Summary
Modelos de cultura bicapa actuales no permiten estudios funcionales en vitro que imitan en vivo microambientes. Uso de glicol de polietileno y un método de plantillas de óxido de zinc, este protocolo describe el desarrollo de una membrana del sótano biomiméticos ultrafino con rigidez sintonizable, porosidad y composición bioquímica que imita muy de cerca en vivo matrices extracelulares.
Abstract
La membrana basal es un componente crítico de bicapas celulares que puede variar en rigidez, composición, arquitectura y porosidad. Estudios in vitro de bicapas endotelial epitelial han dependido tradicionalmente de modelos de apoyo permeables que permitan la cultura de la bicapa, pero soportes permeables son limitados en su capacidad para replicar la diversidad de humanos las membranas del sótano. En cambio, modelos de hidrogel que requieren síntesis química son altamente armoniosas y permitan la modificación de la rigidez del material y la composición bioquímica mediante la incorporación de proteínas o péptidos biomiméticos. Sin embargo, modelos de hidrogel tradicional están limitados funcionalidad porque carecen de poros para contactos célula-célula y funcional en vitro estudios de migración. Además, debido al grueso de los hidrogeles tradicionales, ha sido difícil incorporación de los poros que abarcan todo el espesor de los hidrogeles. En el presente estudio, utilizamos hidrogeles poly-(ethylene-glycol) (PEG) y un método de plantillas nuevo óxido de zinc para abordar las deficiencias anteriores de hidrogeles biomiméticos. Como resultado, presentamos un hidrogel ultrafino, similar a la membrana basal que permite la cultura de bicapas celulares confluentes en un andamio personalizable con arquitecturas de poro variable, propiedades mecánicas y composición bioquímica.
Introduction
Matrices extracelulares (ECM) son los andamios de la proteína que soporte accesorio de la célula y sirven como barreras entre tipos celulares distintos y son un componente esencial de los órganos y tejidos complejos. En contraste con el tejido conectivo intersticial, la membrana basal (BM) es un tipo especializado de ECM que actúa como una barrera para dividir compartimentos de tejido uno del otro. BMs son aproximadamente 100 μm de espesor y por lo tanto permiten la comunicación directa e indirecta entre las células a cada lado. Dos ejemplos comunes de BMs son vasculares BMs, encontradas en la pared microvascular entre los pericitos y las células endoteliales y BMs en las vías respiratorias que se encuentran entre las células endoteliales y epiteliales. BMs sirven un papel importante en la regulación de la función de la célula, tales como migración y polaridad celular, en salud y enfermedad. 1 la composición, rigidez, arquitectura y porosidad de BMs varía según los sistemas del órgano para facilitar distintas funciones fisiológicas. Por ejemplo, los poros BM son críticos para mantener la comunicación célula-célula, difusión de la molécula soluble y para la migración de células inmunes durante la inflamación o las bacterias durante una infección. En las vías respiratorias, poros abarcan todo el espesor del BM, con diámetros que van desde 0.75 3.86 μm.2
La naturaleza fina de la BM asegura que aunque los tipos de la célula están separados físicamente uno del otro, comunicación intercelular a través de señalización paracrina y contacto mediado se conserva. Por lo tanto, para estudiar enfermedades humanas in vitro, los investigadores han confiado en insertos de apoyo permeable poroso a bicapas celulares cultura. 3 estos modelos han sido críticos para la comprensión de la comunicación celular que desempeña un papel en la salud y la enfermedad. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 apoyo permeable insertos satisfacen los requisitos básicos para la comprensión de cómo la señalización de la célula regula procesos fisiológicos, tales como reclutamiento de leucocitos e infiltración bacteriana; sin embargo, los insertos tienen limitaciones importantes y dejar de imitar a un humano soporte BM Permeable insertos carecen de afinabilidad mecánico y bioquímico, y la estructura porosa simplista no imitan la estructura fibrosa que crea los poros irregulares típico de BMs. Por lo tanto, hay una creciente necesidad de sistemas ajustables que pueden recrear las propiedades nativas de BM que influyen en los procesos celulares.
Sustratos a base de polímero son candidatos ideales para el desarrollo de biomimetic BMs para estudiar celulares bicapas en un contexto que imita más de cerca el ambiente en vivo . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polímeros son mecánicamente ajustables y pueden ser modificados químicamente para incorporar fragmentos de péptido biomimético. 11 , 12 , 13 el bioinert polímero polietileno glicol (PEG) se puede utilizar para construir biomiméticos BMs y el trabajo reciente ha detallado la síntesis de geles de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD) PEG mecánicamente ajustables con redes porosas que apoyen el crecimiento de la célula y Quimiotaxis de células inflamatorias. 14 aunque publicado basada en PEG sustratos proporcionan un modelo más realista de un ECM humano que soportes permeables, muchos de estos modelos son extremadamente gruesos, con una profundidad de aproximadamente 775 μm que limita la capacidad de crear culturas bicapa con célula contactos. 14
Aquí, presentamos un protocolo para la creación de un imitador de BM clavija del polímero que supera muchas de las limitaciones de las tecnologías actuales de la cultura de la bicapa del celular. Hemos desarrollado un método de las plantillas que incorpora el óxido de zinc, un material ampliamente utilizado para la fabricación de producción microcristalina, en el polímero durante la síntesis y el entrecruzamiento, que se retira posteriormente y de forma selectiva de la polímero resultante en a granel. Este proceso genera una red porosa al azar, mímico la red de poros interconectados y tortuoso de BMs humanas. Además, la porosidad puede modificarse cambiando el tamaño y la forma de los microcristales de óxido de zinc a través de la modificación de la estequiometría de la reacción durante la producción de aguja. La técnica desarrollada aquí crea un hidrogel ultrafino que imita el grueso del BM humanos por último, la mecánica, la porosidad, y la composición bioquímica de estas construcciones BM-como se puede modificar fácilmente para generar un microambiente que es la más similar a ése visto en vivo.
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Protocol
Por favor, lea la hoja de datos de seguridad de Material (MSDS) de todos los materiales anteriores utilizar y las precauciones de seguridad en todos veces.
1. síntesis de agujas de óxido de Zinc
- Preparar 250 mL de 0,04 M Zn (NO3)2* solución de 6 H2O mediante la adición de 2,9749 g de nitrato de zinc a 250 mL de agua.
- Agregar 6 g de NaOH en 150 mL de agua para preparar 150 mL de 1 M NaOH.
- Instalar un baño de aceite mineral sobre una placa caliente con agitador y sumerja un matraz de fondo redondo de 500 mL en el baño del aceite a temperatura ambiente.
- Añadir 250 mL de Zn (NO3)2* 6 H2O al matraz y empiece el revolvimiento de la reacción.
- Agregar 150 mL de solución de NaOH (un precipitado blanco forma brevemente y luego desaparecen como continúan mezclando las dos soluciones). Revuelva durante 2 h descubierto.
- Calentar el matraz a 55-60 ° C y continuar la agitación por 24 h.
- Apagar el fuego y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente mientras que revuelve.
- Filtrar la solución en un embudo Büchner con un tamaño de poro de 11 μm y deje que se seque durante la noche, al descubierto. Cuando el papel de filtro no está mojado de la solución vertida y un polvo blanco ha formado sobre los agujeros del embudo, las partículas se secan completamente.
- Recoger agujas de ZnO y prepararse para microscopía electrónica de barrido (SEM) para confirmar la morfología acicular. Brevemente, montaje de cinta de carbón sobre un trozo de perno y use una espátula de metal para manchar las agujas de ZnO en la cinta de carbón. Sputter coat con iridio de 8 mm a una densidad de 22,4 g/cm3 y adquirir imágenes en 10 kV.
2. adición de capa de Zinc de sacrificio en portaobjetos para HCl inducida por liberación de PEG
- Preparar solución de acetato de zinc disolviendo 1,756 g de acetato de zinc en 200 mL de metanol.
- Limpiar 3 "x 1" simple microscopio con etanol al 70% y una toallita desechable. Seque al aire durante 10 minutos.
- Coloque un vaso de 150 mm en una placa de Petri y precalentar a 150-160 ° C.
- Utilizando una pipeta de vidrio con un bulbo de la pipeta, sostener el portaobjetos con unas pinzas y capa diapositivas aplicando 5 gotas de acetato de zinc, formando una capa delgada dispersada en la diapositiva. Permite el exceso de solución gotee en la solución.
- Colocar el portaobjetos en la placa Petri precalentado (150-160 ° C) con el zinc acetato recubierto hacia arriba. Deja sobre la placa durante 15 minutos.
- Retire el portaobjetos con las pinzas y deje que se enfríe a temperatura ambiente. La diapositiva aparecerá a recubrir con vetas blancas.
- Quite cualquier exceso cinc que queda en las diapositivas usando una toallita desechable para quitar rayas blancas prominentes. La superficie debe ser uniforme.
- Exponer a la luz las diapositivas preparadas a los rayos UV en una campana de bioseguridad por al menos 1 h para garantizar la esterilidad.
PRECAUCIÓN: La luz ultravioleta es dañina a los ojos y piel expuesta. Evitar la exposición directa a los ojos o la piel y apague el suministro eléctrico cuando no se usa.
3. preparación de aisladores eléctricos de silicona
- Hoja de silicona cortado en cuadrados de menos de 1 "x 1" (aisladores deben ser capaces de encajar en un plato de 6 pozos).
- Perfore agujeros de 8-12 mm en el centro de las plazas con un punzón de biopsia.
- Aisladores de silicona autoclave durante 20 min a 121,0 ° C y 1,12 kg/cm.
4. preparación de solución de PEG y PEG Gel de síntesis
Nota: Funcionalización y polimerización de PEG ha sido extensamente explorada y detallado previamente por nuestro laboratorio y otros. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
- Combinar el péptido adhesivo del celular RGD con acryloyl-PEG-NHS en bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,5) en una proporción molar 1:1 para permitir el funcionamiento de la terminal amino del péptido con la molécula de acrilato, una reacción bioquímica que ha sido previamente caracteriza por producir mayor que 85% de eficiencia. 17
- Preparar foto iniciador mezclando 2,2-dimetoxi-2-Fenilacetofenona con 1-Vinyl-2-pirrolidona en una concentración de 300 mg/mL.
- En separar los tubos de 1,5 mL, pesar las siguientes: 20 mg de ZnO agujas, 12,5 mg de PEG-DA y 2,5 mg de PEG-RGD.
- Suspender 20 mg de ZnO agujas en 270 μl de solución al 10% FBS/PBS; Vortex para mezclar (aproximadamente 15 s).
- Brevemente (< 1 s) girar la solución en una centrifugadora mini de sobremesa para llevar cualquier ZnO agregados a la base del tubo.
- Recoger 250 μl de la parte superior de la solución de ZnO, para asegurar que los agregados en la parte inferior del tubo. Combinan con PEG-DA y PEG-RGD para crear una solución de PEG con aproximadamente 2,5 mM RGD. Vortex para mezclar (aproximadamente 15 s).
- Añadir 2 μl de acetofenona/n-vinyl pirrolidona foto iniciador y de vortex para mezclar (5 s).
- Añadir 20 μl de la solución del polímero a lo largo del centro de las diapositivas de ZnO cubierto.
- Lentamente baje una segunda diapositiva en la parte superior, con la cara de la capa de ZnO abajo (la solución de PEG debe ser entre dos capas de ZnO cubierto). Trate de evitar la formación de burbujas de aire. Mover las diapositivas lateralmente a lo largo del eje principal para permitir que las burbujas para escapar y para distribuir la solución a una capa delgada. Cubren la mayoría de lo portaobjetos con la solución de polímero. Crear una proyección leve con la diapositiva superior para asegurarse de que las diapositivas se pueden tirar en pasos posteriores.
- Reticulación las diapositivas bajo una lámpara de nm UV 365 (aproximadamente 10 mW/cm2) durante 15 minutos.
5. liberación de PEG geles de portaobjetos de vidrio
- Aplique presión en la Corredera colgante y manualmente tire que las dos diapositivas aparte a un ritmo lento en orden de evitar agrietar las diapositivas. Permita que los geles secos durante al menos 5 minutos o toda la noche.
- Coloque el portaobjetos en un vaso estéril 25 mm plato de Petri y verter suavemente la solución de ácido clorhídrico de 1 M en la diapositiva, usar sólo lo suficiente para cubrir el portaobjetos (aproximadamente 10-20 mL). Muévalo suavemente la caja Petri; el gel debe comenzar a levantar la diapositiva como el HCl disuelve el recubrimiento de zinc de sacrificio y agujas. Una vez que el gel está libre de la diapositiva, vierta el ácido clorhídrico en la solución.
- Enjuagar el gel vertiendo suavemente aproximadamente 25 mL de PBS 1 x en la caja Petri hasta el slide y el gel se sumergieron.
6. siembra de células de bicapas
- Preparar las células A549 para la siembra. Brevemente, enjuagar un matraz de2 75 cm con 5 mL de PBS 1 x, agregue 3 mL de 0.25% tripsina-EDTA y dejar reposar 2-3 min a 37 ° C.
- Mecánicamente agitar el frasco, calmar la reacción con medio de Eagle modificado de 3 mL Dulbecco con 10% fetal bovino suero y 1% penicilina-estreptomicina y recoger en un matraz cónico de 15 mL. Enjuague con un adicional 4 mL de completa de Dulbecco modificado Eagle Media y recoger en el mismo cónico. Girar las células a 475 x g durante 6 minutos.
- Mientras que las células están girando hacia abajo, agregar una pequeña gota de medio de Eagle modificado de Dulbecco completa en cada pocillo de una placa de 6 pozos. Utilice unas pinzas para trasvasar los aisladores de silicona con los geles de la nueva placa de la pozo de 6, tales que el gel esté apoyado en la caída de los medios de comunicación. Ahora que los geles se extienden en una capa delgada, asegurarse de que no hay ningunos agujeros grandes visibles al ojo. Esto debe hacerse inmediatamente antes de la siembra de células para evitar la sequedad y el agrietamiento de los geles.
- Resuspender las células en medio de Eagle modificado de Dulbecco con 10% fetal bovino suero y 1% penicilina-estreptomicina en una concentración de 6 x 105 células/mL. Agregar la gota de suspensión de célula sabio al centro del gel, tratando de mantener un menisco en la zona perforado hacia fuera de la membrana de silicona. Permitir que las células se adhieran durante 4 horas.
- Después de 4 h, Añadir 0,5 mL de medio de Dulbecco modificado Eagle completo al pozo e incubar durante una noche a 37 ° C para permitir la completa adherencia.
- Al día siguiente, preparar HUVECs para la siembra de la célula.
- Enjuagar un matraz de2 75 cm con 5 mL de 1 X PBS, añadir 3 mL de 0.25% tripsina-EDTA y dejar reposar 2-3 min a 37 ° C.
- Mecánicamente agitar el frasco, calmar la reacción con 3 mL de medio M199 con suplemento para crecimiento de 1%, 20% suero bovino fetal y 1% penicilina-estreptomicina y recoger en un cónico de 15 mL.
- Enjuague con 4 mL de medio completo M199 y recoger en el mismo cónico. Girar las células a 475 x g durante 6 minutos.
- Mientras que las células están girando hacia abajo, agregar una pequeña gota de medio completo 199 a cada pocillo de una placa de 6 pozos nuevos. Colocar un aislador de silicona nueva en el pozo con la caída de los medios de comunicación en el centro de la silicona.
- Cuidadosamente con unas pinzas, voltear el aislador de silicona el gel de PEG con células A549 en el aislador de apoyo en la nueva placa de la pozo 6.
- Suspender HUVECs en una concentración de 6 x 105 células/mL y añadir la suspensión de células en el centro de la gota del gel volteado sabio, tratando de mantener un menisco en el gel de dentro del área de perforado hacia fuera de la membrana de silicona. Permitir que las células se adhieran por 2 h.
- Después de 2 h, suavemente Agregue 2 mL de medio completo M199 a cada pocillo.
7. inmunofluorescencia
- Con cuidado retire los medios de comunicación de geles con una pipeta manual y agregar aproximadamente 500 μl de paraformaldehído al 4% (PFA) para el centro del gel donde se siembran las células. Deje reposar durante 30 min a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: PFA es un químico tóxico; Use protección y garantizar el manejo se realiza en un gabinete de seguridad biológica. - Cuidadosamente Quite la PFA y añadir aproximadamente 500 μl de BSA 2% en PBS a cada gel. Deje reposar por 1 h a temperatura ambiente.
- Retire con cuidado la BSA. Preparar anticuerpos primarios a una dilución de 1: 100 en 2% de BSA en PBS y agregar 500 μl de cada gel. Deje reposar por 1 h a temperatura ambiente. Enjuagar suavemente con 500 μl de PBS 1 x.
- Repetir el mismo proceso con los anticuerpos secundarios. Utilizar los siguientes anticuerpos: 1) humana CD144 (VE-cadherina) clon 16B1; 2) humana CD324 clon (E-Cadherin) 6714; 3) anti-humanos CD31 (PECAM-1) clon C-20; 4) anti-549; 5) anti-ratón FITC; 6) contra cabra Alexa Fluor 647. Para visualizar la F-actina, agregar 500 μl de Phalloidin (10 μg/mL en PBS) durante 20 minutos.
- Cuidadosamente retire los anticuerpos secundarios o phalloidin y agregar 500 μl de DAPI (0.1 μg/mL) durante 20 minutos Retire con cuidado la solución DAPI y suavemente añadir 1,5 mL de 1 x PBS a cada pocillo para que los geles están en suspensión.
- Mediante aisladores de silicona y pinzas, transferir un gel a un portaobjetos de vidrio. Hacer esto para cada gel inmediatamente antes de la proyección de imagen y sustituir los geles en solución de PBS después de la proyección de imagen.
- Alternativamente, Monte geles utilizando un medio de montaje de DAPI. Sellar bien las muestras con esmalte de uñas, adquisición de imágenes dentro de 2 días para prevenir la sequedad y el agrietamiento del gel. Consulte la tabla 1 para solución de problemas.
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Representative Results
PEG-RGD hidrogeles se formaron colocando la solución de polímero entre dos capas de óxido de zinc de sacrificio y creando plantillas de poro con agujas de óxido de zinc. Entonces fueron quitados componentes sacrificio óxido de cinc con ácido clorhídrico, generando ultrafinos hidrogeles de PEG con poros continuos (figura 1). La morfología de las agujas de óxido de zinc fue confirmada por microscopía electrónica de barrido (SEM), y el promedio de la longitud y el ancho se determinaron que 3,92 μm ± 0.089 y 0.43 ± 0.02 μm, respectivamente (figura 2A - 2B). Tras la eliminación de las agujas de óxido de zinc, los poros de hidrogel fueron visualizados por SEM y caracterizan (figura 2C - 2E). La densidad promedio del poro para hidrogeles fue 176.863 ± 49.532 poros. SEM también fue utilizado para visualizar y calcular la densidad de poros de un inserto de soporte permeable policarbonato estándar 3 μm poro, y la densidad de poros fue encontrada para ser perceptiblemente más baja, con aproximadamente 2,51 ± 0.05 poros por mm cuadrado (figura 2D, Tabla 2). El diámetro medio del poro en el óxido de zinc con plantilla hidrogel de PEG fue de 0.19 ± 0,01 μm y era significativamente más pequeño que los 3,47 ± 0,21 μm poros en el inserto de soporte permeable (figura 2E, tabla 2). Tomografía de coherencia óptica fue utilizada para adquirir dos imágenes 2 y 3 dimensiones y determinar el espesor de los hidrogeles flotando en PBS 1 x (figura 3A - 3B). El espesor promedio del gel fue 18.89 μm ± 3.47 (tabla 2). Mecánica de gel también se evaluaron midiendo el módulo de elasticidad como se describió anteriormente, y módulo de Young promedio fue encontrado para ser 96.78 ± 23.92 kPa (tabla 2). 14
Microscopia de la inmunofluorescencia demuestra que las células endoteliales y células epiteliales mantengan su identidad fenotípica después de ser cultivadas en hidrogeles de PEG-RGD ultrafinos. Las células endoteliales mantienen la expresión de las células epiteliales y PECAM-1 manchada positivamente con un anticuerpo anti-A549 (figura 4A - 4B). Ambos tipos de células también mantienen la capacidad de formar a uniones estrechas. Las células endoteliales expresan VE-cadherina en las ensambladuras de la célula, y las células epiteliales expresan cadherina (figura 4C - 4 D). Los hidrogeles de PEG-RGD también apoyan bicapas de celulares y permiten contactos célula a formar dentro de las estructuras porosas, como quedó demostrado por proyección de imagen inmunofluorescente de phalloidin manchada las muestras (figura 4E).
Figura 1 . Esquema Resumen del Protocolo de preparación del hidrogel. A) síntesis y colección de agujas de ZnO. B) preparación de portaobjetos; creación de una capa de ZnO sacrificial. C) preparación y esterilización de aisladores eléctricos de silicona. D) solución preparación de PEG con agujas de ZnO. E) polimerización de PEG geles entre portaobjetos recubierto de ZnO. Líneas blancas representan recubrimientos y sacrificio agujas de ZnO. F) enjuague ácido clorhídrico para la eliminación de agujas y la liberación de gel de diapositivas. Líneas oscuras representan los poros creados por las agujas de ZnO disueltas. G) transferencia de geles y aisladores de silicona a plato 6-pozo para preparar para la siembra de la célula. H) celular siembra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Caracterización de aguja zinc y porosidad de hidrogel. A) imagen de SEM de agujas de zinc (escala de la barra 5 μm). B) largo y ancho de las agujas del cinc. Puntos representan medidas de agujas individuales; las líneas representan la media y error estándar. C) imagen de SEM de hidrogel poroso (escala de la barra 2 micras). D) densidad del poro y E) de diámetro de poro promedio de policarbonato soportes permeables y PEG hidrogeles. Las barras representan la media y error estándar. p < 0.0001 mediante T-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Espesor de hidrogel. Tomografía de coherencia óptica muestra A) 3-dimensional y B) imágenes 2-dimensionales de hidrogeles en PBS. Las flechas representan la superficie del líquido, asterisco representa hidrogel. Barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Apoyo de hidrogeles monocapa y bicapa cultura. Tanto las células endoteliales y las células epiteliales son capaces de formar monocapas confluentes en hidrogeles de PEG, según lo demostrado por la coloración fluorescente para A) CD31 (CD31 rojo, azul DAPI) y B) A549 (A549 rojo, azul DAPI), respectivamente. Formación de uniones de cadherin intacto se han demostrado para C) las células endoteliales (VE cadherin verde, DAPI azul) y D) las células epiteliales (cadherina verde, DAPI azul) (escala de barras de 100 micrones). E) dos ejemplos de bicapas de celulares están demostrados por phalloidin tinción (phalloidin rojo, DAPI azul) (escala bares 10 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Problema | Posible solución |
| Los geles tienen orificios grandes. | Asegúrese de que las agujas de zinc se dividen suficientemente antes de usarlos. |
Tabla 1. Soluciones sugeridas para solucionar problemas.
| Hidrogel | Transwell | Matriz extracelular | |
| Densidad de poros (poros/mm2) | 1.77 x 105 ± 4.9 x 104 | 2.51 ± 0.05 | 8.50 x 102 7.0 x 104 2.14 |
| Diámetro de poro (μm) | ± 0.19 0.01 | 3.47 ± 0.21 | 0,47 a 3,86 2.14 |
| Espesor (μm) | 18.89 ± 3.47 | 10 | 0.05 a 0.10 17 |
| Módulo (kPa) 5 de Young | 96.78 ± 23.92 | > 1000 | 3.5 14 |
Tabla 2. Comparación de propiedades de hidrogel para insertar estándar apoyo Permeable y matriz extracelular (valores representan media ± Error estándar)
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Discussion
El protocolo detallado aquí nos ha permitido crear un armonioso hidrogel de PEG para servir como un andamio biomiméticos BM. En concreto, de diferentes pesos moleculares de PEG, péptido verbal estrategias y estructuras microcristalinas de óxido de zinc o concentraciones, el módulo de elasticidad, propiedades bioquímicas y la estructura porosa de los hidrogeles pueden ser modificados, respectivamente. El andamio de PEG ultrafino cuenta con una mayor densidad de poro y un menor diámetro de poro más mimético de las características encontradas en vivo las membranas del sótano en comparación con un modelo de soporte permeable estándar (tabla 2). Además, a través de este método hemos logrado una estructura ultrafina de menos de 20 μm de grosor medio. Mientras que los modelos de apoyo permeable de policarbonato ya han logrado una capa ultrafina de 10 μm, a nuestro conocimiento, este es el primer sistema de hidrogel libre-flotante y armonioso para lograr este grosor. Por último, los hidrogeles PEG tienen un módulo elástico de aproximadamente 100 kPa, que es órdenes de magnitud menos rígidas que los tradicionales soportes permeables, cultivo de tejidos de plástico y vidrio, que tienen módulos elásticos en el rango de GPa y por lo tanto son más comparable a la baja (< kPa 10) módulo de elasticidad de la matriz extracelular de en vivo (tabla 2).
Lograr un bajo módulo de elasticidad fue uno de los objetivos primarios de los trabajos presentados aquí y es una limitación para el uso de policarbonato tradicional modelos de apoyo permeable. Es bien sabido que rigidez de sustrato puede dictar el comportamiento celular y trabajo ha mostrado que rigidez de sustrato puede guiar destino celular de diferenciación de las células. 12 sustratos rígidos también se utilizan para imitar Estados de enfermedad, incluyendo tejido fibrótico o tumores cancerosos y por lo tanto no son exactamente representativas de tejidos sanos. 18 , 19 , 20 , 21 para estudiar las funciones y fenotipos celulares quiescentes, es fundamental utilizar sustratos que imitan a un módulo de elasticidad que es relevante en vivo. Una de las principales ventajas de este sistema es la capacidad para ajustar la mecánica del gel, que puede lograrse mediante el uso de PEG con diferentes pesos moleculares. Como muchas enfermedades están asociadas con la rigidez de la ECM, este sistema proporciona una plataforma de biomimética para estudiar los efectos de sano versus BM enfermo en función de la célula. Otra modificación de este sistema también se logra alterando el fragmento del péptido para la adhesión celular. A los efectos de este estudio, RGD era usado debido a su expresión omnipresente en muchas proteínas del BM y su capacidad para facilitar el apego firme célula. Además de RGD, fragmentos de laminina también pueden incorporarse para promover interacciones laminin-epitelial que polarización celular apical basal. 1 tal y como se altera la rigidez de la BM en enfermedad, la composición de la membrana del sótano es remodelada en condiciones patológicas. Utilizando el precursor PEG-NHS amina reactiva, es posible conjugar una variedad de péptidos y proteínas a la base de polímeros de PEG. 11 , 14 , 15 esto es especialmente ventajoso para investigar los efectos de la contratación de integrina para receptores de integrina diferentes. Por ejemplo, la secuencia RGD que se expresa en la fibronectina y el colágeno involucra varias integrinas, pero tiene una alta especificidad para la integrina αvβ3. Para específicamente imitar un substrato rico de fibronectina, se podría incorporar la secuencia de ácido-valina (LDV) aspártico leucina comprometerse α4β1, o imitar una membrana colagenosa, ácido de la glicina-ácido aspártico-glutámico-alanina (DGEA) podría añadirse a la integrina Α2Β1. 8
Bicapas endotelial epitelial son sólo un ejemplo de una bicapa celular que puede crearse con el modelo presentado aquí. Otras bicapas que existen naturalmente en vivo, separados por sólo un BM fino o ECM, incluyen pericyte endotelial y bicapas de células de músculo liso endotelial. Por lo tanto, las aplicaciones de este método son amplias y abarcan desde medicina pulmonar hasta biología vascular. Además, debido a la porosidad única de estos hidrogeles, ofrecen la posibilidad de realizar estudios funcionales que los modelos anteriores de hidrogel no han sido capaces de soportar. Mediante la incorporación de los poros en nuestro sistema de hidrogel ultrafino, hemos creado un reemplazo mejorado biomiméticos de modelos de apoyo permeable, permitiendo la investigación de la infiltración bacteriana, una ocurrencia común en la pulmonar barrera epitelial endotelial en Tuberculosis. 3 , 6 , 14 , 22 Asimismo, transmigración o Quimiotaxis de células inflamatorias a través de culturas de célula vasculares pueden investigarse mediante la medición de la tasa de captura de la célula en la superficie adhesiva de la célula funcionalizados RGD del gel, como se ha demostrado previamente. 16 esto es una ventaja distinta sobre los métodos anteriores de hidrogel basado en que han alcanzado las condiciones de co-cultivo mediante encapsulación. Tales sistemas permiten la proximidad y célula contacto entre dos tipos de células y han tenido éxito para la medición de funciones tales como la angiogénesis y vasculogénesis, pero falta la accesibilidad ofrecida por sistemas bidimensionales, que proporcionan mucho plataforma más simple para medir la fuga, infiltración o migración activa a través de una barrera celular Co cultivada. 17
Así, el método demostrado aquí ofrece una plataforma para una amplia variedad de estudios a través de campos múltiples y proporciona un trampolín hacia la generación de los datos más relevantes de los estudios in vitro para entender más patologías en vivo y mecanismos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Prof. Paul Van Tassel y Prof. Chinedum Osuji sus conversaciones reflexivas y conocimientos de la ciencia de los materiales. Fondos para este trabajo fue proporcionada por el nuevo premio de iniciativa Dubinsky e institutos nacionales de salud NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
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