Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda
Summary
Aqui descrevemos os métodos para avaliar a resposta celular à estimulação mecânica aguda. No ensaio baseado em microscopia, examinamos a localização de biosensores fluorescente-etiquetadas após estimulação breve com fluxo de cisalhamento. Também testamos a ativação de várias proteínas de interesse em resposta à estimulação mecânica aguda bioquimicamente.
Abstract
Quimiotaxia, ou migração de um gradiente de um quimiotático, é o melhor modo compreendido de migração dirigida. Estudos utilizando social ameba Dictyostelium discoideum revelou que uma rede de transdução de sinal complexo de vias paralelas amplifica a resposta ao quimioatraentes e leva a polimerização de actina tendenciosa e protrusão de um pseudopod no direção de um gradiente. Em contraste, os mecanismos moleculares dirigindo outros tipos de migração dirigida, por exemplo, devido à exposição ao cisalhamento fluxo ou campos elétricos, não são conhecidos. Muitos reguladores de quimiotaxia exibem localização no líder ou borda de revestimento de uma célula de migração, bem como mostram mudanças transientes na localização ou ativação após estimulação global com um quimiotático. Para entender os mecanismos moleculares de outros tipos de migração dirigida, desenvolvemos um método que permite o exame da resposta celular à estimulação mecânica aguda, com base em breve (2-5 s) exposição ao fluxo de cisalhamento. Esta estimulação pode ser entregue em um canal enquanto imagem células expressando fluorescente-etiquetadas biosensores para examinar o comportamento de células individuais. Além disso, a população celular pode ser estimulada em um prato, lysed e immunoblotted usando anticorpos que reconhecem versões ativas de proteínas de interesse. Combinando os dois ensaios, um pode examinar uma ampla gama de moléculas ativadas por alterações na localização subcellular e/ou fosforilação. Usando esse método, determinamos que estimulação mecânica aguda provoca ativação das redes de citoesqueleto sinal quimiotáxico transdução e actina. A capacidade de examinar as respostas celulares à estimulação mecânica aguda é importante para compreender os eventos inicial necessários para motilidade induzida pelo fluxo de cisalhamento. Esta abordagem também fornece uma ferramenta para o estudo da rede de transdução de sinal quimiotáxico sem a influência de confundimento do receptor quimiotático.
Introduction
Migração de células eucarióticas é tendencioso por diversas pistas químicas e físicas no ambiente, incluindo gradientes de solúveis ou substrato-limite quimioatraentes, rigidez variável de substratos, campos elétricos, o fluxo de cisalhamento. Embora tenha havido muitos avanços na nossa compreensão dos mecanismos moleculares dirigindo quimiotaxia, menos é conhecido sobre outros tipos de migração dirigida e como esses diversos sinais são integrados no nível celular para produzir um unificado migratórias resposta.
Dirigido a migração em direção a uma concentração crescente de um quimiotático envolve três componentes comportamentais: motilidade direcional sensoriamento e polaridade1. Motilidade refere-se ao movimento aleatório de células alcançado pela protrusão pseudopod. Direcional é a capacidade de uma célula para detectar a origem de um quimiotático de detecção, que pode ocorrer mesmo em imobilizado células. Polaridade se refere à distribuição assimétrica mais estável dos componentes intracelulares, entre a borda do revestimento de uma célula, o que leva a maior persistência em movimento e líderes.
Resposta celular a um quimiotático depende da atividade de quatro redes reguladoras conceitualmente definidas: receptor / proteína G, transdução de sinal, citoesqueleto de actina e polaridade1. Quimiotático de ligação ao receptor acoplado à proteína G transmite o sinal via Via G proteínas α e βγ para a rede de transdução de sinal a jusante, que amplifica o sinal direcional. Vários caminhos dentro da rede de transdução de sinal agem em paralelo e alimentam a rede de citoesqueleto de actina para polimerização de actina viés e protrusão pseudopod consequente, na direção do gradiente. Entre os importantes reguladores da quimiotaxia são Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-quinase (PI3K), homólogo fosfatase e tensin (PTEN) e guanylyl-ciclase. Mecanismos de feedback dentro da rede de transdução de sinal e entre a transdução de sinal e redes de citoesqueleto de actina mais amplificam a resposta. Finalmente, a rede de polaridade mal definidos recebe entrada do citoesqueleto de actina e preconceitos ainda mais a rede de transdução de sinal para promover a migração persistente na direção do gradiente.
Muito de nossa compreensão mecanicista da quimiotaxia foi tornado possível por causa do desenvolvimento de biossensores fluorescente-tag para vários componentes das redes reguladoras. Muitos reguladores de quimiotaxia tem uma distribuição assimétrica da molécula reguladora em si ou a sua actividade. Por exemplo, biosensores que reconhecem ativado versões de pequenas GTPases Ras e Rap1 – domínios de ligação de Ras de Raf1 (referido como RBD aqui) e RalGDS, respectivamente – localizar a extremidade dianteira de uma célula de chemotaxing2,3. Da mesma forma, PI3K e seu produto fosfatidilinositol (3, 4,5)-triphosphate (PIP3), reconhecido por um domínio de homologia (PH) plecstrina, também mostram a localização na frente de um celular4,5. Em contraste, um 3-fosfatase PTEN, que converte a PIP3 volta a fosfatidilinositol (4,5)-bisfosfato, localiza-se à borda da célula6de atraso. Importante, estes biosensores alterar sua localização em resposta à estimulação global com um quimiotático. Marcadores de ponta, que são citosólica ou nas pontas de saliências em uma célula de descanso, relocalize ao córtex, Considerando que o atraso marcadores de borda, que têm localização cortical e estão ausentes das pontas dos saliências em uma célula de descanso, se tornar citosólico após estimulação. Análise da distribuição de biosensor em resposta à estimulação global com um quimiotático minimiza a contribuição de motilidade e polaridade, que muitas vezes confundem as observações. Estimulação global ou uniforme de uma suspensão de células com um quimiotático também é usada como uma ferramenta para avaliar alterações de toda a população na ativação da proteína, muitas vezes detectado por fosforilação de proteínas a7,8,9 . Este ensaio bioquímico é usado principalmente para obter informação temporal, Considerando que a microscopia é usada para reunir informações temporais e espaciais sobre o comportamento de vários componentes das redes reguladoras.
A rede de transdução de sinal incorpora características de um sistema excitável10,11. Respostas aos estímulos Quimiotáticos supralimiar são “tudo ou nada” e exibir os períodos refratários. As respostas também são acionadas estocàstica e podem mostrar comportamento oscilatório. Eventos de transdução de sinal estão localizados as regiões do córtex que se propagam como ondas12,13,14,15. Frente, trás, marcadores são recrutados para ou dissociam-se, as zonas activas das ondas propagação. Devido a região refratária à direita da zona activa, as ondas opostas dirigidas aniquilar como eles se encontram. As propagação ondas de transdução de sinal fundamentam as saliências celulares que medeiam a migração de células10.
Grande parte das informações acima mencionadas na quimiotaxia veio os estudos sobre a ameba social Dictyostelium discoideum, embora semelhantes mecanismos reguladores são também aplicáveis aos neutrófilos e outros tipos de células de mamíferos16 . Dictyostelium é um organismo modelo bem estabelecida que tem uma robusta quimiotático resposta durante a fome, quando milhares de células únicas migram em direção a um centro de agregação, eventualmente formando um corpo multicelular de frutificação contendo esporos. Quimiotaxia é também essencial durante a fase de crescimento de célula única deste organismo para localizar fontes de alimento bacteriana. Importante, migração de células únicas Dictyostelium é notavelmente semelhante a migração de neutrófilos mamíferos ou células de câncer metastático, os quais sofrem muito rápida migração ameboide-tipo. Na verdade, ambos a topologia global das redes reguladoras, bem como muitas das vias de transdução de sinal individuais envolvidas na quimiotaxia são conservadas entre Dictyostelium e leucócitos mamíferos17. Além disso, outras células, como fibroblastos, usam quinase de tirosina do receptor (RTK) em vez de GPCRs; no entanto, RTKs pode alimentar em redes semelhantes.
Em contraste com a quimiotaxia, informação detalhada sobre os mecanismos de sinalização que levam vários outros modos de migração dirigida é carente. Da mesma forma às células migrando em um gradiente quimiotático vários estudos relataram ativação e/ou localização de marcadores típicos de vanguarda, incluindo polimerização de actina, PIP3 e/ou quinase de sinal-regulado extracellular (ERK) 1/2, no frente de células em fase dirigido a migração em resposta ao cisalhamento fluxo ou alterações nos campos elétricos18,19,20,21. No entanto, nestes estudos exposição contínua ao estímulo também resultou na migração celular, deixando em aberto a questão se, por exemplo, os marcadores de ponta localizar especificamente em resposta a um estímulo, ou se eles simplesmente localizar na vanguarda por causa do aumento do número de pseudopods na frente de uma célula de migração.
Desenvolvemos os ensaios que nos permitem observar a resposta das células à aguda perturbação mecânica entregada como fluxo de cisalhamento, tanto a nível da população e como células individuais22. Semelhante à estimulação global com um quimiotático, pós-dose agudação com fluxo de cisalhamento permite o estudo da resposta celular a um estímulo mecânico sem a contribuição de confundimento de motilidade ou polaridade. Combinar estes ensaios bioquímicos e microscópicos com perturbações genéticas ou farmacológicas nos permite aprender sobre estímulos mecânicos como são percebidos e transmitida. Além disso, esta abordagem também fornece um método novo para grampear a jusante do sistema do receptor quimiotático na ausência de um quimiotático, isolando, assim, as redes sinal transdução e actina citoesqueleto do receptor/G rede de proteínas.
Usando as técnicas descritas abaixo nós recentemente demonstrou que a tensão de cisalhamento aguda leva à ativação de vários componentes do sinal quimiotáxico transdução e actina citoesqueleto redes22. Aplicando o estímulo mecânico agudo em intervalos variáveis, temos demonstrado que, da mesma forma quimioatraentes, resposta a estímulos mecânicos também exibe características de um sistema excitável, incluindo o comportamento tudo ou nada da resposta sob saturar as condições e a presença de um período refratário. Finalmente, combinando estimulação mecânica e química, mostramos que os dois estímulos compartilham sinal transdução e actina citoesqueleto redes, permitindo que o provável para a integração de múltiplos estímulos a migração celular viés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos descritos aqui para oferecer uma maneira conveniente para avaliar a população e comportamento de células individuais em resposta para distorcer o fluxo. Importante, enquanto estudos anteriores analisaram localização de líder e retardamento marcadores de borda durante a migração, a abordagem atual permite investigação dos efeitos imediatos aplicando-se o fluxo de cisalhamento aguda. Usando este método demonstrámos que, na verdade, a resposta inicial de células de fluxo de cisalhamento não requer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subvenção de saúde R35 GM118177 ao PND.
Materials
| Reagents | |||
| Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
| KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
| Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
| cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
| Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
| 4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and Equipment | |||
| Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
| 10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
| 35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
| Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
| Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| 50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
| Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
| Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
| UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
| FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
| Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
| Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
| 1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
| 8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
| Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |
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