Summary

Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

Published: December 26, 2017
doi:

Summary

Modelli di cultura doppio strato attuali non consentono per studi funzionali in vitro che imitano microambienti in vivo . Utilizzando polietilene glicole e un metodo di applicazione di modelli di ossido di zinco, questo protocollo descrive lo sviluppo di una membrana basale biomimetici ultrasottile con rigidità sintonizzabile, porosità e composizione biochimica che imita molto attentamente in vivo matrici extracellulari.

Abstract

La membrana dello scantinato è un componente critico di doppii strati cellulari che possono variare in rigidità, composizione, architettura e porosità. Studi in vitro di bilayer endothelial epiteliali hanno tradizionalmente invocata permeabile supporto modelli che permettono la cultura di doppio strato, ma supporti permeabili sono limitati nella loro capacità di replicare la diversità delle membrane dello scantinato umane. Al contrario, modelli di idrogel che richiedono sintesi chimica sono altamente sintonizzabili e consentono le modifiche di sia la rigidità del materiale e la composizione biochimica tramite incorporazione di proteine e peptidi biomimetici. Tuttavia, idrogel tradizionali modelli funzionalità sono limitate perché mancano i pori per contatti cellula-cellula e funzionale in vitro gli studi di migrazione. Inoltre, a causa dello spessore di idrogeli tradizionali, incorporazione dei pori che abbracciano l’intero spessore di idrogeli è stato impegnativo. Nello studio presente, usiamo idrogeli poly-(ethylene-glycol) (PEG) e un metodo di applicazione di modelli di romanzo ossido di zinco per colmare le carenze precedenti di idrogeli biomimetici. Di conseguenza, vi presentiamo un idrogel ultrasottile, scantinato membrana-come che consente la cultura del bilayer cellulare confluente su un’impalcatura personalizzabile con architetture poro variabile, proprietà meccaniche e composizione biochimica.

Introduction

Extracellulare (ECM) compongono i ponteggi di proteina che supportano il collegamento delle cellule e fungono da barriere tra tipi distinti delle cellule e sono una componente essenziale del complessi tessuti e organi. In contrasto con il tessuto connettivo interstiziale, la membrana basale (BM) è un tipo specializzato di ECM che agisce come una barriera per dividere compartimenti uno da altro. BMs sono circa 100 µm di spessore e quindi permettono una comunicazione diretta e indiretta tra cellule su entrambi i lati. Due esempi comuni di BMs sono BMs vascolare, trovato nella parete microvascolare tra cellule endoteliali e periciti e BMs delle vie respiratorie che si trovano tra le cellule endoteliali ed epiteliali. BMs svolgono un ruolo importante nella regolazione della funzione delle cellule, come polarità cellulare e la migrazione, nella salute e nella malattia. 1 la composizione, rigidità, architettura e la porosità di BMs varia tra i sistemi dell’organo per facilitare le funzioni fisiologiche distinte. Ad esempio, i pori BM sono critici per il mantenimento della comunicazione della cellula-cellula, diffusione di molecola solubile e per la migrazione delle cellule immunitarie durante l’infiammazione o batteri durante l’infezione. Nelle vie aeree, pori span lo spessore completo del BM, con diametri che vanno da 0,75 a 3,86 µm.2

La natura sottile del BM assicura che anche se i tipi delle cellule sono fisicamente separati uno da altro, la comunicazione intercellulare tramite segnalazione di paracrine e contatto-mediated è conservata. Così, per studiare la malattia umana in vitro, i ricercatori hanno contato sugli inserti porosi supporto permeabile a bilayer cellulare cultura. 3 questi modelli sono stati critici per la comprensione della comunicazione cellulare che svolge un ruolo nella salute e nella malattia. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 supporto permeabile inserti soddisfano i requisiti di base per la comprensione come segnalazione della cellula-cellula regola processi fisiologici, quali il reclutamento leucocitario e infiltrazione batterica; Tuttavia, gli inserti hanno limitazioni significative e non riescono a imitare un sostegno umano considerando Permeable inserti privi di accordabilità sia meccanica che biochimica e la struttura porosa semplicistica non imitare la struttura fibrosa che crea i pori irregolari tipico di BMs. Di conseguenza, c’è un crescente bisogno di sistemi sintonizzabile che può ricreare la proprietà native di BM che influenzano i processi cellulari.

Substrati a base di polimeri sono candidati ideali per lo sviluppo di biomimetic BMs per studiare bilayer cellulare in un contesto che imita più da vicino l’ambiente in vivo . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polimeri sono meccanicamente sintonizzabile e possono essere modificati chimicamente per incorporare frammenti peptidici biomimetic. 11 , 12 , 13 il polimero bioinerte polietilenglicole (PEG) può essere usato per costruire biomimetici BMs e lavoro recente ha dettagliato la sintesi di gel di acido arginina-glicina-aspartico (RGD) PEG meccanicamente sintonizzabile con reti porosi che supportano la crescita delle cellule e chemiotassi di cellule infiammatorie. 14 anche se pubblicati basati su PEG substrati forniva un modello più realistico di un ECM umano rispetto a supporti permeabili, molti di questi modelli sono estremamente spesse, con una profondità di circa 775 µm che limita la possibilità di creare culture doppio strato con cellulare contatti. 14

Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di un piolo a base di polimeri mimic BM che supera molte delle limitazioni delle attuali tecnologie di cultura cellulare doppio strato. Abbiamo sviluppato un metodo di templating che incorpora il polimero durante la sintesi e la reticolazione, che viene successivamente e selettivamente rimosso dall’ossido di zinco, un materiale ampiamente usato per la fabbricazione di produzione microcristallina, il polimero di massa risultante. Questo processo genera una rete porosa casuale, che imita la rete di pori interconnessi e tortuoso di BMs umano. Ulteriormente, la porosità può essere modificata cambiando la dimensione e la forma i microcristalli di ossido di zinco tramite la modifica della stechiometria di reazione durante la produzione dell’ago. La tecnica sviluppata qui crea un idrogel ultrasottile che imita lo spessore umano considerando infine, la meccanica, la porosità e la composizione biochimica di questi costrutti BM-come può essere modificata facilmente per generare un microambiente che è più simile a quello visto in vivo.

Protocol

Si prega di leggere Material Safety Data Sheet (MSDS) di tutti i materiali precedenti per utilizzare e utilizzare precauzioni di sicurezza a tutte le volte. 1. sintesi di ossido di zinco aghi Preparare 250 mL di Zn (NO3) 0.04 M2* 6 H2O soluzione aggiungendo 2,9749 g di nitrato di zinco a 250 mL di acqua. Preparare 150 mL di NaOH M 1 con l’aggiunta di 6 g di NaOH per 150 mL di acqua. Impostare un bagno di olio minerale su una pias…

Representative Results

PEG-RGD idrogeli formarono sandwiching la soluzione di polimero tra due strati di ossido di zinco sacrificale e creazione di modelli di poro con aghi di ossido di zinco. Ossido di zinco sacrificale componenti allora sono state rimosse con acido cloridrico, generando ultrasottile PEG idrogel con pori continui (Figura 1). La morfologia degli aghi di ossido di zinco è stata confermata da microscopia elettronica (SEM), e la media lunghezza e larghezza sono stati…

Discussion

Il protocollo dettagliato qui ci ha permesso di creare un idrogel di PEG sintonizzabile per servire come uno scaffold biomimetici BM. In particolare, di diversi pesi molecolari di PEG, strategie di Coniugazione del peptide e strutture microcristallina di ossido di zinco o concentrazioni, il modulo elastico, proprietà biochimiche e la struttura porosa nel caso degli idrogeli sono modificabili, rispettivamente. L’impalcatura di PEG ultrasottile offre una maggiore densità dei pori e un diametro dei pori più piccolo che ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrei ringraziare Prof Paul Van Tassel e Prof. ssa Chinedum Osuji per conversazioni premurose e la comprovata di scienza dei materiali. Finanziamento di quest’opera fu fornito dalla Dubinsky nuova iniziativa premio e istituti nazionali di salute NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.

Materials

1M Hydrogel Chloride (HCl) EMD HX0603-75 2.5L Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
1X PBS Gibco 14040-133 500 mL None
Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) Sigma-Aldrich 228737-500g Use with eye protection and gloves.
Sodium Hydroxide (NaOH) Macron Chemicals 278408-500g Use with eye protection and gloves.
Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) Fisher Scientific AC45180010 1 kg Use with eye protection and gloves.
Methanol (CH3OH) J.T. Baker 9070-05 4L Use in fume hood with eye protection and gloves.
VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS VWR 97068-085 Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
Mineral oil CVS  PLD-B280B None
Round bottom flask ChemGlass N/A
Thermometer N/A
Stir bar N/A
Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick Thermo Scientific 420-004T Spray with ethanol and let dry prior to use.
Glass pasteur pipets N/A
1 mL rubber bulbs N/A
Plastic 100 mm petri dishes N/A
Sterile forceps N/A
Silicone isolators 0.8 mm thick
Polydimethylsiloxane (PDMS) punches N/A
Glass bottles N/A
6 well plates Cellstar 657 160 N/A
Filter Paper Whatman 8519 N/A
Stirrer-hot plate VWR Dya-Dual 12620-970 Use with eye protection and gloves.
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 Sigma-Aldrich 24650-42-8 Use with eye protection and gloves.
1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) Aldrich Use with eye protection and gloves.
Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) Fluka 81280-1kg Use with eye protection and gloves.
RGDS Life Tein 180190 Use with eye protection and gloves.
Blak-Ray long wave UV lamp UVP Model B 100AP N/A
Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 N/A

References

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Cite This Article
Pellowe, A. S., Lauridsen, H. M., Matta, R., Gonzalez, A. L. Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture. J. Vis. Exp. (130), e56384, doi:10.3791/56384 (2017).

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