Summary
Aqui descrevemos os métodos para avaliar a resposta celular à estimulação mecânica aguda. No ensaio baseado em microscopia, examinamos a localização de biosensores fluorescente-etiquetadas após estimulação breve com fluxo de cisalhamento. Também testamos a ativação de várias proteínas de interesse em resposta à estimulação mecânica aguda bioquimicamente.
Abstract
Quimiotaxia, ou migração de um gradiente de um quimiotático, é o melhor modo compreendido de migração dirigida. Estudos utilizando social ameba Dictyostelium discoideum revelou que uma rede de transdução de sinal complexo de vias paralelas amplifica a resposta ao quimioatraentes e leva a polimerização de actina tendenciosa e protrusão de um pseudopod no direção de um gradiente. Em contraste, os mecanismos moleculares dirigindo outros tipos de migração dirigida, por exemplo, devido à exposição ao cisalhamento fluxo ou campos elétricos, não são conhecidos. Muitos reguladores de quimiotaxia exibem localização no líder ou borda de revestimento de uma célula de migração, bem como mostram mudanças transientes na localização ou ativação após estimulação global com um quimiotático. Para entender os mecanismos moleculares de outros tipos de migração dirigida, desenvolvemos um método que permite o exame da resposta celular à estimulação mecânica aguda, com base em breve (2-5 s) exposição ao fluxo de cisalhamento. Esta estimulação pode ser entregue em um canal enquanto imagem células expressando fluorescente-etiquetadas biosensores para examinar o comportamento de células individuais. Além disso, a população celular pode ser estimulada em um prato, lysed e immunoblotted usando anticorpos que reconhecem versões ativas de proteínas de interesse. Combinando os dois ensaios, um pode examinar uma ampla gama de moléculas ativadas por alterações na localização subcellular e/ou fosforilação. Usando esse método, determinamos que estimulação mecânica aguda provoca ativação das redes de citoesqueleto sinal quimiotáxico transdução e actina. A capacidade de examinar as respostas celulares à estimulação mecânica aguda é importante para compreender os eventos inicial necessários para motilidade induzida pelo fluxo de cisalhamento. Esta abordagem também fornece uma ferramenta para o estudo da rede de transdução de sinal quimiotáxico sem a influência de confundimento do receptor quimiotático.
Introduction
Migração de células eucarióticas é tendencioso por diversas pistas químicas e físicas no ambiente, incluindo gradientes de solúveis ou substrato-limite quimioatraentes, rigidez variável de substratos, campos elétricos, o fluxo de cisalhamento. Embora tenha havido muitos avanços na nossa compreensão dos mecanismos moleculares dirigindo quimiotaxia, menos é conhecido sobre outros tipos de migração dirigida e como esses diversos sinais são integrados no nível celular para produzir um unificado migratórias resposta.
Dirigido a migração em direção a uma concentração crescente de um quimiotático envolve três componentes comportamentais: motilidade direcional sensoriamento e polaridade1. Motilidade refere-se ao movimento aleatório de células alcançado pela protrusão pseudopod. Direcional é a capacidade de uma célula para detectar a origem de um quimiotático de detecção, que pode ocorrer mesmo em imobilizado células. Polaridade se refere à distribuição assimétrica mais estável dos componentes intracelulares, entre a borda do revestimento de uma célula, o que leva a maior persistência em movimento e líderes.
Resposta celular a um quimiotático depende da atividade de quatro redes reguladoras conceitualmente definidas: receptor / proteína G, transdução de sinal, citoesqueleto de actina e polaridade1. Quimiotático de ligação ao receptor acoplado à proteína G transmite o sinal via Via G proteínas α e βγ para a rede de transdução de sinal a jusante, que amplifica o sinal direcional. Vários caminhos dentro da rede de transdução de sinal agem em paralelo e alimentam a rede de citoesqueleto de actina para polimerização de actina viés e protrusão pseudopod consequente, na direção do gradiente. Entre os importantes reguladores da quimiotaxia são Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-quinase (PI3K), homólogo fosfatase e tensin (PTEN) e guanylyl-ciclase. Mecanismos de feedback dentro da rede de transdução de sinal e entre a transdução de sinal e redes de citoesqueleto de actina mais amplificam a resposta. Finalmente, a rede de polaridade mal definidos recebe entrada do citoesqueleto de actina e preconceitos ainda mais a rede de transdução de sinal para promover a migração persistente na direção do gradiente.
Muito de nossa compreensão mecanicista da quimiotaxia foi tornado possível por causa do desenvolvimento de biossensores fluorescente-tag para vários componentes das redes reguladoras. Muitos reguladores de quimiotaxia tem uma distribuição assimétrica da molécula reguladora em si ou a sua actividade. Por exemplo, biosensores que reconhecem ativado versões de pequenas GTPases Ras e Rap1 – domínios de ligação de Ras de Raf1 (referido como RBD aqui) e RalGDS, respectivamente – localizar a extremidade dianteira de uma célula de chemotaxing2,3. Da mesma forma, PI3K e seu produto fosfatidilinositol (3, 4,5)-triphosphate (PIP3), reconhecido por um domínio de homologia (PH) plecstrina, também mostram a localização na frente de um celular4,5. Em contraste, um 3-fosfatase PTEN, que converte a PIP3 volta a fosfatidilinositol (4,5)-bisfosfato, localiza-se à borda da célula6de atraso. Importante, estes biosensores alterar sua localização em resposta à estimulação global com um quimiotático. Marcadores de ponta, que são citosólica ou nas pontas de saliências em uma célula de descanso, relocalize ao córtex, Considerando que o atraso marcadores de borda, que têm localização cortical e estão ausentes das pontas dos saliências em uma célula de descanso, se tornar citosólico após estimulação. Análise da distribuição de biosensor em resposta à estimulação global com um quimiotático minimiza a contribuição de motilidade e polaridade, que muitas vezes confundem as observações. Estimulação global ou uniforme de uma suspensão de células com um quimiotático também é usada como uma ferramenta para avaliar alterações de toda a população na ativação da proteína, muitas vezes detectado por fosforilação de proteínas a7,8,9 . Este ensaio bioquímico é usado principalmente para obter informação temporal, Considerando que a microscopia é usada para reunir informações temporais e espaciais sobre o comportamento de vários componentes das redes reguladoras.
A rede de transdução de sinal incorpora características de um sistema excitável10,11. Respostas aos estímulos Quimiotáticos supralimiar são "tudo ou nada" e exibir os períodos refratários. As respostas também são acionadas estocàstica e podem mostrar comportamento oscilatório. Eventos de transdução de sinal estão localizados as regiões do córtex que se propagam como ondas12,13,14,15. Frente, trás, marcadores são recrutados para ou dissociam-se, as zonas activas das ondas propagação. Devido a região refratária à direita da zona activa, as ondas opostas dirigidas aniquilar como eles se encontram. As propagação ondas de transdução de sinal fundamentam as saliências celulares que medeiam a migração de células10.
Grande parte das informações acima mencionadas na quimiotaxia veio os estudos sobre a ameba social Dictyostelium discoideum, embora semelhantes mecanismos reguladores são também aplicáveis aos neutrófilos e outros tipos de células de mamíferos16 . Dictyostelium é um organismo modelo bem estabelecida que tem uma robusta quimiotático resposta durante a fome, quando milhares de células únicas migram em direção a um centro de agregação, eventualmente formando um corpo multicelular de frutificação contendo esporos. Quimiotaxia é também essencial durante a fase de crescimento de célula única deste organismo para localizar fontes de alimento bacteriana. Importante, migração de células únicas Dictyostelium é notavelmente semelhante a migração de neutrófilos mamíferos ou células de câncer metastático, os quais sofrem muito rápida migração ameboide-tipo. Na verdade, ambos a topologia global das redes reguladoras, bem como muitas das vias de transdução de sinal individuais envolvidas na quimiotaxia são conservadas entre Dictyostelium e leucócitos mamíferos17. Além disso, outras células, como fibroblastos, usam quinase de tirosina do receptor (RTK) em vez de GPCRs; no entanto, RTKs pode alimentar em redes semelhantes.
Em contraste com a quimiotaxia, informação detalhada sobre os mecanismos de sinalização que levam vários outros modos de migração dirigida é carente. Da mesma forma às células migrando em um gradiente quimiotático vários estudos relataram ativação e/ou localização de marcadores típicos de vanguarda, incluindo polimerização de actina, PIP3 e/ou quinase de sinal-regulado extracellular (ERK) 1/2, no frente de células em fase dirigido a migração em resposta ao cisalhamento fluxo ou alterações nos campos elétricos18,19,20,21. No entanto, nestes estudos exposição contínua ao estímulo também resultou na migração celular, deixando em aberto a questão se, por exemplo, os marcadores de ponta localizar especificamente em resposta a um estímulo, ou se eles simplesmente localizar na vanguarda por causa do aumento do número de pseudopods na frente de uma célula de migração.
Desenvolvemos os ensaios que nos permitem observar a resposta das células à aguda perturbação mecânica entregada como fluxo de cisalhamento, tanto a nível da população e como células individuais22. Semelhante à estimulação global com um quimiotático, pós-dose agudação com fluxo de cisalhamento permite o estudo da resposta celular a um estímulo mecânico sem a contribuição de confundimento de motilidade ou polaridade. Combinar estes ensaios bioquímicos e microscópicos com perturbações genéticas ou farmacológicas nos permite aprender sobre estímulos mecânicos como são percebidos e transmitida. Além disso, esta abordagem também fornece um método novo para grampear a jusante do sistema do receptor quimiotático na ausência de um quimiotático, isolando, assim, as redes sinal transdução e actina citoesqueleto do receptor/G rede de proteínas.
Usando as técnicas descritas abaixo nós recentemente demonstrou que a tensão de cisalhamento aguda leva à ativação de vários componentes do sinal quimiotáxico transdução e actina citoesqueleto redes22. Aplicando o estímulo mecânico agudo em intervalos variáveis, temos demonstrado que, da mesma forma quimioatraentes, resposta a estímulos mecânicos também exibe características de um sistema excitável, incluindo o comportamento tudo ou nada da resposta sob saturar as condições e a presença de um período refratário. Finalmente, combinando estimulação mecânica e química, mostramos que os dois estímulos compartilham sinal transdução e actina citoesqueleto redes, permitindo que o provável para a integração de múltiplos estímulos a migração celular viés.
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Protocol
1. preparação de soluções
- HL-5 preparar mídia usando o seguinte: glicose 10 g/L, peptona proteose de 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 g/L KH 2 de 0,965 g/L PO 4 e, salvo indicação em contrário, estreptomicina 0,03 g/L em água desionizada. Autoclave a médio e armazenar à temperatura ambiente.
Nota: Devido às diferenças entre proteose peptona e levedura extrato adquiridos de fornecedores diferentes, bem como entre lotes individuais, pH dos meios de comunicação pode precisar ser ajustada ao intervalo típico de 6,4 para 6.7. - Placas de SM preparar usando o seguinte: glicose 10 g/L, peptona de 10 g/L, 1 g/L de levedura extrato, 2,31 g/L KH 2 PO 4, 1G/L K 2 HPO 4 e ágar de 20 g/L em água desionizada. Autoclave, esfriar e despeje 30 mL da solução de agar por prato de Petri de 10 cm. Uma vez que o ágar solidifies, armazenar as placas a 4 ° C por até 1 mês.
- Preparar 10 x usando o tampão de fosfato (PB) 13,4 g/L, Na 2 HPO 4 ·7H 2 O e 6,8 g/L KH 2 PO 4 em água desionizada. Armazenar o estoque de 10x em 4 ° C. diluir para 1 x com água desionizada para uso.
- Preparar o Buffer de DB, completando 1 X PB com 2 mM de MgSO 4 e 0,2 mM CaCl 2.
- Preparar cafeína de 100mm em água desionizada. Guarde este medicamento em − 20 ° C.
- Preparar 100 mM acampamento solução dissolvendo-se acampamento de sódio monohidratado sal em água desionizada. Prepare um 1mm trabalhar ações em água desionizada. Armazenar as duas soluções estoque em − 20 ° C. preparar acampamento solução final na concentração desejada no DB no dia do experimento.
Nota: Soluções de estoque podem ser congelar-descongelar algumas vezes. - Preparar ácido fólico de 25 mM em 1 x PB. Adicione algumas gotas de 1 N de NaOH até o pó dissolve-se completamente. Guarde este medicamento em − 20 ° C.
- Prepara amortecedor da amostra x 3 usando o seguinte: pH 187,5 mM Tris-HCl 6,8, 6% (p/v) sulfato dodecyl de sódio (SDS), 30% de glicerol, ditiotreitol 126 mM e 0,03% (p/v) de bromofenol. Alíquota e loja em − 20 ° C.
- Antes de usar, descongelar em banho maria a 37 ° C e prosseguir para preparar o amortecedor da amostra com inibidores de protease e fosfatase diluindo 3 x amortecedor da amostra a 1 x, e adicionando 50mm NaF, 2mm at 3 VO 4, pirofosfato de sódio 25 mM e 1 x completo livre de EDTA inibidor da protease cocktail em água desionizada. Adicionar os inibidores imediatamente antes de iniciar o procedimento descrito nos passos 3.1.2-3.1.3.
- Preparar 5 mM Latrunculin A solução em DMSO. Alíquota e loja em − 20 ° C.
2. Preparação de células de d. discoideum
Nota: manter as células d. discoideum na mídia HL-5 também em placas de cultura de tecidos ou em suspensão cultura conforme descrito anteriormente 23. Quando necessário, transformar células com biossensores fluorescente-etiquetadas de acordo com o padrão electroporation protocolos 24. Várias cepas de d. discoideum, bem como plasmídeos codificação biosensores ou outros genes de interesse podem ser obtidas com o centro de estoque Dicty (dictybase.org).
- Crescimento e coleção de células vegetativas d. discoideum
- para análise de células vegetativas, desenvolvem-se células na presença de bactérias para reduzir o número de macropinosomes, que são tipicamente observadas as células cultivadas axenically 25.
- Prepare uma cultura de Klebsiella aerogenes pela inoculação de um pequeno número de células de um estoque de glicerol ou de uma cultura anterior para o volume desejado de HL-5 meio sem antibióticos. Incubar a cultura bacteriana em um agitador orbital a 200 rpm (0,42 x g) à temperatura ambiente (20-22 ° C) por 16-18 h.
Nota: O K. aerogenes estirpes utilizadas aqui é não-patogênicas (veja a Tabela de materiais).
- Prepare uma cultura de Klebsiella aerogenes pela inoculação de um pequeno número de células de um estoque de glicerol ou de uma cultura anterior para o volume desejado de HL-5 meio sem antibióticos. Incubar a cultura bacteriana em um agitador orbital a 200 rpm (0,42 x g) à temperatura ambiente (20-22 ° C) por 16-18 h.
- Recolher d. discoideum em fase de crescimento exponencial de placas de cultura de tecido ou de uma cultura de suspensão e contar as células usando um hemocytometer de acordo com o fabricante ' instruções s. Espalhe 1 x 10 5 d. discoideum células com suspensão de K. aerogenes µ l 260 em um prato de SM. Vire a placa de cabeça para baixo no dia seguinte. Desenvolvem-se células em temperatura ambiente até as células de d. discoideum começam a limpar o gramado bacteriano, mas antes que eles começam a agregar (~ 36-48 h).
- Coletar células de d. discoideum no buffer de 5ml DB raspando-os com um difusor de vidro. Transferência de células para um tubo de polipropileno de 50 mL. Lave a placa com outro 5 mL DB e piscina com a suspensão original. Encha o tubo de 50 mL com tampão DB.
- Centrifugue a suspensão de d. discoideum x 360 g 3-4 min. Aspire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 50 mL Buffer DB. Repita as etapas de lavagem até que o sobrenadante é claro (~ 3 a 4 lavagens). Resuspenda o pellet de final de célula no buffer DB para uma densidade final de ~ 5 x 10 6 células/mL.
- para análise de células vegetativas, desenvolvem-se células na presença de bactérias para reduzir o número de macropinosomes, que são tipicamente observadas as células cultivadas axenically 25.
- Preparação de agregação-células competentes d. discoideum
- desenvolver d. discoideum células por inanição de 1 h, seguida por 4h de inanição e pulsando com acampamento de 50 nM cada 6 min de acordo com a norma protocolos 23.
- Na sequência de desenvolvimento, medir o volume final da suspensão celular.
- Com base no número inicial de células utilizadas para o desenvolvimento, calcular a densidade celular da suspensão final.
Nota: Se o acampamento é entregue em 100 volumes de µ l de cada 6 min, volume das células aumenta em 1 mL por cada hora de campo pulsante. Assim, para as condições padrão usando 8 x 10 7 células em 4 mL de DB, após 4 h de desenvolvimento, o volume final é 7 mL e a densidade celular final é ~1.1 x 10 7 células/mL.
3. Análise bioquímica da resposta celular mecânica ou química de estimulação
- Aguda mecânica estimulação de células seguido de lise celular
- placa de 2 x 10 6 competente-agregação de células (da etapa 2.2) após 4 h de desenvolvimento em 35mm pratos com 2ml DB. Permitir que as células anexar por 10 min à temperatura ambiente. Lave as células duas vezes com 1 mL de DB. Incubar as células no DB com cafeína 2,5 mM por 30 min sem qualquer perturbação das placas.
Nota: Se as células precisam ser tratados com um inibidor farmacológico, adicionar a concentração desejada de inibidor ou o mesmo volume de veículo apropriado durante basalation com cafeína. - Aplicar estimulação mecânica, coloque a placa (um de cada vez) em um agitador orbital e imediatamente ligá-lo a 150 rpm (0,24 x g) por 5 s.
Nota: A placa pode também ser manualmente estimulada pelo movimento de forma ft.lb por cerca de 5 s. - Aspirado o buffer para o indicado vezes após o início da estimulação. Lyse imediatamente as pilhas pela adição de tampão de amostra 100 µ l com inibidores de protease e fosfatase.
- Colocar a placa no gelo e coletar o lisado em um tubo de 1,5 mL. Para ' tempo 0 ', lisar as células sem tremer. Transferi os tubos a um bloco de calor de 95 ° C por 10 min, imediatamente após a Lise. Proceder com immunoblotting ou armazenar lysates em -20 ° C.
- placa de 2 x 10 6 competente-agregação de células (da etapa 2.2) após 4 h de desenvolvimento em 35mm pratos com 2ml DB. Permitir que as células anexar por 10 min à temperatura ambiente. Lave as células duas vezes com 1 mL de DB. Incubar as células no DB com cafeína 2,5 mM por 30 min sem qualquer perturbação das placas.
- Estimulação de células com um quimiotático
- Basalate células competentes de agregação após 4 h de desenvolvimento agitando rapidamente-os na presença de cafeína de 5 mM a 200 rpm (0,42 x g) em um agitador orbital por 30 min.
- Centrifugar a suspensão de célula x 360 g 3-4 min. Aspire o sobrenadante e resuspenda o pellet em 10 mL gelada Buffer DB. Repita a etapa de lavagem.
- Resuspenda o pellet de final de célula no buffer gelado de DB para uma densidade final de 4 x 10 7 células/mL, baseada o número de célula inicial utilizado para desenvolver as células (ver passo 2.2). Manter a suspensão de células no gelo antes stimulation.
- Pipeta 50 µ l de 10 µM acampamento ou veículo em um copo de poliestireno colocado em um agitador orbital.
- Para estimular as células, adicionar 450 µ l de suspensão de célula gelada no mesmo copo e ligar imediatamente o abanador a 200 rpm (0,42 x g). Em vários momentos após o início da estimulação (por exemplo, 10, 30, 45, 60, 120 s), brevemente interromper o abanador, tirar 50 alíquotas µ l de suspensão de células e lisar as células adicionando-as aos tubos de 1,5 mL contendo 25 µ l 3 X amortecedor da amostra.
- Para ' tempo 0 ', usar as células da suspensão celular gelada unstimulated.
Nota: A temperatura final da suspensão celular durante a estimulação é ~ 9 ° C 26. Nestas condições, o pico de resposta ocorre um pouco mais tarde do que o pico observado para a estimulação realizada à temperatura ambiente (por exemplo, estímulo quimiotático de células aderentes no microscópio, ou estimulação mecânica das células aderentes).
- Para ' tempo 0 ', usar as células da suspensão celular gelada unstimulated.
- Transferir os tubos para um bloco de calor de 95 ° C por 10 min, imediatamente após a Lise. Proceder com immunoblotting ou armazenar lysates em -20 ° C.
- Basalate células competentes de agregação após 4 h de desenvolvimento agitando rapidamente-os na presença de cafeína de 5 mM a 200 rpm (0,42 x g) em um agitador orbital por 30 min.
- Análise da resposta das células por Immunoblotting
- executar lysates (a partir de etapas 3.1.3 ou 3.2.4) em gel de poliacrilamida Tris-HCl 4-15%, transferir para uma membrana de fluoreto de polivinilideno e bloco immunoblot com phospho-PKC Ζ Thr410 (para detectar fosfo-PKBR1 e phospho-PKBA). Detectar o sinal pela incubação com rábano conjugada com peroxidase anticoelho anticorpo secundário, seguido por quimioluminescência utilizando substrato reforçada quimioluminescência.
- Para detecção de proteínas múltiplas, tira o blot com buffer de descascamento e re-sonda com um anticorpo primário contra phospho-p42/44 MAPK Thr302/304 (para detectar fosfo-ERK2). Confirmar a proteína igual carregamento pela coloração da membrana de fluoreto de polivinilideno com azul brilhante de Coomassie.
4. Aguda de estimulação mecânica e ao vivo de imagens de células únicas no microscópio
- avaliação da resposta à estimulação mecânica aguda usando um dispositivo de fluxo
- recolher e diluir vegetativa ou agregação-competente células para ~ 1 x 10 6 células/mL em DB conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2, respectivamente. Carregar ~ 600 µ l para o slide com um canal (consulte a Tabela de Material para obter detalhes). Permitir que as células anexar para 10 min. Certifique-se de que todas as entradas no slide estão completamente cheios. Top-up com buffer extra se necessário.
Nota: O slide específico usado para análise tem três entradas, que alimentam em canais estreitos, 1 mm, mas em seguida, mesclar para um canal de largo, 3 mm. A altura do canal é de 0,4 mm. Embora as células são banhadas em todo o canal, apenas a parte larga é fotografada. - Passar uma das linhas que é anexado a um reservatório de 50 mL através da válvula direita da frente da unidade fluídico (consulte a Tabela de materiais para obter detalhes). Usando o software para a bomba, verifique se a válvula está fechada (ou seja, para a esquerda). Encha o reservatório com DB.
- Ajustar a pressão a 50 mbar e ligá-lo. Preencher e passe a linha com DB clicando sobre a válvula para abri-lo. Transformar a pressão volta a 0 e fechar a válvula depois de ~ 30 s.
- Conectar a linha de uma das três entradas em um lado da lâmina sem interceptação quaisquer bolhas de ar. Conecte as outras duas entradas. Conectar a linha do dreno para a única entrada do segundo lado do slide.
Nota: O tubo usado para as linhas de entrada e drenagem nesta configuração tem um diâmetro interno de 1,6 mm. - Colocar o slide no microscópio sob um objectivo de ar X 20. Para lavar o canal, trocar a válvula para abrir a linha e clique em " pressão ON ", começando a pressão superior (~ 50 mbar ou ~ 40 dyn/cm 2) para empurrar o líquido através de para o ralo.
- Uma vez que o líquido é retirado o dreno, reduzir a pressão externa para zero (i. e. gravidade apenas, fluxo ~ 15 dyn/cm 2) e continuar enxaguando para ~ 30 s. interruptor da válvula para a posição oposta para parar o fluxo.
- Adquirir imagens com iluminação RFP ou GFP em um microscópio de fluorescência invertido sob um 40 X objetivo de óleo com 3 intervalos de s. Com a válvula na posição fechada, ligue a pressão à pressão desejada, normalmente entre 15 e 40 dyn/cm 2 (0 - 50 mbar).
- Depois de adquirir 5 quadros, entregar o estímulo comutando a válvula para o " abrir " posição. Desligue o fluxo após 2-5 s comutando a válvula para o sentido oposto.
Nota: Para certos biossensores mais fracos (por exemplo, PTEN, CynA e RalGDS) pode ser necessário para células de imagem usando um microscópio confocal, equipado com um 40 X objetivo petróleo.
- recolher e diluir vegetativa ou agregação-competente células para ~ 1 x 10 6 células/mL em DB conforme descrito nas etapas 2.1 e 2.2, respectivamente. Carregar ~ 600 µ l para o slide com um canal (consulte a Tabela de Material para obter detalhes). Permitir que as células anexar para 10 min. Certifique-se de que todas as entradas no slide estão completamente cheios. Top-up com buffer extra se necessário.
- Teste de efeitos de inibidores farmacológicos em resposta à estimulação mecânica aguda, usando um dispositivo de fluxo de
- placa células no slide com um canal, conforme descrito na etapa 4.1.1. Configurar duas linhas: passar uma linha através da válvula direita frontal como na etapa 4.1.2, e o segundo pela parte de trás deixou a válvula. Prenda a linha esquerda e coloque a válvula " fechado " posição (esquerda). Preencher uma linha com DB contendo o veículo apropriado e a segunda com a solução que contém um inibidor farmacológico de interesse (por exemplo, 5 µM Latrunculin A).
Nota: É necessário fixar fisicamente a linha esquerda porque o " fechado " posição esquerda abre a válvula para essa linha. - Preenchimento e enxaguar o direito linha ligando a pressão a 50 mbar e a comutação da válvula para o " abrir " posição (à direita). Trocar a válvula à esquerda depois de ~ 30 s. preenchimento e enxaguar a linha esquerda, removendo o grampo para ~ 30 s. Connect ambas as linhas para duas das entradas de um lado da lâmina com um canal, ligar a entrada restante e conectar o ralo da única entrada no segundo lado. < / l Eu >
- lavar o slide com o amortecedor na linha certa e realizar a estimulação a mesma reserva, conforme descrito nas etapas 4.1.3 e 4.1.4 acima.
Nota: Embora a linha certa foi escolhida como o primeiro nesta configuração, a ordem pode ser invertida. - Após estimulação, trocar a válvula para abrir a linha certa à pressão zero (ou seja, fluxo de gravidade somente, ~ 15 dyn/cm 2). Remova o grampo da linha de esquerda e trocar a válvula à esquerda para abrir essa linha. Braçadeira de primeira linha.
- Após a execução de 3-5 mL de tampão com inibidor através de, trocar a válvula para a direita para parar o fluxo e incube as celulas com o inibidor para o comprimento necessário de tempo (por exemplo, 15 min). Ligue o fluxo comutando a válvula cada min ~ 10 ~ 15 s para evitar a privação de oxigênio. Repita a estimulação com a segunda linha.
- placa células no slide com um canal, conforme descrito na etapa 4.1.1. Configurar duas linhas: passar uma linha através da válvula direita frontal como na etapa 4.1.2, e o segundo pela parte de trás deixou a válvula. Prenda a linha esquerda e coloque a válvula " fechado " posição (esquerda). Preencher uma linha com DB contendo o veículo apropriado e a segunda com a solução que contém um inibidor farmacológico de interesse (por exemplo, 5 µM Latrunculin A).
- Método alternativo para avaliar a resposta à estimulação mecânica aguda utilizando uma micropipeta
- Configurar a micropipeta preenchida com DB, de acordo com o protocolo padrão 23. Manter a pressão de compensação a 1.500 psi.
- Recolher e diluir as células vegetativas, conforme descrito no passo 2.1. Gotas de lugar 25 µ l de ~7.5 x 10 5 células/mL em uma câmara de 1-bem, permitem aderir pelo menos 10 min e cobrir com 3 mL DB.
- Coloque a câmara em um microscópio de fluorescência invertido equipado com um objectivo de óleo X 40. Localize as células. Baixe a micropipeta suavemente no meio do campo de visão até que primeiro toca o fundo da câmara.
Nota: Desde que a pressão de compensação foi fixada em 1.500 Psi, as células serão continuamente expostas a um fluxo muito lento de DB da micropipeta. - Começar a aquisição de imagens com iluminação RFP ou GFP com 3 intervalos de s. Aplicar o ' limpa ' função para liberar um bolus de líquido proveniente da micropipeta. Continue eu imagingn a presença de fluxo devido à pressão de compensação sozinho.
- Um método alternativo para avaliar a resposta à estimulação mecânica aguda, usando a adição de tampão de massa
- recolher e diluir as células vegetativas, conforme descrito no passo 2.1. Coloque 20 gotas de µ l de células em ~ 1 x 10 6 células/mL em DB no meio de um poço de uma câmara de 8 poços. Permitir que as células aderir durante pelo menos 10 min.
- Começar a aquisição de imagens com iluminação de RFP GFP-específico ou em um microscópio de fluorescência invertido equipado com um objetivo X 40 em 3 intervalos de s. Focar em uma área perto da borda da gota.
- Rapidamente adicionar 430 µ l de DB para o lado do bem. Continue imagens.
- Para análise da interação entre estímulos mecânicos e químicos, 12 ou 45 s após estimulação mecânica, suavemente adicionar 50 µ l de ácido fólico (concentração final 20 nM) ou veículo (DB) sem induzir uma resposta mecânica. Continue imagens.
- Quantificação da resposta
- abrir a imagem TIFF de 32 bits do software de análise de imagem (veja Tabela de materiais para obter detalhes) 27.
- Sob a ' Analyze ' guia, vá para " conjunto de medições ". Marque a caixa para ' valor de Gray quer dizer '. Certifique-se que as outras caixas não são verificadas. Clique " Okey ".
- Sob a ' processo ' guia, clique em " subtrair fundo ". Manter o raio de esfera rolamento de 50 pixels e fazer não verificação de qualquer uma das opções listadas no menu. Zoom em uma célula usando o ' lupa ' ferramenta.
- Usando o ' retângulo ' tool, desenhe uma caixa (~2.5 x 2,5 µm 2) no citosol, certificando-se não de desenhá-lo sobre o núcleo ou a membrana plasmática. Imprensa " Ctrl " + " M " de teclas ou ir para o ' Analyze ' guia e clique no " medida " para determinar o valor médio de cinza da caixa. Avanço para quadros subsequentes e medir novamente, certificando-se a caixa fica no citosol.
Nota: Como d. discoideum células se move muito rapidamente a caixa pode ser movida de um quadro para o outro para mantê-lo no citosol. - Afinal os quadros foram analisadas, copiar os valores em uma planilha. Para compensar a variação de célula para célula dos níveis de expressão de diversos biossensores, normalize os valores para o valor de cinza médio observado no tempo 0. Calcular a recíproca dos valores para refletir o acúmulo do sinal no córtex.
5. Contínua estimulação mecânica e ao vivo de imagens de células únicas no microscópio
- configurar as células exatamente como descrito acima para a análise de estimulação mecânica aguda em etapas 4.1.1 - 4.1.3. Abra a ficha cobrindo o reservatório com o buffer, então o volume pode ser coberto, se a resposta é analisada por mais de alguns minutos a uma hora.
Nota: Porque o reservatório permanece aberto para a duração do experimento, este ensaio é realizado na ausência de pressão externa e baseia-se no fluxo de gravidade sozinho. Para aumentar a taxa de fluxo por gravidade, o dreno pode ser colocado em uma tabela abaixo do microscópio. - Começar células com iluminação de RFP GFP-específico ou em um microscópio de fluorescência invertido equipado com um objetivo X 40 em 3 intervalos de s para a análise das respostas de biosensor de imagem. Alternativamente, imagem com contraste de fase usando um objectivo X 20 intervalos de 10 s para análise de migração celular global.
- Ligue o fluxo após vários quadros no ajuste de pressão zero (ou seja, o fluxo é devido à gravidade sozinha ou ~ 15 dyn/cm 2) comutando a válvula na posição aberta. Quando o nível do líquido cai para 5-10 mL no reservatório, cobri com mais reserva. Certifique-se de adicionar o líquido cuidadosamente para que as bolhas de ar não ficar preso nas linhas.
Nota: É importante adicionar fluido da mesma temperatura para evitar uma resposta de choque nas células. - Quantificar a velocidade de célula e persistência usando software de análise de migração (veja a Tabela de materiais para obter detalhes) de acordo com o fabricante ' instruções de s.
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Representative Results
Resposta temporal de reguladores de quimiotaxia para estimulação mecânica aguda
Para avaliar a resposta das células de d. discoideum à estimulação mecânica, células aderentes de agregação-competentes foram expostas a um breve pulso de fluxo de cisalhamento. Agregação-competente D. discoideum células secretam o acampamento, que pode ser percebido pelas células. Para superar a contribuição de sinalização celular, as células foram tratadas com cafeína, que inibe a adenilato ciclase em d. discoideum e, portanto, impede a secreção acampamento28. Com efeito, as células pré-tratadas com cafeína tinha muito baixa atividade basal de PKBR1 e ERK2 e mostrou um aumento robusto para a fosforilação de resíduos de chave estas quinases seguindo 5 estimulação s com fluxo de cisalhamento (figura 1A). A resposta foi transitória e pico em torno de 10-15 s para PKBR1 e em torno de 30 s para ERK2, da mesma forma que anteriormente publicou as descobertas para a ativação dessas proteínas com um quimiotático7.
Embora seja difícil avaliar a eficiência da resposta Considerando o baixo nível basal, estudos preliminares que levaram ao desenvolvimento deste teste, comparado a estimulação com fluxo de cisalhamento sozinho (ou com um veículo) para distorcer o fluxo na presença de um quimiotático cAMP (figura 1B). Esta análise não mostrou um aumento na resposta com o acampamento, sugerindo que a resposta da rede de transdução de sinal para cortar o fluxo está saturada. Embora neste ensaio acampamento não aumentar a fosforilação de PKBR1, a resposta das células para quimiotático pode ser observada usando um protocolo de estimulação padrão onde as células competentes de agregação são mantidas em suspensão, estimulados com acampamento e lysed em diversos após a estimulação de pontos de tempo. Como mostrado na Figura 1, nestas condições, há um aumento transitório na fosforilação de PKBR1 em resposta a quimiotático, mas não o veículo. O pico de resposta é observado em 30 s, neste ensaio, porque a temperatura da suspensão celular durante o ensaio é ~ 9 ° C, em comparação com ~ 22 ° C para estimulação mecânica ensaio descrito acima26.
Spatiotemporal resposta do líder e retardamento marcadores de borda à estimulação mecânica aguda
Desde que o ensaio de população acima apenas fornece informação temporal sobre o comportamento dos reguladores de quimiotaxia, células também foram expostas a um breve estímulo mecânico ao mesmo tempo sendo observado com um microscópio. Este ensaio pode ser realizado com agregação-competentes ou vegetativo d. discoideum células expressando diversos biossensores fluorescente-etiquetadas, cuja localização foi definida em células estimuladas com um quimiotático. Dois vanguarda marcadores, domínio de PH de Crac e CalΔcoil, que são recrutados pela PIP3 ou actina polimerizada recentemente, ambos mostraram principalmente localização citosólica nas células de descanso como relatado anteriormente (Figura 2A, suplementar 1 filme )4,29. Nas células que estavam ativas basalmente, estes biosensores também podem ser vistos na ponta dos pseudopods. Após estimulação com fluxo de cisalhamento por 2 s, os reinternacionalizada rapidamente ao córtex com um pico em ~ 6 a 10 de biosensores s e voltou para o citosol por ~ 30 s. Em contraste, um marcador de borda do revestimento PTEN localizadas no córtex antes de estimulação (Figura 2A). Após um breve pulso com fluxo de cisalhamento, citosólica PTEN intensidade aumentada, embora com dinâmica mais lenta do que para as vanguarda de biossensores. Uma mudança na localização de biosensor do citosol para o córtex e vice-versa, é vista claramente como uma mudança na intensidade citosólica permitindo a simples quantificação da resposta.
O comportamento observado dos biossensores em resposta à estimulação mecânica aguda é consistente com os principais e dinâmica de localização de borda em resposta à estimulação com uniforme quimiotático de retardamento. Esse comportamento não era exclusivo para os três biosensores mostrados. Como publicadas anteriormente, semelhantes alterações na localização também foram observadas para os marcadores de ponta RBD e RalGDS, que reconhece ativado Ras e Rap1, respectivamente, bem como quanto ao outro marcador de borda do revestimento CynA22,30.
Um ensaio similar pode ser usado para avaliar os efeitos de vários inibidores por uma modificação simples da instalação experimental de uma única linha de entrada para um duplo. Usando este método, as células podem ser primeiro expostas a condições de controle e depois mudou para o buffer que contém o agente de teste desejado. Por exemplo, adição de drogas actina-depolymerizing LatA bloqueado a resposta do RBD, bem como calΔcoil, à estimulação mecânica aguda (Figura 2B).
Resposta global precede a migração celular sob estimulação prolongada com fluxo de cisalhamento
A abordagem descrita aqui também pode ser adaptada para estudar os efeitos do fluxo de cisalhamento na migração de d. discoideum . Na verdade, se o fluxo não foi desligado após 2 s mas manteve-se sobre para a duração do experimento, as células vegetativas mostraram dirigido migração contra o fluxo (Figura 3suplementar Movie 2). Deve notar-se que o fluxo de cisalhamento necessário para eliciar uma resposta migratória foi menor que a pressão que era tipicamente usada para atingir uma resposta global com estimulação aguda nas células vegetativas (por exemplo, como visto na Figura 2B). Entretanto, mesmo com a pressão mais baixa, células exibido uma resposta uniforme robusta, como medido por uma mudança na localização deΔcoil de Cal, que precedeu a qualquer mudança na posição da própria célula. Assim, estas experiências mostraram claramente que 1) a resposta global não depende do movimento da célula, e 2) a resposta global precede a migração dirigida.
Abordagens alternativas de resposta à estimulação mecânica aguda de teste
Embora o uso de uma câmara de passagem tem vantagens claras para o estudo da resposta à estimulação mecânica aguda, nós também validada dois ensaios adicionais para testar a resposta das células individuais à estimulação mecânica aguda. Como mostrado na Figura 4, CalΔcoil rapidamente e transitoriamente re-localizadas do citosol para o córtex quando as células foram estimuladas pela adição de bólus de tampão entregue por uma micropipeta (Figura 4A) ou manualmente usando a granel adição de tampão com uma pipeta (Figura 4B). Deve notar-se que uma clara desvantagem de ambos estes ensaios é que a quantidade exata de força de cisalhamento, entregada à célula é desconhecida e não pode ser facilmente variada. No entanto, para situações onde a comutação entre estímulos mecânicos e químicos é desejada, adição de tampão em massa oferece uma alternativa sólida para a estimulação no dispositivo de fluxo.
Figura 1: resultados da representante por avaliação bioquímica da resposta das células de d. discoideum à estimulação mecânica ou química aguda. Agregação-competente células foram expostas a estímulos mecânicos ou químicos, lysed nos pontos de tempo indicado, e immunoblotted usando anticorpos que reconhecem phosphorylated PKBR1 ou ERK2. (A) as células aderentes foram estimuladas em um agitador orbital para 5 s. A membrana foi manchada com Coomassie brilhante azul (CBB) para mostrar a proteína igual a carregar. (B) as células aderentes foram estimuladas pelo movimento manual da placa de forma ft.lb para aproximadamente 5 seguinte s estimulação química devido à adição de acampamento 1 µM ou buffer (veículo), ou sem qualquer estímulo químico (-). Os dois immunoblots mostrar a extensão da variação na ativação basal de PKBR1 visto no tempo 0. Ocasionalmente, ativação PKBA também pode ser detectada por esta técnica, como mostrado no painel inferior. (C) suspensão células foram estimuladas com acampamento 1 µM ou buffer (veículo). Parte (A) desta figura foi modificado de Artemenko et al. (2016) 22. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resultados da representante por estimulação mecânica aguda e imagens ao vivo de células únicas no microscópio. (A) agregação-competente d. discoideum células expressando Cal RFP-com a tagΔcoil, ou GFP-etiquetado PH-Crac ou PTEN foram estimulados com fluxo unidirecional de laminar em 15 dyn/cm2 para 2 a 5 s. imagens foram coletadas a cada 3 s . Células representativas mostrando translocação dos biossensores em resposta à estimulação mecânica são mostradas. Acúmulo de cada biosensor no córtex foi quantificado como o inverso da média intensidade citoplasmática normalizado para tempo 0. As médias das respostas dos 18 (CalΔcoil), 20 (PH-Crac) ou 6 pilhas (PTEN) é mostrada. Valores são média ± SE. (B) as células vegetativas expressando RFP-tag CalΔcoil- RFP e GFP-etiquetado RBD foram tratados com o veículo ou 5 µM LatA pelo menos 15 min e então estimulados com fluxo de laminar unidirecional no 41 dyn/cm2 para 2 s. imagens de foram coletadas todos os 3 s. RBD-GFP e acumulação de RFP - CalΔcoilno córtex foi quantificada como em (A). Os valores são média ± SE. O número de células analisadas é indicado ao lado de cada condição. Barra de escala = 10 µm. Esta figura foi modificada de Artemenko et al (2016) 22. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representante resulta para a resposta de d. discoideum células à estimulação prolongada com fluxo. (A) as células vegetativas expressando RFP-tag CalΔcoil foram expostos ao contínuo fluxo de laminar unidirecional em 15 dyn/cm2 e fotografaram cada 3 s. faixas de 11 células são mostradas em (B). Barra de escala = 10 µm. Esta figura foi modificada de Artemenko et al (2016) 22. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: representante resultados para métodos alternativos para testes de resposta à estimulação mecânica aguda. (A) vegetativa d. discoideum células expressando Cal RFP-tagΔcoil foram expostos a uma micropipeta (*) basalmente liberar o buffer de ensaio em ritmo lento. Um breve aumento na taxa de fluxo de entrega rápida de um bolus de buffer de ensaio foi conseguido no tempo 0. Imagens foram coletadas todas as 3 células de vegetativa discoideum d. s. (B) expressando RFP-tag CalΔcoil chapeado como uma pequena gota em uma câmara de microscopia foram estimuladas mecanicamente pela adição de um grande volume de reserva para o Câmara. Imagens foram coletadas cada 3 s. escala bar = 10 µm. parte (A) desta figura foi modificado de Artemenko et al (2016) 22. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Movie 1: Estimulação mecânica aguda provoca translocação rápida e transitória de CalΔcoil- RFP ou PH-Crac-GFP, do citosol para o córtex em agregação-competente d. discoideum células expressando esses biosensores. Unidirecional de fluxo laminar foi ativado para 5 s no tempo 0 e células foram fotografadas em 3 intervalos de s. Velocidade de reprodução é 5 frames/s. São mostrados dois exemplos para cada linha de celular. Barra de escala = 10 µm. Este filme corresponde a Figura 2A e foi modificado em Artemenko et al (2016) 22. clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar filme 2: Estimulação mecânica contínua desencadeia translocação rápida e transitória de CalΔcoil- RFP do citosol para o córtex antes da migração das células contra a direção do fluxo de. As células vegetativas expressando CalΔcoil- RFP foram expostos à tensão de cisalhamento contínuo em 15 dyn/cm2 , começando no tempo 0 e fotografada em 3 intervalos de s. Velocidade de reprodução é 10 quadros/s. escala bar = 10 µm. Este filme corresponde a Figura 3 e tem sido publicado anteriormente em Artemenko et al (2016) 22. clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Os métodos descritos aqui para oferecer uma maneira conveniente para avaliar a população e comportamento de células individuais em resposta para distorcer o fluxo. Importante, enquanto estudos anteriores analisaram localização de líder e retardamento marcadores de borda durante a migração, a abordagem atual permite investigação dos efeitos imediatos aplicando-se o fluxo de cisalhamento aguda. Usando este método demonstrámos que, na verdade, a resposta inicial de células de fluxo de cisalhamento não requer migração celular. Em vez disso, a resposta rápida e transitória para o estímulo do fluxo de cisalhamento inicial precede a migração direcional vista com exposição prolongada ao fluxo, da mesma forma que a resposta global inicial visto com um gradiente quimiotático de cisalhamento.
As abordagens bioquímicas e microscópicas produzem dados complementares, mesmo que cada método tem desvantagens e vantagens distintas. Estimulação seguida de lise celular e immunoblotting de PKBs, KrsB e ERK, por exemplo, analisa toda uma população de células e, portanto, a média de variação de célula para célula, ao contrário de um ensaio que examina o comportamento de células individuais. No entanto, ensaios baseados em população tendem a mudanças sutis de máscara no comportamento de célula que pode ser facilmente observado através da análise de células individuais. Além disso, o ensaio bioquímico descrito aqui só é eficaz com células competentes de agregação, por razões que serão discutidas mais tarde. Em contraste, o ensaio baseado em microscopia da relocalization de RBD, RalGDS, PH-Crac, CalΔcoile PTEN, por exemplo, entre o córtex e o citoplasma é eficaz para as células vegetativas e agregação-competente e, portanto, permite observações que são amplamente aplicáveis às células com graus variados de polarização. O que faz com que as duas abordagens complementares é o fato de que eles examinam diferentes conjuntos de marcadores disponíveis líder/revestimento de borda, expandindo assim a cobertura de sinal transdução e actina citoesqueleto redes testado com o ensaio do fluxo de cisalhamento.
Ele ainda não está claro por que as células vegetativas, que respondem muito robusta em ensaios baseados em microscopia, não respondem à estimulação seguida immunoblotting e lise celular. Uma possibilidade é que a quantidade de força de cisalhamento aplicada às células quando a placa é girada não coincide com a força experimentada pelas células em uma câmara de fluxo. Células desenvolvidas, em contraste, podem tem um limite inferior para ativação e, assim, responder sob qualquer condição. É improvável que os biosensores, cuja atividade é medida pelo ensaio de bioquímicos não são expressos ou não são ativados nas células vegetativas, desde que a estimulação de células vegetativas com ácido fólico leva à ativação robusta de PKBR1/PKBA e ERK2 (dados não mostrado). Além disso, as células vegetativas mostram claro recrutamento de PH-Crac, que reflete o acúmulo de PIP3, no ensaio baseado em microscopia. Desde recrutamento PKBA também depende PIP3, é improvável que PKBA não responderia à estimulação mecânica aguda, a menos que as condições no ensaio de bioquímicos não são ideais, como mencionado acima. Esta continua a ser uma área de investigação ativa.
A análise bioquímica dos reguladores de quimiotaxia necessária a presença de cafeína durante todo o experimento. Originalmente a cafeína foi adicionada para impedir que uma célula para outra sinalização devido à secreção de acampamento. No entanto, parece que a cafeína tem outra função além de inibição da adenilato ciclase (ACA) desde células ACA-nulo ainda exigido cafeína por fosforilação de PKBR1 em resposta à estimulação mecânica aguda. Cafeína tem demonstrada anteriormente para bloquear TorC2 atividade26. É possível que inibição da TorC2 bloqueado alguns motilidade basal das células e assim, baixou a ativação basal de PKBR1 e outros componentes de redes de citoesqueleto de transdução e actina de sinal. Baixa atividade basal era imperativa para observar a resposta ao fluxo de cisalhamento. Na verdade, quando as células foram coletadas em pontos de tempo anteriores durante o desenvolvimento, indicaram aumento da atividade basal e uma resposta reduzida da tesoura-fluxo induzido. Curiosamente, é conhecido que as células vegetativas têm atividade PKBA proporcionalmente mais e menos PKBR1 em comparação com desenvolveu células31. É possível que o estado basal é regulamentado um tanto diferentemente em células vegetativas e agregação-competentes, contribuindo ainda mais para a falta de resposta das células vegetativas no ensaio de bioquímica. Curiosamente, quando as células foram coletadas em pontos posteriores de desenvolvimento, eles também tiveram uma resposta reduzida, provavelmente devido a forte influência da polaridade sobre a localização e a ativação de vários reguladores de quimiotaxia examinados neste ensaio.
Estimulação de células em uma câmara de microscopia revelou que tanto a força e a duração do estímulo contribuam a resposta máxima22. Em outras palavras, uma resposta máxima é possível mesmo com uma força de cisalhamento de baixo se é aplicado por um período prolongado de tempo (10 s contra 2 s). Esta observação explica por que as células têm uma resposta global inicial quando eles primeiro são expostos a um estímulo contínuo, mas fraco, que leva à migração induzida pelo fluxo de cisalhamento. Com o aparelho atual, éramos incapazes de gerar fluxo de cisalhamento baixo o suficiente para investigar a extremidade inferior do intervalo.
Talvez, a mais importante implicação dos estudos realizados utilizando estimulação mecânica aguda é que estímulos mecânicos e químicos alimentar em transdução de sinal comum e redes do citoesqueleto de actina. Embora nós mostramos que os dois estímulos integram usando a adição de tampão em massa para a estimulação mecânica, estudos futuros terá como objectivo desenvolver um sistema onde quimiotático pode ser entregues rapidamente no canal de passagem, que seria uma forma muito mais versátil e poderosa forma de se avaliar a integração dos estímulos mecânicos e químicos. Infelizmente, quimiotático adição usando a configuração actual do dois-linha está associada com um segundo estímulo de fluxo de cisalhamento porque o quimiotático tem que ser entregue na presença de fluxo. Uma alternativa viável pode ser laser-estimulou o lançamento de um quimiotático de um precursor enjaulado, como foi mostrado com sucesso para o acampamento por Westendorf et al. 32. no futuro, também seria interessante examinar a integração de outros estímulos, por exemplo, cisalhamento fluxo e variável de campos elétricos ou cisalhamento fluxo e rigidez variável de substrato. O último exemplo é interessante porque envolve dois tipos de estimulação mecânica, embora a recepção do sinal inicial pode ser diferente entre eles. Confirmar que todos os estímulos que induzem a migração dirigida compartilham a mesma rede de transdução de sinal e variam somente em como o estímulo é percebido explicará como células podem navegar em ambientes complexos. Finalmente, nós já demonstrou que a estimulação aguda, com fluxo de cisalhamento leva a disseminação de células neutrófilos humanos22. Futuro trabalho examinará mais localização e ativação de vários componentes de sinal transdução e actina citoesqueleto redes com estímulos mecânicos em células de mamíferos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subvenção de saúde R35 GM118177 ao PND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
| KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
| Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
| cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
| Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
| 4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and Equipment | |||
| Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
| 10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
| 35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
| Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
| Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| 50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
| Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
| Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
| UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
| FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
| Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
| Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
| 1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
| 8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
| Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |
References
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