Ultrathin दोहरी सेल संस्कृति के लिए एक Biomimetic तहखाने झिल्ली के रूप में लोचदार Hydrogels Porated
Summary
वर्तमान bilayer संस्कृति मॉडल के लिए कार्यात्मक इन विट्रो अध्ययन है कि vivo microenvironments में नकल की अनुमति नहीं देते । पॉलीथीन ग्लाइकोल और एक जस्ता ऑक्साइड templating विधि का उपयोग करना, इस प्रोटोकॉल स्वरित्र कठोरता, porosity, और जैव रासायनिक संरचना है कि बारीकी से vivo में नकल के साथ एक ultrathin biomimetic तहखाने झिल्ली के विकास का वर्णन extracellular मैट्रिक्स.
Abstract
तहखाने झिल्ली सेलुलर bilayers का एक महत्वपूर्ण घटक है कि कठोरता में भिंन हो सकते हैं, संरचना, वास्तुकला, और porosity । endothelial के इन विट्रो में अध्ययन-उपकला bilayers पारंपरिक रूप से पारगंय समर्थन मॉडल है कि bilayer संस्कृति को सक्षम पर भरोसा किया है, लेकिन पारगंय का समर्थन करता है मानव तहखाने झिल्ली की विविधता को दोहराने की क्षमता में सीमित हैं. इसके विपरीत, hydrogel मॉडल है कि रासायनिक संश्लेषण की आवश्यकता होती है अत्यधिक स्वरित्र और दोनों सामग्री कठोरता और biomimetic पेप्टाइड्स या प्रोटीन के शामिल किए जाने के माध्यम से जैव रासायनिक संरचना के संशोधनों के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, पारंपरिक hydrogel मॉडल कार्यक्षमता में सीमित है क्योंकि वे कमी सेल के लिए pores-सेल संपर्क और कार्यात्मक इन विट्रो माइग्रेशन अध्ययन में हैं । इसके अतिरिक्त, पारंपरिक hydrogels की मोटाई के कारण, का निगमन pores कि अवधि hydrogels की पूरी मोटाई चुनौतीपूर्ण गया है । वर्तमान अध्ययन में, हम biomimetic hydrogels की पिछली कमियों का पता करने के लिए पाली-(ईथीलीन-ग्लाइकोल) (खूंटी) hydrogels और एक उपंयास जिंक ऑक्साइड templating विधि का उपयोग करें । एक परिणाम के रूप में, हम एक ultrathin, तहखाने झिल्ली की तरह hydrogel कि धाराप्रवाह सेलुलर bilayers की संस्कृति चर ताकना वास्तुकला, यांत्रिक गुणों के साथ एक अनुकूलन पाड़ पर, और जैव रासायनिक संरचना परमिट पेश करते हैं ।
Introduction
Extracellular मैट्रिक्स (ECM) ऊपर प्रोटीन पाड़ों कि सेल लगाव का समर्थन और विशिष्ट कोशिका प्रकार के बीच बाधाओं के रूप में सेवा और जटिल ऊतकों और अंगों का एक अनिवार्य घटक है बनाते हैं । मध्य संयोजी ऊतक के विपरीत, तहखाने झिल्ली (बीएम) ECM की एक विशेष प्रकार है कि एक दूसरे से ऊतक डिब्बों को विभाजित करने के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है । बीएमएस लगभग १०० µm मोटी हैं, और इसलिए दोनों ओर कोशिकाओं के बीच प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संचार के लिए अनुमति देते हैं । बीएमएस के दो सामान्य उदाहरण संवहनी बीएमएस हैं, pericytes और endothelial कोशिकाओं के बीच microvascular दीवार में पाया जाता है, और airway बीएमएस जो endothelial और उपकला कोशिकाओं के बीच पाया जाता है । बीएमएस कोशिका कार्य, जैसे कोशिका ध्रुवीकरण और प्रवास के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका की सेवा, स्वास्थ्य और रोग में । 1 रचना, कठोरता, वास्तुकला, और बीएमएस के porosity अलग शारीरिक कार्यों की सुविधा के लिए अंग प्रणालियों के पार बदलता है । उदाहरण के लिए, बीएम pores सेल-सेल संचार, घुलनशील अणु प्रसार, और संक्रमण के दौरान सूजन या बैक्टीरिया के दौरान प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवास के लिए बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं । वायुमार्ग में, pores ०.७५ से ३.८६ µm.2 से लेकर व्यास के साथ, बीएम की पूरी मोटाई अवधि
बीएम की पतली प्रकृति सुनिश्चित करता है कि हालांकि कोशिका प्रकार शारीरिक रूप से एक दूसरे से अलग कर रहे हैं, paracrine के माध्यम से सेलुलर संचार-और संपर्क मध्यस्थता संकेत संरक्षित है । इस प्रकार, इन विट्रो में मानव रोग का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं ने संस्कृति सेलुलर bilayers के लिए असुरक्षित पारगंय समर्थन आवेषण पर भरोसा किया है । 3 इन मॉडलों स्वास्थ्य और रोग में एक भूमिका निभाता है कि सेलुलर संचार को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है । 3 , 4 , 5 , ६ , 7 पारगंय समर्थन संमिलित करता है कैसे कोशिका-कोशिका संकेतन शारीरिक प्रक्रियाओं, जैसे ल्युकोसैट भर्ती और जीवाणु घुसपैठ को नियंत्रित करता है समझने के लिए बुनियादी आवश्यकताओं को संतुष्ट; हालांकि, आवेषण महत्वपूर्ण सीमाएं है और एक मानव बीएम. पारगंय समर्थन आवेषण दोनों यांत्रिक और जैव रासायनिक tunability कमी की नकल करने में विफल है, और सरलीकृत असुरक्षित संरचना रेशेदार संरचना है कि बनाता है नकल नहीं अनियमित pores बीएमएस की खासियत । इसलिए, वहाँ स्वरित्र प्रणालियों कि सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कि देशी बीएम संपत्तियों बहलाना कर सकते हैं के लिए एक की जरूरत बढ़ रही है.
बहुलक आधारित सब्सट्रेट biomimetic बीएमएस के विकास के लिए एक संदर्भ में सेलुलर bilayers अध्ययन करने के लिए आदर्श उंमीदवार है कि अधिक बारीकी से vivo वातावरण में नकल । 8 , 9 , 10 , 11 , 12 पॉलिमर यांत्रिक रूप से स्वरित्र हैं और biomimetic पेप्टाइड टुकड़ों को शामिल करने के लिए रासायनिक संशोधित किया जा सकता है। 11 , 12 , 13 गैर निष्क्रिय बहुलक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) biomimetic बीएमएस का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और हाल ही में काम यांत्रिक स्वरित्र खूंटी arginine-glycine-एसपारटिक एसिड (RGD) जैल असुरक्षित नेटवर्क है कि सेल विकास का समर्थन के साथ विस्तृत किया है और भड़काऊ सेल chemotaxis । 14 हालांकि प्रकाशित खूंटी आधारित सब्सट्रेट पारगंय का समर्थन करता है की तुलना में एक मानव ECM का एक और अधिक यथार्थवादी मॉडल प्रदान की, इन मॉडलों के कई मोटे तौर पर कर रहे हैं, लगभग ७७५ µm की गहराई के साथ कि सेल सेल के साथ bilayer संस्कृतियों बनाने की क्षमता सीमा संपर्क. 14
यहां, हम एक खूंटी बहुलक के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद बीएम नकल आधारित है कि वर्तमान सेल bilayer संस्कृति प्रौद्योगिकियों की सीमाओं के कई पर काबू । हम एक templating विधि है कि जस्ता ऑक्साइड, माइक्रोक्रिस्टलाइन उत्पादन के निर्माण के लिए एक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल सामग्री को शामिल किया है, बहुलक में संश्लेषण और crosslinking के दौरान, जो बाद में है और चुनिंदा से हटा दिया विकसित किया है परिणामी बल्क बहुलक । इस प्रक्रिया में एक यादृच्छिक छिद्रित नेटवर्क उत्पंन करता है, कपटपूर्ण और मानव बीएमएस के परस्पर ताकना नेटवर्क नकल उतार । इसके अलावा, porosity सुई उत्पादन के दौरान प्रतिक्रिया stoichiometry के संशोधन के माध्यम से जस्ता ऑक्साइड microcrystals के आकार और आकार को बदलने के द्वारा बदला जा सकता है । यहां विकसित तकनीक एक ultrathin hydrogel है कि मानव बीएम की मोटाई नकल करता है बनाता है । अन्त में, यांत्रिकी, porosity, और इन बीएम की जैव रासायनिक रचना-जैसे constructs को आसानी से एक microenvironment उत्पन्न करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है कि सबसे vivo मेंदेखा है कि इसी तरह की ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां विस्तृत प्रोटोकॉल हमें एक स्वरित्र खूंटी hydrogel बनाने के लिए एक biomimetic बीएम पाड़ के रूप में सेवा की अनुमति दी है । विशेष रूप से, खूंटी आणविक भार अलग से, पेप्टाइड विकार रणनीतियों, और जिंक ऑक्साइड माइक्रोक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अपने विचारशील बातचीत और सामग्री विज्ञान विशेषज्ञता के लिए प्रो पॉल वान लटकन और प्रो Chinedum Osuji शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस कार्य के लिए धन Dubinsky नई पहल पुरस्कार और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान NIBIB BRPR01 EB16629-01A1 द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
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