Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual
Summary
Modelli di cultura doppio strato attuali non consentono per studi funzionali in vitro che imitano microambienti in vivo . Utilizzando polietilene glicole e un metodo di applicazione di modelli di ossido di zinco, questo protocollo descrive lo sviluppo di una membrana basale biomimetici ultrasottile con rigidità sintonizzabile, porosità e composizione biochimica che imita molto attentamente in vivo matrici extracellulari.
Abstract
La membrana dello scantinato è un componente critico di doppii strati cellulari che possono variare in rigidità, composizione, architettura e porosità. Studi in vitro di bilayer endothelial epiteliali hanno tradizionalmente invocata permeabile supporto modelli che permettono la cultura di doppio strato, ma supporti permeabili sono limitati nella loro capacità di replicare la diversità delle membrane dello scantinato umane. Al contrario, modelli di idrogel che richiedono sintesi chimica sono altamente sintonizzabili e consentono le modifiche di sia la rigidità del materiale e la composizione biochimica tramite incorporazione di proteine e peptidi biomimetici. Tuttavia, idrogel tradizionali modelli funzionalità sono limitate perché mancano i pori per contatti cellula-cellula e funzionale in vitro gli studi di migrazione. Inoltre, a causa dello spessore di idrogeli tradizionali, incorporazione dei pori che abbracciano l’intero spessore di idrogeli è stato impegnativo. Nello studio presente, usiamo idrogeli poly-(ethylene-glycol) (PEG) e un metodo di applicazione di modelli di romanzo ossido di zinco per colmare le carenze precedenti di idrogeli biomimetici. Di conseguenza, vi presentiamo un idrogel ultrasottile, scantinato membrana-come che consente la cultura del bilayer cellulare confluente su un’impalcatura personalizzabile con architetture poro variabile, proprietà meccaniche e composizione biochimica.
Introduction
Extracellulare (ECM) compongono i ponteggi di proteina che supportano il collegamento delle cellule e fungono da barriere tra tipi distinti delle cellule e sono una componente essenziale del complessi tessuti e organi. In contrasto con il tessuto connettivo interstiziale, la membrana basale (BM) è un tipo specializzato di ECM che agisce come una barriera per dividere compartimenti uno da altro. BMs sono circa 100 µm di spessore e quindi permettono una comunicazione diretta e indiretta tra cellule su entrambi i lati. Due esempi comuni di BMs sono BMs vascolare, trovato nella parete microvascolare tra cellule endoteliali e periciti e BMs delle vie respiratorie che si trovano tra le cellule endoteliali ed epiteliali. BMs svolgono un ruolo importante nella regolazione della funzione delle cellule, come polarità cellulare e la migrazione, nella salute e nella malattia. 1 la composizione, rigidità, architettura e la porosità di BMs varia tra i sistemi dell’organo per facilitare le funzioni fisiologiche distinte. Ad esempio, i pori BM sono critici per il mantenimento della comunicazione della cellula-cellula, diffusione di molecola solubile e per la migrazione delle cellule immunitarie durante l’infiammazione o batteri durante l’infezione. Nelle vie aeree, pori span lo spessore completo del BM, con diametri che vanno da 0,75 a 3,86 µm.2
La natura sottile del BM assicura che anche se i tipi delle cellule sono fisicamente separati uno da altro, la comunicazione intercellulare tramite segnalazione di paracrine e contatto-mediated è conservata. Così, per studiare la malattia umana in vitro, i ricercatori hanno contato sugli inserti porosi supporto permeabile a bilayer cellulare cultura. 3 questi modelli sono stati critici per la comprensione della comunicazione cellulare che svolge un ruolo nella salute e nella malattia. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 supporto permeabile inserti soddisfano i requisiti di base per la comprensione come segnalazione della cellula-cellula regola processi fisiologici, quali il reclutamento leucocitario e infiltrazione batterica; Tuttavia, gli inserti hanno limitazioni significative e non riescono a imitare un sostegno umano considerando Permeable inserti privi di accordabilità sia meccanica che biochimica e la struttura porosa semplicistica non imitare la struttura fibrosa che crea i pori irregolari tipico di BMs. Di conseguenza, c’è un crescente bisogno di sistemi sintonizzabile che può ricreare la proprietà native di BM che influenzano i processi cellulari.
Substrati a base di polimeri sono candidati ideali per lo sviluppo di biomimetic BMs per studiare bilayer cellulare in un contesto che imita più da vicino l’ambiente in vivo . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polimeri sono meccanicamente sintonizzabile e possono essere modificati chimicamente per incorporare frammenti peptidici biomimetic. 11 , 12 , 13 il polimero bioinerte polietilenglicole (PEG) può essere usato per costruire biomimetici BMs e lavoro recente ha dettagliato la sintesi di gel di acido arginina-glicina-aspartico (RGD) PEG meccanicamente sintonizzabile con reti porosi che supportano la crescita delle cellule e chemiotassi di cellule infiammatorie. 14 anche se pubblicati basati su PEG substrati forniva un modello più realistico di un ECM umano rispetto a supporti permeabili, molti di questi modelli sono estremamente spesse, con una profondità di circa 775 µm che limita la possibilità di creare culture doppio strato con cellulare contatti. 14
Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di un piolo a base di polimeri mimic BM che supera molte delle limitazioni delle attuali tecnologie di cultura cellulare doppio strato. Abbiamo sviluppato un metodo di templating che incorpora il polimero durante la sintesi e la reticolazione, che viene successivamente e selettivamente rimosso dall’ossido di zinco, un materiale ampiamente usato per la fabbricazione di produzione microcristallina, il polimero di massa risultante. Questo processo genera una rete porosa casuale, che imita la rete di pori interconnessi e tortuoso di BMs umano. Ulteriormente, la porosità può essere modificata cambiando la dimensione e la forma i microcristalli di ossido di zinco tramite la modifica della stechiometria di reazione durante la produzione dell’ago. La tecnica sviluppata qui crea un idrogel ultrasottile che imita lo spessore umano considerando infine, la meccanica, la porosità e la composizione biochimica di questi costrutti BM-come può essere modificata facilmente per generare un microambiente che è più simile a quello visto in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo dettagliato qui ci ha permesso di creare un idrogel di PEG sintonizzabile per servire come uno scaffold biomimetici BM. In particolare, di diversi pesi molecolari di PEG, strategie di Coniugazione del peptide e strutture microcristallina di ossido di zinco o concentrazioni, il modulo elastico, proprietà biochimiche e la struttura porosa nel caso degli idrogeli sono modificabili, rispettivamente. L’impalcatura di PEG ultrasottile offre una maggiore densità dei pori e un diametro dei pori più piccolo che ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Prof Paul Van Tassel e Prof. ssa Chinedum Osuji per conversazioni premurose e la comprovata di scienza dei materiali. Finanziamento di quest’opera fu fornito dalla Dubinsky nuova iniziativa premio e istituti nazionali di salute NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
