable doekje te verwijderen van prominente witte strepen. Het oppervlak moet uniform zijn.
- Bloot de de voorbereide dia's UV-licht in de kap van een bioveiligheid voor ten minste 1 uur om de steriliteit.
Let op: UV-licht is schadelijk voor de ogen en huid blootgesteld. Vermijd directe blootstelling aan oog- of huidletsel en elektrische voeding uitschakelen wanneer deze niet gebruikt.
3. bereiding van siliconen Isolators
- Gesneden siliconen blad in vierkanten van minder dan 1 "x 1" (isolators moeten kunnen passen in een 6-well schotel).
- 8-12 mm gaten in het midden van de vierkantjes met een biopsie punch Punch.
- Autoclaaf siliconen isolatoren voor 20 min bij 121.0 ° C en 1,12 kg/cm.
4. voorbereiding van PEG oplossing en PEG Gel synthese
Opmerking: Functionalization en polymerisatie van PEG is uitgebreid onderzocht en gedetailleerde eerder door ons lab en anderen. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
- De RGD cel zelfklevende peptide combineren met acryloyl-PEG-NHS in 50 mM natriumbicarbonaat (pH 8,5) bij een verhouding 1:1 molair om functionalization voor de amine terminus van de peptide met de acrylaat-groep, een biochemische reactie die eerder is geweest gekenmerkt om het rendement hoger is dan 85% efficiëntie. 17
- Voorbereiden foto-initiator door het mengen van 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone met 1-Vinyl-2-pyrrolidon bij een concentratie van 300 mg/mL.
- In aparte 1,5 mL buizen, weeg het volgende: 20 mg ZnO naalden, 12,5 mg PEG-DA en 2,5 mg PEG-RGD.
- Schorten 20 mg ZnO naalden in 270 µL van 10% FBS/PBS-oplossing; Vortex te mengen (ongeveer 15 s).
- Kort (< 1 s) draaien van de oplossing in een centrifuge benchtop mini om een ZnO-aggregaten aan de basis van de buis.
- 250 µL verzamelen vanaf de bovenkant van de ZnO-oplossing, om ervoor te zorgen dat de aggregaten op de onderkant van de buis blijven. Combineren met PEG-DA en PEG-RGD maken een PEG-oplossing met ongeveer 2,5 mM RGD. Vortex te mengen (ongeveer 15 s).
- Voeg 2 µL van acetofenon/n-vinyl-pyrrolidon foto-initiator en vortex kort te mengen (ongeveer 5 s).
- Voeg 20 µL van de polymeeroplossing langs het midden van de ZnO bedekt dia's toe.
- Langzaam lager een tweede dia op de top, met het gezicht van de coating ZnO down (de PEG oplossing moet tussen twee ZnO gecoate lagen). Proberen te voorkomen van de vorming van alle luchtbellen. Verplaats de dia's lateraal langs de hoofdas om eventuele luchtbellen te ontsnappen en te verspreiden van de oplossing voor een dun laagje. De meerderheid van de dia met de polymeeroplossing dekken. Maak een kleine overhang met de bovenste dia om ervoor te zorgen dat de dia's uit elkaar in latere stappen kunnen worden getrokken.
- Dwarslijn de dia's onder een 365 nm UV lamp (ongeveer 10 mW/cm2) gedurende 15 minuten.
5. vrijgave van PEG Gels uit glas dia 's
- Druk uitoefenen op de overhangende dia en handmatig trek die de twee dia's apart in een traag tempo in volgorde voorkomen barsten van de dia's. Laat de gels te drogen voor ten minste 5 min, of 's nachts.
- Leg de dia in een steriele 25 mm glas petrischaal en zachtjes giet de 1 M HCl-oplossing op de dia, met slechts genoeg ter dekking van de dia (ongeveer 10-20 mL). Zachtjes rock de petrischaal; de gel moet beginnen om te heffen van de dia wegslepen zoals de HCl de opofferende zink coating en naalden lost. Zodra de gel vrij van de dia is, giet u de HCl terug in de stamoplossing.
- Spoel de gel door zachtjes binnenstromen ongeveer 25 mL 1 x PBS de petrischaal totdat de dia en de gel zijn ondergedompeld.
6. het zaaien van cel Bilayers
- Voorbereiden op A549 cellen zaaien. Kort spoelen een 75 cm2 kolf met 5 mL 1 x PBS, voeg 3 mL van 0,25% trypsine-EDTA en laat zitten voor 2-3 minuten bij 37 ° C.
- Mechanisch doorroeren van de kolf, doven de reactie met 3 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Medium met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline-streptomycine en verzamelen in een conische kolf van 15 mL. Spoelen met een extra 4 mL van de volledige Dulbecco bewerkt Eagle Media en in hetzelfde conische verzamelen. Spin cellen bij 475 x g gedurende 6 min.
- Hoewel cellen zijn spinnen neer, voegt u een kleine daling van de volledige Dulbecco bewerkt Eagle Medium aan elk putje van de plaat van een 6-well. Gebruik pincet de isolators silicone met de gels overbrengen naar de nieuwe plaat van de 6-well, zodanig dat de gel op de daling van de media rust. Nu dat gels zijn verspreid in een dun laagje, controleren om ervoor te zorgen dat er geen grote gaten zichtbaar voor het oog zijn. Dit moet gebeuren vóór cel zaaien Voorkom drogen en barsten van de gels.
- Resuspendeer de cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium met 10% foetale boviene serum en 1% penicilline-streptomycine met een concentratie van 6 x 105 cellen/mL. Voeg de cel schorsing druppel wijze naar het midden van de gel, proberen te houden een meniscus geponste uit inzake het siliconen-membraan. Cellen te houden gedurende 4 uur toestaan.
- Na 4 uur, Voeg 0,5 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Complete Medium naar de waterput en na een nacht bebroeden bij 37 ° C te voorzien in volledige hechting.
- De volgende dag, voorbereiden HUVECs cel zaaien.
- Spoel de kolf met een 75 cm-2 met 5 mL 1 X PBS, voeg 3 mL van 0,25% trypsine-EDTA en laat zitten voor 2-3 minuten bij 37 ° C.
- Mechanisch doorroeren van de kolf, doven de reactie met 3 mL M199 media met de foetale runderserum 20%, 1% penicilline-streptomycine en 1% groei supplement en verzamelen in een 15-mL kegelvormig.
- Spoel met 4 mL M199 volledige media en in hetzelfde conische verzamelen. Spin cellen bij 475 x g gedurende 6 min.
- Terwijl cellen zijn spinnen neer, toevoegen een kleine daling van volledige medium 199 aan elk putje in een nieuwe 6-well-plaat. Plaats een nieuwe siliconen isolator in de put met de daling van de media in het midden van de siliconen.
- De siliconen isolator ter ondersteuning van de PEG gel met A549 cellen op de isolator in de nieuwe 6-well plaat met pincet, zorgvuldig worden gespiegeld.
- Resuspendeer HUVECs bij een concentratie van 6 x 105 cellen/mL en voeg de celsuspensie naar het midden van de daling van de gespiegelde gel verstandig, proberen te houden een meniscus op de gel binnen het geponste uit het siliconen-membraan. Toestaan dat cellen te houden gedurende 2 uur.
- Na 2 uur zachtjes Voeg 2 mL M199 volledige media aan elk putje.
7. immunofluorescentie
- Zorgvuldig Verwijder medium van de gel met een handmatige pipet en voeg ongeveer 500 µL van 4% paraformaldehyde (PFA) naar het midden van de gel waar de cellen worden overgeënt. Laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zitten.
Let op: PFA is een giftige chemische stof; dragen van bescherming en zorgen voor behandeling wordt gedaan in een biologische veiligheidskast. - Verwijder de PFA voorzichtig en ongeveer 500 µL van 2% BSA in PBS toevoegen aan elke gel. Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur zitten.
- Verwijder voorzichtig de BSA. Bereiden van primaire antilichamen bij een verdunning 1:100 in 2% BSA in PBS en 500 µL toevoegen aan elke gel. Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur zitten. Spoel zachtjes met 500 µL van 1 x PBS.
- Herhaal hetzelfde proces met de secundaire antilichamen. Gebruiken na antilichamen: 1) anti-menselijke CD144 (VE-cadherine) kloon 16B1; 2) anti-menselijke CD324 (E-cadherine) kloon 6714; 3) anti-menselijke CD31 (PECAM-1) kloon C-20; 4) anti-A549; 5)-antimuis FITC; 6) anti-geit Alexa Fluor 647. Om te visualiseren F-actine, voeg 500 µL van Phalloidin (10 µg Fe/mL in PBS) voor 20 min.
- Verwijder voorzichtig secundaire antilichamen of phalloidin en het toevoegen van 500 µL van de DAPI (0,1 µg/mL) voor 20 min. Verwijder voorzichtig DAPI oplossing en 1,5 mL 1 x PBS aan elk putje voorzichtig toe te voegen zodat gels in suspensie zijn.
- Met behulp van pincet en siliconen isolatoren, overbrengen in een gel een glasplaatje. Doe dit voor elke gel onmiddellijk vóór imaging en gels in PBS oplossing vervangen na imaging.
- Als alternatief, monteren met behulp van een medium van de montage DAPI gels. Zegel goed de monsters met nagellak, verwerven van beelden binnen 2 dagen drogen en barsten van de gel te voorkomen. Zie tabel 1 voor probleemoplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PEG-RGD hydrogels werden gevormd door sodat het polymeeroplossing tussen twee opofferende zinkoxide lagen en het creëren van porie sjablonen met zinkoxide naalden. Offer zinkoxide onderdelen werden vervolgens verwijderd met zoutzuur, het genereren van uiterst dunne PEG hydrogels met continue poriën (Figuur 1). De morfologie van zinkoxide naalden werd bevestigd door het scannen van elektronen microscoop (SEM), en de gemiddelde lengte en breedte werden bepaald 3.92 ± 0.089 µm en 0,43 ± 0,02 µm, respectievelijk (Figuur 2A - 2B). Na de verwijdering van zinkoxide naalden, de poriën hydrogel waren gevisualiseerd door SEM en gekenmerkt (Figuur 2C - 2E). De dichtheid van de gemiddelde porie voor hydrogels was 176,863 ± 49,532 poriën. SEM werd ook gebruikt om te visualiseren en berekenen van de dichtheid van de porie van een standaard 3 µm porie polycarbonaat doorlaatbare steun invoegen, en de dichtheid van de porie bleek aanzienlijk lager, met ongeveer 2,51 ± 0,05 poriën per vierkante mm (Figuur 2D, Tabel 2). De gemiddelde porie diameter in het zinkoxide templated PEG hydrogel was 0,19 ± 0,01 µm en aanzienlijk kleiner zijn dan de 3,47 ± 0.21 µm poriën waargenomen in de doorlaatbare steun invoegen (Figuur 2E, tabel 2). Optische coherentie tomografie werd gebruikt te verwerven beide 2 - en 3-dimensionale beelden en te bepalen van de dikte van de hydrogels drijvend in 1 x PBS (Figuur 3A - 3B). De gemiddelde gel dikte was 18.89 ± 3,47 µm (tabel 2). Gel mechanica werden eveneens beoordeeld door het meten van de elasticiteitsmodulus, zoals hiervoor is beschreven, en de gemiddelde Youngs modulus bleek te zijn 96.78 23.92 kPa (tabel 2). 14
Immunofluorescentie microscopie toont aan dat zowel de endotheliale cellen en de epitheliale cellen hun fenotypische identiteit behouden na wordt gekweekt op uiterst dunne PEG-RGD hydrogels. Endotheliale cellen onderhouden expressie van PECAM-1 en epitheliale cellen gekleurd positief met een anti-A549 antistof (Figuur 4A - 4B). Beide celtypen onderhield ook de mogelijkheid om te vormen van de strakke kruispunten. Endotheliale cellen uitgesproken VE-cadherine op de kruispunten van de cel-cel en epitheliale cellen uitgedrukt E-cadherine (Figuur 4C - 4 D). De hydrogels PEG-RGD ook cellulaire bilayers ondersteunen, en zorgen voor cel-cel contacten te vormen binnen de poreuze structuren, zoals blijkt door immunefluorescentie beeldvorming van phalloidin monsters (Figuur 4E) gekleurd.
Figuur 1 . Schematisch overzicht van Hydrogel voorbereiding Protocol. A) synthese en verzameling van ZnO naalden. B) voorbereiding van glas dia's; oprichting van een offer ZnO-laag. C) voorbereiding en sterilisatie van siliconen isolatoren. D) voorbereiding PEG oplossing met ZnO naalden. E) polymerisatie PEG gels tussen ZnO gecoat glas dia's. Witte lijnen geven de opofferende ZnO naalden en coatings. F) HCl spoelen voor de verwijdering van naalden en vrijlating van gel uit dia's. Donkere lijnen vertegenwoordigen poriën gemaakt door opgeloste ZnO naalden. G) overdracht van gels en siliconen isolatoren aan 6-well schotel te bereiden voor het zaaien van de cel. H) cel zaaien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Karakterisering van de naald en Hydrogel porositeit van zink. A) SEM-beeld van zink naalden (schaal bar 5 µm). B) lengte en breedte van zink naalden. Stippen vertegenwoordigen metingen voor individuele naalden; lijnen geven de gemiddelde en standaardafwijking. C) SEM-beeld van poreuze hydrogel (schaal bar 2 micron). D) porie dichtheid en E) gemiddelde porie diameter voor polycarbonaat permeabele ondersteunt en PEG hydrogels. De staven gemiddelde en standaardafwijking. p < 0,0001 via T-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Hydrogel dikte. Optische coherentie tomografie toont A) 3-dimensionale en B) 2-dimensionale beelden van de hydrogels drijvend in PBS. Pijlen vertegenwoordigen vloeistofoppervlak, sterretje vertegenwoordigt hydrogel. De bar van de schaal is 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Hydrogels ondersteuning enkelgelaagde en dubbelgelaagde cultuur. Beide endotheliale cellen en epitheliale cellen kunnen vormen van confluente monolayers op PEG hydrogels, zoals aangetoond door fluorescerende kleuring voor A) CD31 (CD31 rood, DAPI blauw) en B) A549 (A549 rood, DAPI blauw), respectievelijk. Vorming van intact cadherine kruispunten worden gedemonstreerd voor C) endotheliale cellen (VE cadherine groen, DAPI blauw) en D) epitheliale cellen (E cadherine groen, DAPI blauwe) (schaal bars 100 micron). E) twee voorbeelden van cellulaire bilayers worden aangetoond door phalloidin kleuring (phalloidin rood, DAPI blauwe) (schaal bars 10 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Probleem | Mogelijke oplossing |
| Gelen hebben grote gaten. | Zorg ervoor dat zink naalden voldoende zijn afgebroken voordat u ze gebruikt. |
Tabel 1. Voorgestelde oplossingen voor het oplossen van problemen.
| Hydrogel | Transwell | Extracellulaire Matrix | |
| Porie dichtheid (poriën/mm2) | 1,77 x 105 ± 4.9 x 104 | 2,51 ± 0,05 | 8,50 x 102 7.0 x 104 2,14 |
| Poriëngrootte (µm) | 0,19 ± 0,01 | 3.47 ± 0.21 | 0.47 aan 3.86 2,14 |
| Dikte (µm) | 18.89 ± 3,47 | 10 | 0,05 tot 0.10 17 |
| Youngs modulus (kPa) 5 | 96.78 ± 23.92 | > 1000 | 3.5 14 |
Tabel 2. Vergelijking van de eigenschappen van de Hydrogel permeabele standaardondersteuning invoegen en extracellulaire Matrix (waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaardafwijking)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier gedetailleerde heeft ons maken een afstembare PEG hydrogel om te dienen als een biomimetische BM steiger toegestaan. In het bijzonder door verschillende PEG molecuulgewichten, peptide vervoeging strategieën, en zinkoxide microkristallijne structuren of concentraties, de elasticiteitsmodulus, kunnen biochemische eigenschappen en poreuze structuur van de hydrogels worden gewijzigd, respectievelijk. De uiterst dunne PEG steiger beschikt over een hogere dichtheid van de poriën en een kleinere diameter van de porie thats meer mimetische van de functies van in vivo kelder membranen, vergeleken met een standaard doorlaatbare steun model (tabel 2). Via deze methode hebben wij verder, een uiterst dunne structuur bereikt met een gemiddelde dikte van minder dan 20 µm. Terwijl de polycarbonaat doorlaatbare steun modellen reeds een uiterst dunne laag van slechts 10 µm, om onze kennis bereikt hebben, is dit het eerste zwevende en afstembare hydrogel systeem om deze dikte. Tot slot, de PEG hydrogels hebben een elasticiteitsmodulus van ongeveer 100 kPa, oftewel ordes van grootte minder stijf dan traditionele permeabele ondersteunt, weefselkweek plastic en glas, die hebben allemaal elastische moduli in het bereik van GPa, en daarom zijn meer vergelijkbaar met de lage (< 10 kPa) elasticiteitsmodulus van in vivo extracellulaire matrix (tabel 2).
Bereiken van een laag elasticiteitsmodulus was een van de primaire doelen van het hier gepresenteerde werk, en is een beperking op het gebruik van traditionele polycarbonaat doorlaatbare steun modellen. Het is algemeen bekend dat substraat stijfheid cel gedrag kunt dicteren, en werk is gebleken dat de stijfheid van het substraat cellulaire lot van differentiatie van cellen kan begeleiden. 12 stijve substraten worden ook vaak gebruikt om na te bootsen ziekte staten, met inbegrip van fibrotische weefsel of kanker tumoren, en daarom zijn niet nauwkeurig vertegenwoordiger van gezonde weefsels. 18 , 19 , 20 , 21 om zwakke cellulaire fenotypes en functies te bestuderen, is het cruciaal voor het gebruik van substraten die een elasticiteitsmodulus thats relevante in vivona te bootsen. Een van de grote voordelen van dit systeem is de mogelijkheid om af te stemmen op de mechanica van de gel, die kan worden bereikt met behulp van PEG met verschillende molecuulgewicht. Zoals vele ziekten gekoppeld aan ECM verstijving zijn, biedt dit systeem een biomimetische platform voor het bestuderen van de effecten van gezonde versus zieke BM op cel functie. Verdere wijziging van dit systeem kan ook worden bereikt door een wijziging van het fragment van de peptide opgenomen voor cel adhesie. Voor de doeleinden van deze studie, werd RGD gebruikt als gevolg van de alomtegenwoordige expressie in vele BM eiwitten en zijn vermogen om stevige cel bijlage. Naast RGD, kunnen laminin fragmenten ook worden opgenomen ter bevordering van de laminin-epitheliale interacties die apicale-basale cel polarisatie begeleiden. 1 net zoals de BM stijfheid wordt gewijzigd in ziekte, is de samenstelling van het membraan kelder gerenoveerd in pathologische condities. Met behulp van de amine-reactieve PEG-NHS voorloper, is het mogelijk om een verscheidenheid van peptides en proteïnen aan de PEG polymeer base conjugaat. 11 , 14 , 15 dit is vooral gunstig voor het onderzoeken van de effecten van integrine engagement voor verschillende integrine receptoren. Bijvoorbeeld, de RGD-volgorde die wordt uitgedrukt in fibronectin en collageen bezighoudt meerdere verschijnsel, maar heeft een hoge specificiteit voor integrine-αvβ3. Als u wilt specifiek een rijke substraat van fibronectine na te bootsen, de leucine-aspartic acid-valine (LDV) volgorde kan worden opgenomen om deel te nemen α4β1, of om na te bootsen van een collagene membraan, asparaginezuur-glycine-glutaminezuur zuur-alanine (DGEA) konden worden toegevoegd aan het betrekken van integrine Α2Β1. 8
Endotheliale-epitheliale bilayers zijn slechts één voorbeeld van een cellulaire dubbelgelaagde die kan worden gemaakt met het gepresenteerde model. Andere bilayers die bestaan natuurlijk in vivo, gescheiden door slechts een dunne BM of ECM, omvatten endotheel-pericyte en endotheel-gladde spier cel bilayers. Dus, de toepassingen voor deze methode zijn breed en verlengen van pulmonaire geneeskunde tot vasculaire biologie. Verder, vanwege de unieke porositeit van deze hydrogels, ze bieden de mogelijkheid om functionele studies die vorige hydrogel modellen zijn niet geweest kundig voor steun te verrichten. Door het opnemen van poriën in ons systeem uiterst dunne hydrogel, hebben we een uitgebreide biomimetische vervanger voor doorlaatbare steun modellen, waardoor het onderzoek naar bacteriële infiltratie, een gemeenschappelijk optreden over de pulmonaire epitheliale-endothelial barrière in tuberculose. 3 , 6 , 14 , 22 ook transmigratie of chemotaxis van ontstekingscellen over vasculaire celculturen kan worden onderzocht door het meten van de snelheid van cel vangen op de RGD matiemaatschappij zelfklevende celoppervlak van de gel, zoals eerder is aangetoond. 16 dit is een duidelijk voordeel ten opzichte de vorige hydrogel gebaseerde methoden die mede kweekomstandigheden via inkapseling hebben bereikt. Dergelijke systemen voorzien van nabijheid en cel-cel contact tussen twee celtypes en geslaagd voor het meten van de functies zoals angiogenese en vasculogenese, maar gebrek aan de toegankelijkheid aangeboden door twee-dimensionale systemen, waarmee een veel eenvoudigere platform voor het meten van de lek, infiltratie of actieve migratie over een mede gekweekte cellulaire barrière. 17
Dus de methode hier gedemonstreerd biedt een platform voor een breed scala van studies over meerdere velden, en biedt een opstapje naar het genereren van meer relevante gegevens uit in vitro studies verder begrijpen in vivo pathologieën en mechanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Prof. Paul Van Tassel en Prof. Chinedum Osuji voor hun doordachte gesprekken en materiaalkunde expertise. Financiering voor dit werk werd verzorgd door de Dubinsky nieuwe initiatief Award en de nationale instituten van gezondheid NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
