Summary
המודלים הנוכחיים של תרבות bilayer אינן מאפשרות לימודים פונקציונלי במבחנה המחקים ויוו microenvironments. שימוש בפוליאתילן גליקול שיטה תבניות תחמוצת אבץ, פרוטוקול זה מתאר את התפתחות קרום המרתף ביונים ודק במיוחד עם נוקשות tunable, נקבוביות, והרכב ביוכימי המחקה באופן הדוק ויוו מטריצה חוץ-תאית.
Abstract
קרום המרתף הוא מרכיב קריטי bilayers הסלולר שעשוי להשתנות נוקשות, קומפוזיציה, אדריכלות, נקבוביות. באופן מסורתי, מחקרים במבחנה של אנדותל-אפיתל bilayers צריכים לסמוך על תמיכה חדיר דגמים המאפשרים bilayer תרבות, אך תומך חדיר מוגבלים ביכולתם לשכפל את המגוון האנושי ממברנות במרתף. לעומת זאת, מודלים הידרוג הדורשים סינתזה הם מאוד tunable וגם מאפשרים שינויים של הקשיחות גשמי והן את ההרכב הביוכימי באמצעות התאגדות של פפטידים ביונים או חלבונים. עם זאת, מודלים מסורתיים הידרוג מוגבלים בפונקציונליות בשל העדר הנקבוביות עבור אנשי קשר תא-תא ולימודי פונקציונלי במבחנה ההעברה. בנוסף, בשל עובי hydrogels המסורתי, התאגדות של הנקבוביות המתפרסים על פני כל עובי hydrogels כבר מאתגר. במחקר הנוכחי, אנו משתמשים hydrogels poly-(ethylene-glycol) (PEG), שיטה תבניות תחמוצת אבץ הרומן לפנות את החסרונות הקודם של hydrogels הביוני. כתוצאה מכך, אנו מציגים הידרוג ודק במיוחד, כמו קרום המרתף המתיר את התרבות של confluent bilayers הסלולר על גרדום להתאמה אישית עם ארכיטקטורות נקבובית משתנה, תכונות מכניות של ההרכב הביוכימי.
Introduction
מטריצה חוץ-תאית (ECM) מהווים פיגומים חלבון לתמוך התא מצורף, לשמש המחסומים בין סוגי תאים נפרדים, הם מרכיב חיוני של מורכבות רקמות ואיברים. בניגוד בין-תאי רקמת חיבור, קרום המרתף (מוניטור) היא סוג מיוחד של ה-ECM זה משמש כמחסום כדי לחלק את רקמת תאים אחד מהשני. עב מ עבה כ 100 מיקרומטר, ולכן מאפשרים תקשורת ישירים ועקיפים בין התאים משני צדדיו. שתי דוגמאות נפוצות של עב מ עב מ כלי דם, נמצא בקיר microvascular בין pericytes לבין תאי אנדותל, הינם דרכי הנשימה BMs שנמצאו בין תאי אנדותל ואפיתל. עב מ לשמש תפקיד חשוב בוויסות תא בפונקציה, כגון תא קוטביות והעברה, על בריאות ומחלה. 1 הרכב, נוקשות, אדריכלות, ואת נקבוביות BMs משתנה על פני מערכות איברים כדי להקל על פונקציות פיזיולוגיות שונות. לדוגמה, מוניטור הנקבוביות הם קריטיים עבור שמירה על תקשורת, מולקולה מסיסים דיפוזיה, ועבור נדידה של תאים חיסוניים במהלך דלקת או חיידקים במהלך זיהום. את דרכי הנשימה, נקבוביות span עובי ויטביע, מלא עם קטרים ועד 0.75 3.86 מיקרומטר.2
מהות דק ויטביע מבטיחה כי למרות סוגי תאים מופרדים פיזית אחד מהשני, תקשורת המערכת באמצעות paracrine וצור קשר-בתיווך איתות נשמר. לפיכך, ללמוד מחלות אנושיות במבחנה, חוקרים צריכים לסמוך על תמיכה חדיר נקבובי מוסיף את התרבות התאית bilayers. 3 מודלים אלה היו קריטיים להבנת התקשורת הסלולרית ממלאת תפקיד מחלה ובריאות. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 הוספת תמיכה חדיר לספק את הדרישות הבסיסיות בנושא הבנת איך איתות התא-התא מווסת תהליכים פיזיולוגיים, כגון גיוס ליקוציט חדירת חיידקים; עם זאת, התוספות יש מגבלות משמעותיות, להיכשל לחקות תמיכה BM. Permeable האדם מוסיף חוסר tunability מכני וגם הביוכימי, ואת המבנה הנקבובי פשטנית אינה מחקה את מבנה סיבי שיוצר את הנקבוביות לא סדיר אופייני של עב מ. לכן, יש צורך הולך וגדל עבור מערכות tunable יכולים לשחזר את המאפיינים מוניטור יליד להשפיע על תהליכים תאיים.
מצעים מבוסס פולימר הם מועמדים אידיאליים לפיתוח ביונים BMs ללמוד bilayers הסלולר בהקשר המחקה באופן הדוק יותר על הסביבה ויוו . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 פולימרים הם tunable באופן מכני, יכול להיות שונה מבחינה כימית לשלב ביונים פפטיד שברי. 11 , 12 , 13 bioinert פולימר פוליאתילן גליקול (PEG) ניתן להשתמש כדי לבנות ביונים BMs ולאחר עבודה מפורט הסינתזה של ג'לים ארגינין-גליצין-אספרטית (RGD) פג tunable באופן מכני עם רשתות נקבובי התומכים צמיחת תאים כימוטקסיס תאים דלקתיים. 14 למרות שפורסם מבוססי פג מצעים מסופקים דגם מציאותית יותר של ECM האנושי מאשר תומך חדיר, רבים של מודלים אלה הם עבות במיוחד, עם עומק של מיקרומטר בערך 775 אשר מגביל את היכולת ליצור bilayer תרבויות עם תא-תא אנשי קשר. 14
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת פג מבוסס פולימר מוניטור לחקות מתגבר על רבים מן המגבלות הטכנולוגיות תרבות bilayer התא הנוכחי. פיתחנו שיטה תבניות מובהקים תחמוצת אבץ, החומר בשימוש נרחב לייצור של ייצור שעוות, הפולימר במהלך הסינתזה crosslinking, אשר לאחר מכן, באופן סלקטיבי מוסר פולימר וכתוצאה מכך בצובר. תהליך זה יוצר רשת נקבובי אקראי, מחקה נקבובית שקבל ובעלת רשת BMs אנושי. עוד, ניתן לשנות את נקבוביות על-ידי שינוי הגודל והצורה של microcrystals תחמוצת אבץ באמצעות שינוי של סטויכיומטריה התגובה במהלך הייצור המחט. הטכניקה שפותחה כאן יוצרת של הידרוג זגוגית המחקה את העובי של BM. האנושי ולבסוף, המכונאים, את נקבוביות ולא ניתן לשנות את ההרכב הביוכימי של אלה בונה כמו מוניטור בקלות לייצר microenvironment ביותר דומה כי ראיתי ויוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אנא קרא חומר בטיחות נתונים בגיליון (MSDS) של כל החומרים מראש להשתמש ולהשתמש זהירות בכלל פעמים.
1. סינתזה של תחמוצת אבץ מחטים
- להכין 250 מ של Zn (3) 0.04 מ'2* 6-אייץ ' פתרון2O על-ידי הוספת 2.9749 גר' אבץ חנקתי 250 מ של מים.
- להכין 150 מ ל 1 M NaOH על-ידי הוספת 6 גר' NaOH 150 מ ל מים.
- להגדיר אמבט שמן מינרלי על פלטה חמה עם בחישה, להטביע בקבוקון התחתון עגול 500-mL לאמבטיה שמן בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 250 מ של Zn (3)2* 6-אייץ '2O הבקבוקון ולהתחיל לערבב את התגובה.
- להוסיף 150 מ"ל NaOH פתרון (התמיסה לבן טופס לזמן קצר ולאחר מכן נעלמים כמו שני פתרונות להמשיך לערבב). מערבבים במשך 2 h חשפו.
- מחממים את הבקבוק עד 55-60 ° C ולהמשיך ערבוב במשך 24 שעות ביממה.
- לכבות את האש ולאפשר לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב.
- לסנן את הפתרון על משפך ביכנר עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 11 ולאפשר להתייבש לילה, חשפו. כאשר נייר הסינון הוא כבר לא רטוב מהפתרון יציקת אבקה לבנה הקימה החורים משפך, החלקיקים הם יבשים לחלוטין.
- לאסוף ZnO מחטים והכן לסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) כדי לאשר את המורפולוגיה דמויי מחטים. בקצרה, הר פחמן הקלטת על גדם pin ולהשתמש מרית מתכת להכפיש את המחטים ZnO על הקלטת פחמן. להתיז את המעיל עם 8 מ"מ אירידיום-צפיפות של 22.4 גרם/ס"מ3 ו לרכוש תמונות ב-10 kV.
2. תוספת של אבץ ההקרבה שכבה על שקופיות מיקרוסקופ על HCl המושרה שחרורו של פג
- להכין אבץ אצטט פתרון על ידי המסת 1.756 גר' אבץ אצטט ב 200 מ של מתנול.
- לנקות 3 "פרק 1" שקופיות מיקרוסקופ רגיל עם 70% אתנול וביו -מחיקה חד פעמית. לאפשר לאוויר יבש למשך 10 דקות.
- במקום כוס 150-מ מ על גבי צלחת חמה צלחת פטרי ומחממים ל 150-160 מעלות צלזיוס.
- באמצעות pipet של זכוכית עם נורת pipet, החזק בשקופיות זכוכית עם פינצטה והמעיל השקופיות על-ידי החלת 5 טיפות אצטט אבץ, ויוצרים שכבה דקה התפזרו על השקופית. לאפשר פתרון עודף לטפטף בחזרה לתוך פתרון מניות.
- מקם את השקופית בצלוחית הפטרי מחומם מראש (150-160 מעלות צלזיוס) עם הצד אצטט מצופה אבץ פונה כלפי מעלה. יוצאים על פלטת הבישול למשך 15 דקות.
- הסר את השקופית עם פינצטה ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר. השקופית יופיע כדי להיות מצופה עם פסים לבנים.
- הסר כל עודף אבץ שנותר בשקופיות באמצעות מחיקה חד פעמית להסרת בולטים פסים לבנים. המשטח צריך להיות אחיד.
- לחשוף השקופיות מוכן ל UV אור בשכונה אבטחה לפחות שעה על מנת להבטיח עקרות.
התראה: אור UV מזיקה לעיניים, עור חשוף. להימנע מחשיפה ישירה העיניים או העור, לבטל את אספקת חשמל כאשר לא בשימוש.
3. הכנת נייר תרמי סיליקון
- גיליון סיליקון לחתוך לתוך הריבועים של פחות מ 1 "פרק 1" (נייר תרמי חייב להיות מסוגל להשתלב מנה 6-טוב).
- מנקבים חורים 8-12 מ מ במרכז הריבועים עם אגרוף ביופסיה.
- אוטוקלב נייר תרמי סיליקון עבור 20 דקות ב- 121.0 ° C ו- 1.12 ק"ג/cm.
4. הכנת פתרון פג, פג סינתזה ג'ל
הערה: Functionalization פלמור של פג יש כבר בהרחבה חקר, מפורט בעבר על ידי המעבדה שלנו ואחרים. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
- לשלב את RGD תא פפטיד דבק עם acryloyl-פג-NHS ב 50 מ מ סודיום ביקרבונט (pH 8.5) ביחס 1:1 שן טוחנת כדי לאפשר functionalization של התחנה הסופית אמין של פפטיד עם moiety אקרילט, תגובה ביוכימית כי כבר בעבר מאופיין להניב גדול מ- 85% יעילות. 17
- הכן צילום-יוזם על ידי ערבוב 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone עם 1-ויניל-2-pyrrolidone-ריכוז של 300 מ"ג/מ"ל.
- ב להפריד 1.5 mL צינורות, שוקל את האפשרויות הבאות: 20 מ ג של מחטים ZnO, 12.5 מ"ג של פג-DA ו- 2.5 מ"ג של פג-RGD.
- להשעות 20 מ ג של מחטים ZnO ב 270 µL של 10% FBS/PBS פתרון; מערבולת לערבב (כ 15 s).
- בקצרה (< 1 s) לסובב את הפתרון ב צנטריפוגה מיני benchtop להביא כל אגרגטים ZnO לבסיס של הצינור.
- איסוף 250 µL מהחלק העליון של הפתרון ZnO, כדי להבטיח כי אגרגטים נשארים בתחתית הצינורית. לשלב עם פג-DA ו- PEG-RGD כדי ליצור פתרון פג עם-2.5 מ מ RGD. מערבולת לערבב (כ 15 s).
- להוסיף 2 µL של pyrrolidone acetophenone/n-ויניל צילום-יוזם, מערבולת בקצרה כדי לערבב (כ 5 s).
- הוסף 20 µL של הפתרון פולימר לאורך מרכז השקופיות ZnO מצופה.
- הורידו לאט בשקופית השנייה למעלה, עם הפנים ציפוי ZnO למטה (הפתרון פג צריך להיות בין שתי שכבות ZnO מצופה). לנסות למנוע היווצרות של בועות אוויר. להעביר את השקופיות רוחבית לאורך הציר רס ן כדי לאפשר בועות כדי לברוח, כדי להפיץ את הפתרון שכבה דקה. מכסים את רוב השקופית עם הפתרון פולימר. צור הסככה קלה של השקופית העליונה כדי להבטיח כי השקופיות יכול הנוצה בשלבים מאוחר יותר.
- Crosslink השקופיות תחת מנורה nm UV 365 (כ 10 mW/cm2) למשך 15 דקות.
5. שחרור של פג ג ' לים משקופיות זכוכית
- הפעילו לחץ שקופיות לראשיכם, באופן ידני משיכה שבין שתי השקופיות בנפרד בקצב איטי על מנת למנוע סדיקה השקופיות. לאפשר את ג'לים יבש למשך 5 דקות לפחות, או למשך הלילה.
- הכנס את השקופית זכוכית סטריליים 25 מ מ פטרי ויוצקים בעדינות את הפתרון HCl 1 מ' על גבי השקופית, שימוש רק מספיק כדי לכסות את השקופית (כ 10-20 מ"ל). בעדינות רוק הפטרי; הג'ל צריך להתחיל להרים מחוץ לשקופית כמו HCl ממיס את ההקרבה ץבא ומחטים. ברגע הג'ל אינו חושף השקופית, שופכים HCl בחזרה לתוך הפתרון מניות.
- יש לשטוף את הג'ל על ידי בעדינות לשפוך כ 25 מ ל 1 x PBS לתוך הפטרי עד שקופית של ג'ל טובע.
6. זריעת תא Bilayers
- היכונו זריעת תאי A549. בקצרה, לשטוף בקבוקון2 75 ס מ 5 מ של 1 x PBS, להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ולתת לשבת למשך 2-3 דקות ב 37 º C.
- מכנית להתסיס את הבקבוק, להרוות את התגובה של 3 mL Dulbecco ששינה נשר בינונית עם 10% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין, לאסוף לתוך בקבוקון חרוט 15-mL. לשטוף עם אוטם 4 נוספים של מדיה נשר שונה של Dulbecco מלאה ולאסוף באותה חרוט. לסובב תאים ב g x 475 במשך 6 דקות.
- בעוד התאים מתחילים להסתובב למטה, להוסיף טיפה קטנה של בינוני נשר שונה של Dulbecco מלאה כל טוב של צלחת 6-. טוב. להשתמש פינצטה כדי להעביר את נייר תרמי סיליקון עם ג'לים המשקולת חדש 6-ובכן, כך הג'ל הוא נח על המסירה של מדיה. שכעת ג'לים מתפשטים לתוך שכבה דקה, בדוק כדי לוודא כי ישנם חורים גדולים אין לעין. זה צריך להיעשות מיד לפני תא seeding כדי למנוע התייבשות וסדקים היחסי של ג'ל.
- Resuspend תאים של Dulbecco ששינה נשר בינוני עם 10% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין-ריכוז של 6 x 105 תאים/מ ל.... הוסף הירידה התליה תא חכם למרכז של הג'ל, מנסה לשמור על מניסקוס באזור מנוקב החוצה של קרום סיליקון. לאפשר תאים לדבוק במשך 4 שעות.
- לאחר 4 שעות, להוסיף 0.5 מיליליטר ששינה נשר שלם בינוני של Dulbecco הבאר, דגירה בין לילה ב 37 ° C כדי לאפשר הדבקה מלאה.
- למחרת, להכין HUVECs תא זריעה.
- לשטוף את בקבוקון2 75 ס מ 5 מ של 1 X PBS, להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ולתת לשבת למשך 2-3 דקות ב 37 º C.
- מכנית להתסיס את הבקבוק, להרוות את התגובה עם 3 מ"ל M199 מדיה עם סרום שור עוברית 20%, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, תוספת של 1% צמיחה, לאסוף לתוך 15-mL חרוט.
- לשטוף עם 4 מ"ל של התקשורת מלאה M199 ולאסוף באותה חרוט. לסובב תאים ב g x 475 במשך 6 דקות.
- בעוד התאים מתחילים להסתובב למטה, להוסיף טיפה קטנה של שלם בינוני 199 מכל קידוח לתוך צלחת. ובכן 6 חדשים. המקום isolator סיליקון חדשים בבאר עם טיפת מדיה במרכז שהסיליקון.
- בזהירות באמצעות פינצטה, להעיף את isolator סיליקון תמיכה הג'ל פג עם תאים A549 על גבי isolator בצלחת. ובכן 6 חדשים.
- Resuspend HUVECs-ריכוז של 6 x 105 תאים למ"ל ולהוסיף התליה תא למרכז האיסוף הפוך ג'ל חכם, מנסה לשמור על מניסקוס על הג'ל בתוך שטח מנוקב החוצה של קרום סיליקון. מאפשרים לתאים ולהתבטא כבר שעתיים.
- לאחר 2 h, בעדינות להוסיף 2 מ"ל של M199 מדיה מלאה בכל טוב.
7. immunofluorescence
- בזהירות להסיר מדיה ג'לים עם פיפטה ידנית ולהוסיף כ 500 µL של 4% paraformaldehyde (PFA) למרכז של הג'ל בו התאים אינם נזרע. תן לשבת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
התראה: PFA הוא כימיקל רעיל; להשתמש באמצעי מניעה ולהבטיח טיפול מתבצעת על בטיחות ביולוגית בארון. - בזהירות להסיר את כדורגלן ולהוסיף כ 500 µL של BSA 2% ב- PBS כל ג'ל. תן לשבת לשעה בטמפרטורת החדר.
- הסר בזהירות BSA. הכנת נוגדנים הראשי לדילול בטחונות ב- BSA 2% ב- PBS, ומוסיפים 500 µL כל ג'ל. תן לשבת לשעה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף בעדינות עם 500 µL ל- 1 x PBS.
- חזור על התהליך אותו עם נוגדנים משניים. השתמש בעקבות נוגדנים: 1) נגד האדם CD144 16B1 שיבוט (VE-קדהרין); 2) האנטי-האדם CD324 (E-קדהרין) שיבוט 6714; 3) האנטי-האדם CD31 (PECAM-1) שיבוט C-20; 4) אנטי-A549; 5) אנטי-העכבר FITC; 6) נגד עז אלקסה עבור חיל הים 647. כדי להמחיש F-אקטין, להוסיף 500 µL של Phalloidin (10 µg/mL ב- PBS) במשך 20 דקות.
- בזהירות להסיר נוגדנים משניים או phalloidin ולהוסיף 500 µL של דאפי (0.1 µg/mL) במשך 20 דקות בזהירות להסיר את דאפי פתרון ולהוסיף בעדינות 1.5 מ ל 1 x PBS טוב כל כך ג'לים ההשעיה.
- באמצעות נייר תרמי פינצטה, סיליקון, להעביר ג'ל אחד זכוכית. את זה. כבר כל הג'ל מיד לפני הדמיה, ולהחליף ג'לים בתוך תמיסת PBS לאחר דימות.
- לחלופין, לטעון ג'לים בעזרת אמצעי הרכבה דאפי. לאטום היטב את הדגימות עם לק, לרכוש תמונות תוך יומיים כדי למנוע התייבשות וסדקים של הג'ל. עיין טבלה 1 לפתרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פג-RGD hydrogels נוצרו על-ידי sandwiching הפתרון פולימר בין שתי שכבות תחמוצת אבץ ההקרבה ויצירת תבניות נקבובית עם מחטים תחמוצת אבץ. תחמוצת אבץ ההקרבה הרכיבים הוסרו ואז עם חומצה כלורית, יצירת hydrogels פג ודק במיוחד עם נקבוביות רציפה (איור 1). המורפולוגיה של תחמוצת אבץ מחטים אושר ע י סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM), ממוצע אורך ורוחב היו נחושים להיות 3.92 ± 0.089 מיקרומטר ו 0.43 ± 0.02 µm, בהתאמה (איור 2א - 2B). בעקבות הסרת תחמוצת אבץ מחטים, הנקבוביות הידרוג היו דמיינו ידי SEM, מאופיין (איור 2סי - 2E). הצפיפות נקבובית ממוצע של hydrogels היה 176,863 ± 49,532 נקבוביות. SEM שימש גם כדי להמחיש ולחשב צפיפות הנקבוביות הוספה תמיכה חדיר מיקרומטר 3 רגיל פוליקרבונט נקבובית, צפיפות הנקבוביות נמצאה להיות נמוך משמעותית, עם של 2.51 ± 0.05 נקבוביות לכל מ מ מרובע (איור 2D, טבלה 2). קוטר נקבובית ממוצע ב- תחמוצת אבץ בתבניות פג הידרוג היה 0.19 ± 0.01 מיקרומטר, היה קטן באופן משמעותי יותר 3.47 ± 0.21 מיקרומטר נקבוביות שנצפתה על הוספה תמיכה חדיר (איור 2E, בטבלה 2). טומוגרפיה אופטית קוהרנטית שימש לרכוש גם תמונות 2 - ו תלת-ממדי כדי לקבוע את עובי hydrogels צף 1 x PBS (איור 3א - 3B). העובי ג'ל הממוצע היה 18.89 ± 3.47 מיקרומטר (טבלה 2). ג'ל מכניקה הוערכו גם על ידי מדידת כאמור תיאר את הנפח, האלסטיות הממוצעת נמצאה להיות ± 96.78 23.92 kPa (טבלה 2). 14
מיקרוסקופ immunofluorescence מדגים כי תאי אנדותל ותאי אפיתל לשמר את זהותם פנוטיפי לאחר להיות תרבותי על זגוגית פג-RGD hydrogels. תאי אנדותל הקפיד ביטוי של תאים PECAM-1, ואפיתל מוכתם באופן חיובי עם נוגדן anti-A549 (איור 4א - 4B). שני סוגי תאים נשמרים גם יכולת ליצור צמתי צר. תאי אנדותל הביע VE-קדהרין בצמתים תא-תא, והביע בתאי אפיתל E-קדהרין (C - 4 Dאיור 4). Hydrogels פג-RGD גם תומך bilayers הסלולר ואין לאפשר לאנשי תא-תא לטופס בתוך המבנים נקבובי, כפי שהוכח על ידי הדמיה immunofluorescent של phalloidin צבעונית דגימות (איור 4E).
איור 1 . סקירה סכמטי של הידרוג הכנת פרוטוקול. A) סינתזה ואוסף של ZnO מחטים. B) הכנה של שקופיות זכוכית; יצירת שכבה ZnO ההקרבה. C) הכנה ועיקור של נייר תרמי סיליקון. D) הכנה של פג פתרון עם ZnO מחטים. E) פלמור של פג ג ' לים בין ZnO מצופה זכוכית שקופיות. קווים לבנים מייצגים מחטים ZnO ההקרבה, ציפויים. F) שטיפה HCl עבור הסרת המחטים ושחרור של ג'ל מהשקופיות. קווים כהים מייצגים נקבוביות שנוצרו על ידי מחטים ZnO מומס. G) העברה של ג'לים ומבודדים סיליקון 6-ובכן לא להתכונן תא זריעה. H) תא זריעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . נקבוביות הידרוג ואפיון המחט אבץ. A) במיקרוסקופ אלקטרוני ממחטים אבץ (סולם בר 5 מיקרומטר). B) אורך ורוחב של אבץ מחטים. הנקודות מייצגות מדידות מחטים בודדים; קווים מייצגים אומר, שגיאת תקן. C) במיקרוסקופ אלקטרוני של הידרוג נקבובי (סולם בר 2 מיקרון). D) הנקבוביות צפיפות ו- E) קוטר נקבובית ממוצע תומך חדיר פוליקרבונט, פג hydrogels. העמודות מייצגות וב שגיאה סטנדרטית. p < 0.0001 באמצעות מבחן T. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . עובי הידרוג. טומוגרפיה אופטית קוהרנטית מדגים א) תלת-ממדי, B) 2-ממדי תמונות של hydrogels צפה ב- PBS. החצים מייצגים משטח נוזלי, מייצגת הידרוג. סולם בר הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . Hydrogels התמיכה טפט ותרבות Bilayer. שני תאי אנדותל ותאי האפיתל הם מסוגלים ליצור confluent monolayers על hydrogels פג, כפי שמתואר על ידי צביעת פלורסנט עבור א) CD31 (CD31 אדום, כחול דאפי) ו ב) A549 (A549 אדום, דאפי כחול), בהתאמה. היווצרות של צמתי קדהרין שלם מודגמות עבור C) תאי אנדותל (VE קדהרין ירוק, דאפי כחול) ו- D) בתאי אפיתל (E קדהרין ירוק, כחול דאפי) (גודל ברים-100 מיקרון). E) שתי דוגמאות bilayers הסלולר מודגמות מאת phalloidin מכתים (phalloidin אדום, כחול דאפי) (סולם ברים 10 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| הבעיה | פיתרון אפשרי |
| ג'לים יש חורים גדולים. | ודא כי אבץ מחטים מספיק נפרדנו לפני השימוש. |
טבלה 1. הפתרונות המוצעים לפתרון בעיות.
| הידרוג | Transwell | מטריצה חוץ-תאית | |
| צפיפות הנקבוביות (2מ"מ/נקבוביות) | 1.77 x5 10 ± 4.9 x 104 | של 2.51 ± 0.05 | 8.50 x 102 7.0 x 104 2,14 |
| קוטר נקבובית (מיקרומטר) | 0.19 ± 0.01 | 3.47 ± 0.21 | 0.47 כדי 3.86 2,14 |
| עובי (מיקרומטר) | 18.89 ± 3.47 | 10 | 0.05 כדי 0.10 17 |
| של יאנג מודולוס (kPa) 5 | 96.78 ± 23.92 | > 1000 | 3.5 14 |
בטבלה 2. השוואה בין מאפייני הידרוג הוסף תמיכה חדיר רגילה ומטריצה חוץ-תאית (ערכים מייצגים אומר ± שגיאה סטנדרטית)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול מפורט כאן אפשרה לנו ליצור של הידרוג פג tunable לשמש לפיגום ביונים מוניטור. באופן ספציפי, על ידי משקולות בדרגות שונות של מולקולרית פג, אסטרטגיות ההטיה פפטיד, ו מבנים שעוות תחמוצת אבץ או ריכוזי, את הנפח, תכונות ביוכימיות ומבנה הנקבובי של hydrogels יכול להיות שונה, בהתאמה. לגרדום פג ודק במיוחד כולל צפיפות הנקבוביות גבוהה יותר, קוטר נקבובית קטנים זה יותר מימטי של התכונות המצויות ויוו ממברנות המרתף לעומת מודל תמיכה חדיר רגילה (טבלה 2). עוד יותר, בעזרת שיטה זו השגנו מבנה ודק במיוחד בעובי ממוצע של פחות מ-20 מיקרומטר. ואילו הדגמים תמיכה חדיר פוליקרבונט השיגו כבר שכבת ודק במיוחד של 10 מיקרומטר, לידע שלנו, זוהי מערכת הידרוג לתרשים, tunable הראשונה כדי להשיג את עובי. לבסוף, יש hydrogels פג הנפח של kPa כ-100, אשר סדרי גודל פחות נוקשות יותר מסורתי תומך חדיר תרביות רקמה פלסטיק, זכוכית, אשר בכולם יש מודולים אלסטי בתוך טווח של הציונים, ולכן הם יותר להשוות הנמוך (< 10 kPa) הנפח של ויוו מטריצה חוץ-תאית (טבלה 2).
השגת הנפח נמוך היתה אחת המטרות של העבודה המוצגת כאן, מגבלה אחת לשימוש של פוליקרבונט המסורתית תמיכה חדיר מודלים. זה ידוע כי המצע הנוקשות יכולה להכתיב בהתנהגות התא, עבודה הראה קשיחות המצע יכול להנחות הסלולר גורל המבדילים תאים. 12 סובסטרטים נוקשות גם משמשות כדי לחקות את מצבי מחלה, כולל רקמות שהותירה או גידולים סרטניים, ואינם ולכן במדויק נציג של רקמות בריאות. 18 , 19 , 20 , 21 ללימוד פנוטיפים הסלולר השבתה הדרגתית ופונקציות, חיוני להשתמש סובסטרטים המחקים של הנפח זה רלוונטי ויוו. אחד היתרונות העיקריים של מערכת זו היא היכולת לכוון את המכניקה של הג'ל, אשר יכולה להיות מושגת באמצעות PEG עם משקלות שונים מולקולרית. כמו מחלות רבות משויכים ECM stiffening, מערכת זו מספקת פלטפורמה ביונים ללמוד את ההשפעות של בריא לעומת BM ולכוונו על תפקוד התא. שינוי נוסף של מערכת זו גם יכולה להיות מושגת על ידי שינוי השבר פפטיד כללו תא הדבקה. לצורך המחקר, שימשה RGD עקב שלה בכל מקום ביטוי חלבונים מוניטור רבים ויכולת להקל על התא המשרד מצורף. בנוסף RGD, שברי laminin ניתן גם לשלב לקדם אינטראקציות laminin-אפיתל מדריך הפסגה הבזליים תא קיטוב. 1 כפי הקשיחות מוניטור היא שונה במחלה, ההרכב של קרום המרתף הוא השתקם בתנאים פתולוגי. באמצעות למבשר פג-NHS אמין-ריאקטיבי, זה אפשרי נזווג מגוון של פפטידים וחלבונים לבסיס פולימר פג. 11 , 14 , 15 זה מועיל במיוחד חוקרת את ההשפעות של האירוסים אינטגרין קולטנים שונים אינטגרין. לדוגמה, רצף RGD מתבטא ביכולת fibronectin קולגן עוסקת אינטגרינים מרובים, אבל יש ירידה לפרטים גבוה עבור αvβ3 אינטגרין. לחקות באופן ספציפי מצע עשיר fibronectin, יכול לשלב את רצף חומצה-ואלין (LDV) לאוצין-אספרטית לעסוק α4β1, או לחקות קרום סילוק, חומצה-אלנין חומצה אספרטית-גליצין-גלוטמית (DGEA) יכול להתווסף לעסוק אינטגרין Α2Β1. 8
Bilayers אנדותל-אפיתל הם רק דוגמה אחת bilayer הסלולר שניתן ליצור עם המודל המוצג כאן. אחרים bilayers הקיימות באופן טבעי בויוו, מופרדים על-ידי רק מוניטור דק או ECM, כוללים אנדותל-pericyte bilayers תא שריר חלק אנדותל. לפיכך, היישומים עבור שיטה זו רחבות ומתחו מן הרפואה ריאתי לביולוגיה. עוד יותר, בגלל נקבוביות ייחודי hydrogels האלה, הם מציעים את היכולת לנהל מחקרים פונקציונלי הידרוג דגמים קודמים לא הצליחו לתמוך. על ידי שילוב נקבוביות למערכת שלנו הידרוג ודק במיוחד, יצרנו של החלפת ביונים משופרת עבור תמיכה חדיר מודלים, הפיכת החקירה של חדירת חיידקי, תופעה שכיחה לרוחב הריאות מחסום האפיתל אנדותל של שחפת. 3 , 6 , 14 , 22 . באופן דומה, גלגול או כימוטקסיס של תאים דלקתיים על פני תרביות תאים לכלי הדם יכול ייחקרו על ידי מדידת קצב הלכידה תא RGD תא functionalized דבק מהמשטח של הג'ל, כפי שהוצגה קודם לכן. 16 זה יתרון משמעותי על פני שיטות הידרוג מבוסס קודמות אשר השיגו תרבות משותפת תנאים באמצעות אנקפסולציה. מערכות אלו מאפשרות בסמיכות, תא-תא קשר בין שני סוגי תאים, היה מוצלח למדידת פונקציות כגון אנגיוגנזה ו- vasculogenesis, אך חוסר הנגישות המוצעים על ידי מערכות דו מימדי, המספקים הרבה פלטפורמה פשוטה למדידת הדליפה, חדירה או העברת פעיל על פני מחסום תרבותי משותף הסלולר. 17
לפיכך, שיטת המודגמות כאן מציע פלטפורמה עבור מגוון רחב של מחקרים על פני שדות מרובים, ומספק קרש לקראת הפקת נתונים רלוונטיים יותר ממחקרים חוץ גופית בתוך להבין ויוו פתולוגיות נוספות ומנגנונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות פרופסור פול ואן טאסל, פרופסור Chinedum Osuji עבור שיחות מתחשב ומומחיות הנדסת חומרים שלהם. מימון עבור עבודה זו סופקה על ידי פרס יוזמה חדשה דובינסקי נבחרת מוסדות של בריאות NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
