Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering av Dictyostelium discoideum svaret til akutt mekanisk stimulering

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56411
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Her beskriver vi metoder for å vurdere cellulær respons til akutt mekanisk stimulering. I mikroskopi-baserte analysen undersøker vi lokalisering av fluorescently-merket biosensors etter kort stimulering med skjær flyt. Vi tester også av interesse i svaret til akutt mekanisk stimulering biokjemisk.

Abstract

Chemotaxis eller migrering opp gradering av en chemoattractant, er det beste forståtte modusen rettet migrasjon. Studier med sosiale amoeba Dictyostelium discoideum avslørte at et komplekst signal signaltransduksjon nettverk av parallelle forsterker responsen på chemoattractants, og fører til partisk begrepsordbok polymerisasjon og protrusion av en pseudopod i den retning på en forløpning. Derimot er molekylære mekanismer kjører andre typer regissert migrasjon, for eksempel på grunn av eksponering for skråstille flyt eller elektrisk felt, ikke kjent. Mange regulatorer av chemotaxis utstillingen lokalisering ledende eller henger kanten av en overføring celle, samt vise forbigående endringer i lokalisering eller etter globale stimulering med en chemoattractant. For å forstå molekylære mekanismer av andre typer regissert migrasjon utviklet vi en metode som tillater undersøkelse av cellulær respons til akutt mekanisk stimulering basert på kort (2-5 s) eksponering å skråstille flyt. Denne Stimuleringen kan leveres i en kanal mens imaging celler som uttrykker fluorescently-merket biosensors for å undersøke enkeltcelle atferd. I tillegg stimuleret celle befolkningen plate, lysed, og immunoblotted ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner aktive versjoner av proteiner av interesse. Ved å kombinere begge analyser, kan en undersøke en rekke molekyler aktivert av endringer i subcellular lokalisering og/eller fosforylering. Benytter denne metoden vi funnet ut at akutt mekanisk stimulering avtrekker aktivisering av chemotactic signal signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk. Muligheten til å undersøke mobilnettet svar til akutt mekanisk stimulering er viktig for å forstå initiering hendelsene nødvendig for skjær flyt-indusert motilitet. Denne tilnærmingen har også et verktøy for å studere chemotactic signal signaltransduksjon nettverket uten forvirrende påvirkning av chemoattractant reseptoren.

Introduction

Migrering av eukaryote celler er partisk av ulike kjemiske og fysiske signaler i miljøet, inkludert graderinger av løselig eller substrat bundet chemoattractants, variabel stivhet av underlag, elektrisk felt eller skjær flyt. Selv om det har vært mange fremskritt i vår forståelse av molekylære mekanismer kjøring chemotaxis, mindre er kjent om andre typer regissert migrasjon og hvordan disse ulike signaler er integrert på cellenivå å produsere en enhetlig trekkfugler svar.

Regisserte migrering mot en økende konsentrasjon av en chemoattractant innebærer tre atferdsmessige komponenter: motilitet, retningsbestemt sensing og polaritet1. Motilitet refererer til tilfeldige movement celler ved pseudopod protrusion. Retningsbestemt sensing er muligheten for en celle for å finne kilden til en chemoattractant, noe som kan skje selv i immobilisert celler. Polaritet refererer til mer stabil asymmetrisk fordeling av intracellular komponenter mellom ledende og henger kanten av en celle, som fører til økt utholdenhet i bevegelse.

Cellulær respons til en chemoattractant, avhengig av aktiviteten til fire konseptuelt definerte regulatoriske nettverk: reseptor / G protein, signaltransduksjon, begrepsordbok cytoskjelett og polaritet1. Chemoattractant binding til G protein-kombinert reseptoren overfører signalet via heterotrimeric G proteiner α og βγ til nedstrøms signal signaltransduksjon nettverket som forsterker retningsbestemt signalet. Flere veier i signal signaltransduksjon nettverket fungerer parallelt og mate inn utgangen cytoskjelett nettverket bias begrepsordbok polymerisasjon og påfølgende pseudopod protrusion, i retning av graderingen. Blant viktige regulatorer av chemotaxis er Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), fosfatase og tensin homolog (PTEN) og guanylyl cyclase. Tilbakemelding mekanismer i signal signaltransduksjon nettverket og mellom signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk ytterligere forsterke svaret. Endelig, dårlig definerte polaritet nettverket mottar inndata fra utgangen cytoskjelett, og ytterligere skjevheter signal signaltransduksjon nettverket for å fremme vedvarende migrasjon i retning av graderingen.

Mye av vår mekanistisk forståelse av chemotaxis ble gjort mulig på grunn av utviklingen av fluorescently-merket biosensors for ulike komponenter av regulatoriske nettverk. Mange chemotaxis regulatorer har en asymmetrisk fordeling på regulatoriske molekylet seg selv eller sin virksomhet. For eksempel biosensors som gjenkjenner aktivert versjoner av små GTPases Ras og Rap1-Ras-bindende domener av Raf1 (referert til som RBD her) og RalGDS, henholdsvis-lokalisere til forkanten av en chemotaxing celle2,3. Tilsvarende PI3K og dens fabrikat phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), gjenkjennes av et pleckstrin homologi (PH) domene, viser lokalisering på forsiden av en celle4,5. I kontrast, en 3-fosfatase PTEN, konverterer som PIP3 tilbake til phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate, regionaliserer henger kanten av cellen6. Viktigere, endre disse biosensors deres lokalisering svar på globale stimulering med en chemoattractant. Ledende markører, som er cytosolic eller på tuppen av utstikkende deler i en hvile celle, relocalize til cortex, mens henger kanten markører, som har kortikale lokalisering og er fraværende fra tuppen av utstikkende deler i en hvile celle, blir cytosolic etter stimulering. Analyse av biosensor distribusjon svar på globale stimulering med en chemoattractant minimerer bidrag av motilitet og polaritet, som ofte forvirrer observasjoner. Global eller uniform stimulering av en celle hjuloppheng med en chemoattractant brukes også som et verktøy til å vurdere endringer for hele befolkningen i protein aktivisering, ofte oppdages av protein fosforylering7,8,9 . Denne biokjemiske analysen brukes hovedsakelig å få timelige informasjon, mens mikroskopi brukes til å samle både timelig og romlig informasjon om virkemåten av ulike komponenter av regulatoriske nettverk.

Signalet signaltransduksjon nettverket har funksjoner av en nervøs systemet10,11. Svar på supra-terskel chemotactic stimuli er "all-or-none" og vise ildfaste periodene. Svar også utløses stochastically og kan vise oscillasjon atferd. Signalet signaltransduksjon hendelser er lokalisert i områder på cortex som overføres som bølger12,13,14,15. Foran, tilbake, markører er rekruttert til eller dissociate fra, de aktive sonene av overfører bølger. På grunn av ildfaste regionen etterfølgende aktive sonen, tilintetgjøre oppositely rettet bølgene som de møter. Overfører signalet signaltransduksjon bølgene ligger de mobilnettet utstikkende deler som megle celle migrasjon10.

Mye av den nevnte informasjonen om chemotaxis kom fra studiene på den sosiale amoeba Dictyostelium discoideum, selv om lignende regulatoriske mekanismer er også nøytrofile og andre pattedyr cellen typer16 . Dictyostelium er en veletablert modell organisme har en robust chemotactic reaksjon under sult, når tusenvis av enkeltceller migrere mot en aggregering senter, til slutt danne en flercellet frukt kroppen inneholder sporer. Chemotaxis er også avgjørende under én celle vekst stadium i denne organismen for å finne bakteriell mat kilder. Viktigere, er migrering av Dictyostelium enkeltceller bemerkelsesverdig lik migrering av pattedyr nøytrofile eller metastatisk kreftceller, som gjennomgå meget rask amoeboid-type overføring. Faktisk, er både generelle topologien regulatoriske nettverk, samt mange av de individuelle signaltransduksjon trasé involvert i chemotaxis bevart mellom Dictyostelium og leukocytter hos pattedyr17. Videre bruke andre celler, for eksempel fibroblaster, receptor tyrosine kinaser (RTK) i stedet for GPCRs; men kan RTKs mate inn lignende nettverk.

I motsetning til chemotaxis mangler grundig forståelse av signalnettverk mekanismer som driver ulike transportmåter regissert migrasjon. Tilsvarende cellene migrerer en chemoattractant stigning flere studier har rapportert utløsning eller lokalisering av typiske ledende markører, inkludert begrepsordbok polymerisasjon, PIP3 og/eller ekstracellulær signal regulert kinase (ERK) 1/2, på den fronten celleområde gjennomgår regisserte migrering Svar å skråstille flyt eller endringer i elektrisk felt18,19,20,21. Men i disse studiene resulterte kontinuerlig eksponering til stimulans også i celle migrasjon, forlate åpne spørsmålet om, for eksempel den ledende markører lokalisere spesielt som svar på en stimulans, eller om de bare lokalisere i forkant på grunn av økt antall eukaryotene på forsiden av en overføring celle.

Vi utviklet analyser som tillater oss å observere svaret celleområde akutt mekanisk forstyrrelsene levert som skjær flyt både på befolkningsnivå og individuelle celler22. Ligner på globale stimulering med en chemoattractant, akutt stimulerendesjon med skjær flyt kan studere en cellulær respons til en mekanisk stimulans uten forvirrende bidrag fra motilitet eller polaritet. Kombinere disse biokjemiske og mikroskopiske analyser med genetisk eller farmakologiske forstyrrelser tillater oss å lære om hvordan mekanisk stimuli oppfattes og overføres. Videre, denne tilnærmingen gir også en ny metode for å trykke inn systemet nedstrøms chemoattractant reseptoren i fravær av en chemoattractant, og dermed isolere signalet signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverkene fra reseptor/G protein nettverk.

Bruke teknikkene nedenfor vi nylig vist at akutt skjæring stress fører til aktivering av flere komponenter i chemotactic signal signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk22. Ved å bruke akutt mekanisk stimulans på ulike intervaller, viste vi at tilsvarende til chemoattractants, respons på mekanisk stimuli også viser funksjonene i en nervøs systemet, inkludert all-or-none virkemåten til svaret under Mette forhold og tilstedeværelse av en ildfast periode. Til slutt, ved å kombinere mekanisk og kjemisk stimulering vi viste at to stimuli dele signalet signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk, som sannsynligvis gir mulighet for integrering av flere stimuli til bias celle migrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av løsninger

  1. forberede HL-5 media bruker følgende: 10 g/L Dekstrose, 10 g/L proteose pepton 5 finans gjærekstrakt, 0.965 finans Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0.485 finans KH 2 PO 4, og med mindre annet er angitt, 0,03 finans streptomycin i deionisert vann. Autoclave medium og store ved romtemperatur.
    Merk: På grunn av forskjellene mellom proteose pepton og gjær ekstrakt fra forskjellige leverandører og mellom individuelle kladder, pH av media må justeres til den typiske rekke 6.4 til 6,7.
  2. Forberede SM plater med følgende: 10 g/L Dekstrose, 10 g/L pepton 1 finans gjær ekstrakt, 2,31 finans KH 2 PO 4, 1 g/L K 2 HPO 4 og 20 finans agar i deionisert vann. Autoclave, kule, og hell 30 mL av agar løsningen per 10 cm Petriskål. Når agar stivner, lagre platene på 4 ° C i opptil 1 måned.
  3. Forberede 10 x fosfat Buffer (PB) bruker 13,4 finans Na 2 HPO 4 ·7H 2 O og 6.8 finans KH 2 PO 4 i deionisert vann. Lagre 10 x aksjen på 4 ° C. Dilute til 1 x med deionisert vann for bruk.
  4. Forberede DB Buffer ved supplere 1 X PB med 2 mM MgSO 4 og 0.2 mM CaCl 2.
  5. Forberede 100 mM koffein i deionisert vann. Lagre på − 20 ° C.
  6. Forberede 100 mM leiren lagerløsning ved å løse opp leiren natrium salt monohydrat i deionisert vann. Forberede en 1 mM arbeider aksjer i deionisert vann. Lagre både lager løsninger på − 20 ° C. forberede endelige leiren løsningen på ønsket konsentrasjonen i DB ved eksperimentet.
    Merk: Lager løsninger kan fryse-tint et par ganger.
  7. Forberede 25 mM folsyre i 1 x PB. Legg noen dråper 1 N NaOH til pulveret helt oppløses. Lagre på − 20 ° C.
  8. Forberede 3 x prøve buffer ved hjelp av følgende: 187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% (w/v) natrium dodecyl sulfate (SDS), 30% glyserol, 126 mM dithiothreitol og 0,03% (w/v) bromophenol blå. Aliquot og butikk på − 20 ° C.
    1. Før, tine i et vannbad 37 ° C og fortsette å forberede prøven buffer med protease og fosfatase hemmere av fortynne 3 x prøve buffer til 1 x, og legge til 50 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 25 mM natrium pyrophosphate og 1 x komplett EDTA-fri protease hemmer cocktail i deionisert vann. Legg hemmere umiddelbart før du starter prosedyren beskrevet i trinnene 3.1.2-3.1.3.
  9. Forberede 5 mM Latrunculin A løsning i DMSO. Aliquot og butikk på − 20 ° C.

2. Utarbeidelse av D. discoideum celler

Merk: opprettholde D. discoideum celler i HL-5 media i vev kultur plater eller i en suspensjon kultur som tidligere beskrevet 23. Når det er nødvendig, transformering celler med fluorescently-merket biosensors i henhold til standard electroporation protokoller 24. Ulike D. discoideum stammer, samt plasmider koding biosensors eller andre gener rundt kan fås fra Dicty lager Center (dictybase.org).

  1. Vekst og samling Vegetative D. discoideum celler
    1. For analyse av vegetative celler, vokse celler i nærvær av bakterier for å redusere antall macropinosomes, som er vanligvis observert i axenically dyrket celler 25.
      1. Forberede en kultur for Klebsiella aerogenes av vaksinere et lite antall celler fra en glyserol lager eller en tidligere kultur i ønsket volum av HL-5 medium uten antibiotika. Inkuber bakteriell kultur på en orbital shaker på 200 rpm (0.42 x g) ved romtemperatur (20-22 ° C) for 16-18 h.
        Merk: K. aerogenes belastning her er ikke-patogene (se Tabell av materialer).
    2. Samle D. discoideum i eksponensiell vekstfase fra vev kultur plater eller en suspensjon kultur og telle celler ved hjelp av en hemocytometer ifølge produsenten ' s instruksjoner. Spre 1 x 10 5 D. discoideum celler med 260 µL K. aerogenes suspensjon på en SM-plate. Snu platen opp ned neste dag. Vokse celler ved romtemperatur før D. discoideum cellene starte clearing bakteriell plenen, men før de begynner å samle (~ 36-48 h).
    3. Samle D. discoideum celler i 5 mL DB buffer ved skraping dem med et glass sprederen. Overføre cellene til en 50 mL polypropylen rør. Skyll platen med en annen 5 mL DB buffer og basseng med den originale suspensjonen. Fylle røret til 50 mL med DB buffer.
    4. Sentrifuge D. discoideum suspensjon på 360 x g i 3-4 min. Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 50 mL DB Buffer. Gjenta vask trinnene til nedbryting er klare (~ 3 til 4 vasker). Resuspend den siste cellen pellet DB buffer til en siste tetthet ~ 5 x 10 6 celler/mL.
  2. Utarbeidelse av aggregering-kompetent D. discoideum celler
    1. utvikle D. discoideum celler av 1t sult etterfulgt av 4 h sult og pulserende med 50 nM cAMP hver 6 min ifølge standarden protokoller 23.
    2. Etter utvikling, måle det siste bindet av cellen suspensjon.
    3. Basert på det opprinnelige antallet celler som brukes for utvikling, beregne celle tettheten av siste suspensjon.
      Merk: Hvis cAMP leveres i 100 µL bind hver 6 min, celle volumet øker med 1 mL i hver time av leiren pulserende. Dermed standard forholdene bruke 8 x 10 7 celler i 4 mL DB, etter 4 h utvikling det siste bindet er 7 mL og den siste celle tettheten er ~1.1 x 10 7 celler/mL.

3. Biokjemiske analyse for celle respons til mekanisk eller kjemikalie stimulering

  1. Akutt mekanisk stimulering celler etterfulgt av cellen Lysis
    1. Plate 2 x 10 6 aggregering kompetente celler (fra trinn 2.2) etter 4 h utvikling i 35 mm retter med 2 mL DB. At cellene å koble 10 min ved romtemperatur. Vask celler to ganger med 1 mL DB. Inkuber celler i DB med 2,5 koffein i 30 min uten forstyrrelser av platene.
      Merk: Hvis cellene må behandles med en farmakologisk inhibitor, legger ønsket konsentrasjonen av hemmer eller samme volum av passende redskap under basalation med koffein.
    2. Bruke mekanisk stimulering, Plasser platen (en om gangen) på en orbital shaker og umiddelbart slå den på på 150 rpm (0,24 x g) for 5 s.
      Merk: Plate også manuelt stimuleret av bevegelse i en cross-wise måte ca 5 s.
    3. Leveringstanken bufferen på angitt tidspunkt etter starten av stimulering. Umiddelbart lyse cellene ved å legge til 100 µL eksempel buffer med protease og fosfatase hemmere.
    4. Plasser platen på is, og samle den lysate i en 1.5-mL tube. For ' gang 0 ', lyse cellene uten risting. Overføre rør i et 95 ° C varme i 10 min umiddelbart etter lysis. Fortsette med immunoblotting eller lagre lysates på -20 ° C.
  2. Stimulering av celler med en Chemoattractant
    1. Basalate aggregering kompetente celler etter 4t i utviklingen av raskt risting dem i nærvær av 5 mM koffein 200 RPM (0.42 x g) på en orbital shaker i 30 min.
      1. Sentrifuge celle suspensjon på 360 x g i 3-4 min. Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 10 mL iskald DB Buffer. Gjenta trinnet vask.
    2. Resuspend den siste cellen pellet iskald DB buffer til en siste tetthet på 4 x 10 7 celler/mL basert på hvor første cellen brukes til å utvikle cellene (se trinn 2.2). Holde celle suspensjon på is før stimulmålfilen.
      1. Pipette 50 µL av 10 µM cAMP eller kjøretøy i en polystyren kopp plassert på en orbital shaker.
    3. For å stimulere cellene, legge til 450 µL av iskalde celle suspensjon i samme koppen og umiddelbart slå shaker på 200 rpm (0.42 x g). På ulike tider etter starten av stimulering (f.eks 10, 30, 45, 60, 120 s), kort stopp shaker, ta ut 50 µL dele celle suspensjon og lyse cellene ved å legge dem til 1,5 mL rør som inneholder 25 µL 3 X prøve buffer.
      1. For ' gang 0 ', bruker du cellene fra unstimulated iskald celle suspensjon.
        Merk: Er den endelige temperaturen av cellen suspensjon under stimulering ~ 9 ° C 26. Under disse forholdene peak svaret oppstår litt senere enn toppen observert for stimulering utført ved romtemperatur (for eksempel chemoattractant stimulering av tilhenger celler på mikroskopet eller mekanisk stimulering av tilhenger celler).
    4. Overføre rør i et 95 ° C varme i 10 min umiddelbart etter lysis. Fortsette med immunoblotting eller lagre lysates på -20 ° C.
  3. Analyse for celle respons av Immunoblotting
    1. kjøre lysates (fra trinn 3.1.3 eller 3.2.4) på en 4-15% Tris-HCl polyakrylamid gel, overføre til polyvinylidene fluor membran, blokk, og immunoblot med phospho-PKC Ζ Thr410 (å oppdage phospho-PKBR1 og phospho-PKBA). Gjenkjenne av inkubasjon med pepperrot peroxidase-konjugerte anti-kanin sekundære antistoff, etterfulgt av chemiluminescence med forbedret chemiluminescence substrat.
    2. For påvisning av flere proteiner, strip blot med stripping buffer, og nytt sonde med en primær antistoff mot phospho-p42/44 MAPK Thr302/304 (å oppdage phospho-ERK2). Bekrefte lik protein lasting av flekker polyvinylidene fluor membranen med Coomassie strålende Blue.

4. Akutt mekanisk stimulering og Live Imaging av enkeltceller på mikroskopet

  1. vurdering av svaret til akutt mekanisk stimulering bruke en flyt enhet
    1. samle og fortynne vegetative eller aggregering kompetente celler til ~ 1 x 10 6 celler/mL i DB som beskrevet i trinn 2.1 og 2.2, henholdsvis. Laste inn ~ 600 µL i lysbildet med en kanal (se Tabell på materiale for detaljer). Lar celler å feste for 10 min. Sørg for at alle innganger i lysbildet er helt fylt. Fylle opp med ekstra buffer eventuelt.
      NOTE Lysbildet brukes til analyseformål har tre innganger, som mate inn i trange, 1 mm, men deretter flette en bred, 3 mm kanal. Høyden på kanalen er 0.4 mm. Selv om cellene er belagt gjennom kanalen, bredt delen er imaged.
    2. Passere en av linjene som er knyttet til en 50-mL reservoaret gjennom foran høyre ventilen av fluidic (se Tabell for materiale for detaljer). Bruke programvaren for pumpen, kontroller at ventilen er lukket (dvs. til venstre). Fyll tanken med DB.
      1. Sette press på 50 mbar og slå den på. Fyll og skyll linjen med DB ved å klikke på ventilen for å åpne den. Slå presset tilbake til 0, og lukke ventilen etter ~ 30 s.
    3. Koble linjen til en av de tre sundene på én side av lysbildet uten overlapping eventuelle luftbobler. Plugg de andre to innganger. Koble linjen fra avløpet til enkelt innløp på den andre siden av lysbildet.
      Merk: Rør som brukes for inndata og avløp linjene i dette oppsettet har en indre diameter på 1,6 mm.
    4. Plasser lysbildet på mikroskopet under en 20 X air målsetting. For å rense kanalen, skru av ventilen for å åpne linjen og klikker " press på ", starter på høyere trykk (~ 50 mbar eller ~ 40 dyn/cm 2) for å presse væske gjennom å renne.
      1. Når væske kommer ut av avløpet, redusere press til null (dvs. gravitasjon flow, ~ 15 dyn/cm 2), og fortsette skylling ~ 30 s. bryter ventilen til motsatt posisjon å stoppe strømmen.
    5. Hente bilder med RFP eller GFP belysning på en invertert fluorescens mikroskop under en 40 X oljeobjektiv 3 s mellomrom. Ventilen i lukket posisjon, slå trykket på ønsket trykket, vanligvis mellom 15 og 40 dyn/cm 2 (0 - 50 mbar).
    6. Etter ervervelsen 5 bilder, levere stimulans ved å bytte ventilen for å den " åpne " posisjon. Slå strømmen av etter 2-5 s ved å bytte ventilen i motsatt retning.
      Merk: For visse svakere biosensors (f.eks PTEN, CynA og RalGDS) kan det være nødvendig å bilde celler ved hjelp av en AC confocal mikroskop utstyrt med en 40 X oljeobjektiv.
  2. Testing virkningene av farmakologiske hemmere på svar på akutt mekanisk stimulering bruke en flyt enhet
    1. Plate celler i lysbildet med en kanal som beskrevet i trinn 4.1.1. Sette opp to linjer: sende en linje gjennom foran høyre ventilen som i trinn 4.1.2, og andre gjennom ryggen igjen ventil. Klemme den venstre linjen og innlegge ventilen det " lukket " (venstre) posisjon. Fylle en linje med DB med passende bilen, og andre løsningen inneholder en farmakologisk hemmer av interesse (f.eks 5 µM Latrunculin A).
      Merk: Det er nødvendig å fysisk klemme den venstre linjen fordi den " lukket " venstre posisjon åpner ventilen for linjen.
    2. Fyll og skyll rett linje ved å aktivere trykket på 50 mbar og bytte ventilen for å den " åpne " (høyre) posisjon. Bytte ventilen til venstre etter ~ 30 s. fyll og skyll venstre linjen ved å fjerne klemmen for ~ 30 s. Koble begge linjene til to av sundene på én side av lysbildet med en kanal, koble gjenværende innløp og koble renne i enkelt innløpet på den andre siden. < /l Jeg >
    3. vask lysbildet med bufferen i rett linje og utfører stimulering i samme bufferen som beskrevet i trinn 4.1.3 og 4.1.4 ovenfor.
      Merk: Selv om rett linje ble valgt som det første i dette oppsettet, rekkefølgen kunne reverseres.
    4. Etter stimulans, skru av ventilen for å åpne rett linje ved null trykk (dvs. gravitasjon flow bare, ~ 15 dyn/cm 2). Fjerne klemmen fra venstre linjen og bytte ventilen til venstre for å åpne linjen. Klemme den første linjen.
    5. Etter kjører 3-5 mL buffer med hemmer gjennom, bytte ventilen til retten til å stanse strømmen og ruge cellene med inhibitor for nødvendige tidsrom (f.eks 15 min). Aktivere flyten av skifter ventilen hvert ~ 10 min ~ 15 å hindre oksygenmangel. Gjenta stimulering med andre linje.
  3. Alternativ metode for å vurdere svaret til akutt mekanisk stimulering bruke brønnene
    1. satt opp av brønnene ut med DB i standardprotokollen 23. Holde kompensasjon presset på 1500 psi.
    2. Samle og fortynne vegetative celler som beskrevet i trinn 2.1. Sted 25 µL dråper ~7.5 x 10 5 celler/mL i en 1-vel kammer, kunne følge på minst 10 min, og dekke med 3 mL DB.
    3. Plasser kammer på en invertert fluorescens mikroskop utstyrt med en 40 X oljeobjektiv. Finne cellene. Forsiktig lavere i brønnene i midten av synsfeltet til det første berører bunnen av kammeret.
      Merk: Siden kompensasjon Press ble satt på 1500 Psi, cellene vil bli kontinuerlig utsatt for en veldig treg flyten av DB fra brønnene.
    4. Begynner å anskaffe bilder med RFP eller GFP belysning med 3 s mellomrom. Bruk det ' Clean ' funksjonen å løslate bolus væske fra brønnene. Fortsette imaging jegn tilstedeværelsen av flyt på grunn av kompensasjon press alene.
  4. En alternativ metode å vurdere svaret til akutt mekanisk stimulering bruke bulk buffer tillegg
    1. samle og fortynne vegetative celler som beskrevet i trinn 2.1. Sted 20 µL drops celleområde ~ 1 x 10 6 celler/mL i DB i en brønn fra en 8-vel kammer. Tillate at celler å følge i minst 10 min.
    2. Begynner å anskaffe bilder med RFP - eller GFP-spesifikk belysning på en invertert fluorescens mikroskop utstyrt med en 40 X-målet med 3 s mellomrom. Fokusere på et område nær kanten av drop.
    3. Raskt legge til 430 µL DB til en side av brønnen. Fortsette bildebehandling.
    4. For analyse av samspillet mellom mekanisk og kjemisk stimuli, 12 eller 45 s etter mekanisk stimulering, forsiktig legge 50 µL av folsyre (siste konsentrasjon 20 nM) eller kjøretøy (DB) uten å indusere en mekanisk respons. Fortsette bildebehandling.
  5. Kvantifisering av svar
    1. åpne det 32-biters TIFF-bildet i bilde analyseprogramvare (se Tabell for materiale for detaljer) 27.
    2. Under den ' analyser ' fanen, gå til " sette mål ". Merk av for ' mener grå verdien '. Kontroller at de andre boksene ikke kontrolleres. Klikk " OK ".
    3. Under den ' prosessen ' kategorien " trekke bakgrunn ". Hold rullende ballen radius på 50 piksler, og ikke å finne noen av alternativene vises i menyen. Zoome inn på en cellen ved hjelp av ' forstørrelsesglass ' verktøyet.
    4. Bruke den ' rektangel ' verktøyet, tegner en boks (~2.5 x 2,5 µm 2) i stoffer og pass på ikke å trekke den kjernen eller plasma membranen. Trykk " Ctrl " + " M " nøkler eller gå til den ' analyser ' kategorien og klikk på " mål " å finne middelverdien grå boksen. Videre til etterfølgende bilder og måle igjen, gjør at boksen forblir i stoffer.
      Merk: Siden D. discoideum cellene flytte raskt boksen kan flyttes fra én ramme til neste å holde det i stoffer.
    5. Tross alt av rammene er analysert, kopiere verdier til et regneark. Kontoen for celle til celle variasjon i uttrykket nivåer av ulike biosensors, normalisere verdiene for grå middelverdien observert samtidig 0. Beregner resiprok verdi av det verdier å reflektere akkumulering av signalet på cortex.

5. Kontinuerlig mekanisk stimulering og Live Imaging av enkeltceller på mikroskopet

  1. satt opp cellene akkurat som beskrevet ovenfor for akutt mekanisk stimulering analyse i trinn 4.1.1 - 4.1.3. Åpne pluggen dekker reservoaret med bufferen slik volumet kan bli toppet Hvis svaret er analysert i mer enn et par minutter om gangen.
    Merk: Fordi reservoaret er åpen for varigheten av eksperimentet, denne analysen er gjennomført i fravær av press og avhengig av gravitasjon flow alene. For å øke hastigheten på flyten av tyngdekraften, avløpet kan plasseres på en tabell under mikroskopet.
  2. Begynner imaging celler med RFP - eller GFP-spesifikk belysning på en invertert fluorescens mikroskop utstyrt med en 40 X-målet med 3 s mellomrom for analyse av biosensor svar. Alternativt bilde med kontrast med en 20 X-målet med 10 s mellomrom for analyse av generelle celle migrasjon.
  3. Slå på strømmen etter flere rammer på null-trykkinnstilling (i.e. flyt er på grunn av tyngdekraften alene eller ~ 15 dyn/cm 2) ved å bytte ventilen til åpen posisjon. Når nivået av væske faller til 5-10 mL i reservoaret, fylle opp med mer buffer. Sørg for å legge til væsken nøye slik luftbobler ikke blir fanget i linjene.
    Merk: Det er viktig å legge til væske av samme temperatur å unngå et sjokk respons i cellene.
  4. Kvantifisere celle fart og utholdenhet med migrasjon analyseprogramvare (se Tabell for materiale for detaljer) ifølge produsenten ' s instruksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Timelige svar av chemotaxis regulatorer akutt mekanisk stimulering

For å vurdere svaret D. discoideum celler til mekanisk stimulering, ble tilhenger aggregering kompetente celler utsatt for en kort puls av skjær. Aggregering-kompetent D. discoideum celler skiller leiren, som kan være kjente av omkringliggende celler. For å overvinne bidrag av celle-celle signalisering, ble celler behandlet med koffein, som hemmer adenylyl cyclase i D. discoideum og dermed hindrer leiren sekresjon28. Faktisk celler pre-behandlet med koffein hadde svært lav basale aktiviteten av PKBR1 og ERK2, og viste en robust økning i fosforylering av viktige rester av disse kinaser etter 5 s stimulering med skjær flyt (figur 1A). Responsen var forbigående og nådde rundt 10-15 s PKBR1 og rundt 30 s for ERK2, på samme måte i tidligere publisert funn for aktivering av disse proteinene med chemoattractant7.

Selv om det er vanskelig å vurdere effektiviteten av svaret vurderer den basale lavt, forstudier som førte til utviklingen av denne analysen, sammenlignet stimulering med skjær flyt alene (eller med et kjøretøy) å skråstille flyt i nærvær av en chemoattractant leiren (figur 1B). Denne analysen viste ikke en økning i svaret til leiren, antyder at responsen på signalet signaltransduksjon nettverket skråstille flyt er mettet. Selv i denne analysen ikke økte leiren fosforylering av PKBR1, kan cellene svar på chemoattractant observeres bruker en standard stimulering protokoll der aggregering kompetente celler holdes i suspensjon, stimulert med cAMP, og lysed på ulike tidspunkt etter stimulering. Som vist i figur 1 c, under disse forholdene er det en forbigående økning i PKBR1 fosforylering svar på chemoattractant, men ikke kjøretøy. Topp svaret er observert på 30 s i denne analysen fordi temperaturen i cellen suspensjon under analysen er ~ 9 ° C sammenlignet ~ 22 ° C for mekanisk stimulering analysen beskrevet ovenfor26.

Spatiotemporal responsen fra ledende og henger kanten indikatorer som akutt mekanisk stimulering

Siden befolkningen analysen ovenfor gir bare timelige informasjon om atferden av chemotaxis regulatorer, ble celler også utsatt for en kort mekanisk stimulans mens blir observert med et mikroskop. Denne analysen kan utføres med aggregering-kompetent eller vegetative D. discoideum celler uttrykke ulike fluorescently merket biosensors som lokalisering er definert i celler stimulert med en chemoattractant. To ledende markører, PH-domene av Crac og kalkΔcoil, som er rekruttert av PIP3 eller nylig polymerized begrepsordbok, viste begge hovedsakelig cytosolic lokalisering i hvile celler som tidligere rapportert (figur 2A, ekstra film 1 )4,29. I celler som var basally aktive, kan disse biosensors også sees på tuppen av eukaryotene. Etter stimulering med skjær flyt for 2 s, biosensors raskt relocalized til cortex med en topp på ~ 6 til 10 s, og returnerte til stoffer med ~ 30 s. Derimot lokalisert en lagging kanten markør PTEN på cortex før stimulering (figur 2A). Etter en kort puls med skjær flyt økt cytosolic PTEN intensitet, men med lavere dynamikk enn ledende biosensors. En endring i biosensor lokaliseringen fra stoffer sett til cortex, og vice versa, tydelig på som en endring i cytosolic intensiteten muliggjør enkel kvantifisering av svaret.

Observerte virkemåten til biosensors i svaret til akutt mekanisk stimulering er konsistent med ledende og henger kanten lokalisering dynamics svar til stimulering med ensartet chemoattractant. Dette var ikke unik for de tre biosensors som vises. Som er publisert tidligere, lignende endringer i lokalisering ble også observert for ledende markører RBD og RalGDS, aktivert som gjenkjenner Ras og Rap1, henholdsvis, så vel som for en annen henger kanten markør CynA22,30.

En lignende analysen kan brukes til å vurdere effekten av ulike hemmere av en enkel endring av eksperimentelle oppsett fra en enkelt inntastingslisten en dobbeltseng. Bruker denne metoden, kan cellene først utsatt for kontroll forhold, og deretter byttet til bufferen som inneholder ønsket test agent. For eksempel tillegg av utgangen-depolymerizing narkotika LatA blokkert responsen av RBD, samt kalkΔcoil, til akutt mekanisk stimulering (figur 2B).

Global respons foran celle migrasjon under langvarig stimulering med skjær flyt

Tilnærmingen beskrevet her kan også tilpasses å studere virkningene av skjær på D. discoideum overføring. Faktisk, Hvis strømmen ikke ble stengt av etter 2 s men forble på for varigheten av forsøket, vegetative celler viste regisserte migrering mot strømmen (Figur 3supplerende Movie 2). Det bør bemerkes at skjær flyten nødvendig å lokke fram en vandrende svar var lavere enn trykket som ble vanligvis brukt til å oppnå en global reaksjon med akutt stimulering i vegetative celler (for eksempel som sett i finne 2B). Men selv på lavere press vises celler et robust uniform svar, målt ved en endring i kalkΔcoil lokalisering, som noen endring i plasseringen av formelcellen. Dermed viste disse eksperimentene tydelig at 1) den globale responsen ikke avhengig av bevegelsen av cellen, og 2) den globale responsen foran regissert migrasjon.

Alternative tilnærminger testing svaret til akutt mekanisk stimulering

Selv om bruken av en flyt gjennom kammeret har klare fordeler for studier av svaret til akutt mekanisk stimulering, godkjent vi også to ekstra analyser for å teste responsen på enkeltceller akutt mekanisk stimulering. Som vist i Figur 4, LimEΔcoil raskt og transiently re lokalisert fra stoffer til cortex når celler ble stimulert av bolus tillegg av buffer leveres enten av brønnene (figur 4A) eller manuelt ved hjelp av bulk buffer tillegg med en pipette (figur 4B). Det bør bemerkes at en klar ulempe av begge disse analyser er at den nøyaktige mengden skjær kraft levert til cellen er ukjent, og kan ikke lett endres. Men i situasjoner der bytte mellom mekanisk og kjemisk stimuli er ønsket, tilbyr bulk buffer tillegg en solid alternativ til stimulering flyt enheten.

Figure 1

Figur 1: representant resultater for biokjemiske vurdering av responsen av D. discoideum celler til akutt mekanisk eller kjemikalie stimulering. Aggregering kompetente celler ble utsatt for mekanisk eller kjemikalie stimuli, lysed på de angitte tidspunkt og immunoblotted ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner fosforylert PKBR1 eller ERK2. (A) tilhenger celler ble stimulert på en orbital shaker 5 s. Membranen var farget med Coomassie briljant blå (CBB) vise like protein lasting. (B) tilhenger celler ble stimulert av manuell bevegelse av platen i en cross-wise måte ca 5 s følgende kjemiske stimulering grunn tillegg av 1 µM cAMP eller bufferen (vehicle) eller uten noen kjemiske stimulering (-). De to immunoblots viser omfanget av variasjon i basale aktivering av PKBR1 på tid 0. Noen ganger kan PKBA aktivisering også registreres i denne teknikken, som vist i nedre panel. (C) suspensjon celler ble stimulert med 1 µM cAMP eller bufferen (vehicle). Del (A) av dette tallet har blitt endret fra Artemenko et al. (2016) 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant resultater for akutt mekanisk stimulering og live bildebehandling for enkeltceller på mikroskopet. (A) aggregering-kompetent D. discoideum celler uttrykke RFP-merket LimEΔcoileller GFP-merket PH-Crac eller PTEN ble stimulert med enveis laminær strømning på 15 dyn/cm2 for 2 til 5 s. bildene var samlet hver 3 s . Representant cellene viser translokasjon av biosensors i respons til mekanisk stimulering vises. Akkumulering av hver biosensor på cortex ble kvantifisert som inverse av mener cytoplasmatiske intensiteten normalisert tid 0. Til gjennomsnittlig svartid 18 (LimEΔcoil), 20 (PH-Crac) eller 6 (PTEN) celler vises. Verdier er mener ± SE. (B) Vegetative celler uttrykke RFP-merket LimEΔcoil- RFP og GFP-merket RBD ble behandlet med kjøretøy eller 5 µM LatA i minst 15 min, og deretter stimulert med enveis laminær strømning på 41 dyn/cm2 for 2 s. bilder ble samlet hver 3 s. RBD-GFP og kalkΔcoil- RFP akkumulering på cortex ble kvantifisert som (A). Verdiene er gjennomsnittlig ± SE. Antall celler analysert angis ved siden av hver betingelse. Skala bar = 10 µm. Dette tallet har blitt endret fra Artemenko et al. (2016) 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representant resultater for responsen av D. discoideum celler til langvarig stimulering med flyt. (A) Vegetative celler uttrykke RFP-merket kalkΔcoil ble utsatt for kontinuerlig enveis laminær strømning på 15 dyn/cm2 og fotografert hver 3 s. spor 11 celler vises i (B). Skala bar = 10 µm. Dette tallet har blitt endret fra Artemenko et al. (2016) 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representant resultater for alternative tilnærminger til testing svaret til akutt mekanisk stimulering. (A) Vegetative D. discoideum celler uttrykke RFP-merket LimEΔcoil ble utsatt for brønnene (*) basally slippe analysebuffer med ett langsom rate. En kort økning i strømningshastighet ble oppnådd ved rask levering av bolus av analysebuffer gangen 0. Bildene ble samlet alle 3 s. (B) Vegetative D. discoideum celler uttrykke RFP-merket LimEΔcoil belagt som en liten dråpe i en mikroskopi kammer var mekanisk stimulert av tillegg av store mengder buffer på kammeret. Bildene ble samlet hver 3 s. skala bar = 10 µm. del (A) av dette tallet er endret fra Artemenko et al. (2016) 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra film 1: Akutt mekanisk stimulering utløser rask og forbigående translokasjon av kalkΔcoil- RFP eller PH-Crac-GFP fra stoffer til cortex i aggregering kompetente D. discoideum celler uttrykke disse biosensors. Enveis laminær strømning var aktivert for 5 s gangen 0 og celler ble fotografert med 3 s mellomrom. Avspillingshastigheten er 5 rammer/s. To eksempler for hver celle linje vises. Skala bar = 10 µm. Denne filmen tilsvarer figur 2A og har blitt endret fra Artemenko et al. (2016) 22. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra film 2: Kontinuerlig mekanisk stimulering utløser rask og forbigående translokasjon av kalkΔcoil- RFP fra stoffer cortex før overføring av celler mot retningen på flyten. Vegetative celler uttrykke LimEΔcoilble - RFP utsatt for kontinuerlig skjæring stress på 15 dyn/cm2 starter når 0 og fotografert med 3 s mellomrom. Avspillingshastigheten er 10 rammer/s. skala bar = 10 µm. Denne filmen tilsvarer Figur 3 og er tidligere publisert i Artemenko et al. (2016) 22. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene som er beskrevet her tilbyr en praktisk måte å vurdere både befolkning og enkeltcelle virkemåten svar hvis du vil skråstille flyt. Viktigere, mens tidligere studier analysert lokalisering av fører og henger kanten markører under overføringen, kan nåværende tilnærming etterforskning til umiddelbare virkninger ved å bruke skjær flyten akutt. Benytter denne metoden viste vi at, faktisk, første reaksjon av celler for å skråstille flyt ikke krever celle migrasjon. I stedet, rask og forbigående svaret første skjær flyt stimulans foran retningsbestemt overføringen sett med langvarig eksponering å skråstille flyt, på samme måte som den første globale responsen sett med chemoattractant gradering.

Biokjemiske og mikroskopiske tilnærminger gir utfyllende data selv om hver metode har forskjellige fordeler og ulemper. Stimulering etterfulgt av cellen lyse og immunoblotting PKBs, KrsB og ERK, for eksempel analyserer en hel populasjon av celler og dermed gjennomsnitt celle til celle variasjon, i motsetning til en analyse som undersøker enkeltcelle atferd. Imidlertid pleier befolkningen-baserte analyser å maske subtile endringer i celle atferd som kan lett observeres ved å analysere individuelle celler. I tillegg er biokjemiske analysen beskrevet her bare effektivt med aggregering kompetente celler, av grunner som vil bli diskutert senere. Derimot mikroskopi-baserte analysen av relocalization av RBD, RalGDS, PH-Crac, LimEΔcoilog PTEN, for eksempel mellom cortex og stoffer er effektivt for både vegetative og aggregering kompetente celler, og dermed tillater observasjoner som er bredt aktuelt celler med varierende grad av polarisering. Hva gjør disse metodene komplementære er det faktum at de undersøke forskjellige sett med tilgjengelige ledende/henger kanten markører, således utvide dekningen av signal signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk testet med skjær flyt analysen.

Det er fortsatt uklart hvorfor vegetative celler, noe som reagerer veldig robust i mikroskopi-baserte analyser, ikke svarer stimulering etterfulgt av cellen lyse og immunoblotting. En mulighet er at mengden av skjæring kraft brukt på celler når platen er rotert ikke samsvarer med styrken oppleves av cellene i en flyt kammer. Utviklet celler, i kontrast, kanskje har en lavere terskel for aktivisering, og dermed svare under forholdene. Det er usannsynlig at biosensors der aktiviteten er målt ved biokjemiske analysen ikke er angitt eller er ikke aktivert i vegetative celler, siden stimulering av vegetative celler med folsyre fører til robust aktivering bare av PKBR1/PKBA og ERK2 (data ikke vises). Videre viser vegetative celler klart rekruttering av PH-Crac, som gjenspeiler PIP3 opphopning, i mikroskopi-baserte analysen. Siden PKBA rekruttering er også avhengig av PIP3, virker det usannsynlig at PKBA ikke ville svare på akutt mekanisk stimulering, med mindre vilkårene i biokjemiske analysen ikke er optimal som nevnt ovenfor. Det er fremdeles aktiv etterforskning.

Biokjemiske analyse av chemotaxis regulatorer nødvendig tilstedeværelsen av koffein hele eksperimentet. Opprinnelig ble koffein lagt til forhindre celle til celle signalisering på grunn av utskillelsen av leiren. Det synes imidlertid at koffein har en annen rolle foruten hemming av adenylyl cyclase (ACA) siden ACA null celler fortsatt behov koffein for fosforylering av PKBR1 i svaret til akutt mekanisk stimulering. Koffein har vist tidligere å blokkere TorC2 aktivitet26. Det er mulig at hemming av TorC2 blokkert noen basale motilitet av celler, og dermed senket basale aktivering av PKBR1 og andre komponenter av signal signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk. Lav basale aktiviteten var avgjørende for å observere svaret å skråstille flyt. Faktisk, når cellene var samlet på tidligere tidspunkt under utviklingen, vises de økt basale aktiviteten og redusert skjær-flow indusert svar. Interessant, er det kjent at vegetative celler har proporsjonalt mer PKBA aktivitet og mindre PKBR1 sammenlignet med utviklet celler31. Det er mulig at basale staten er regulert litt annerledes i vegetative og aggregering kompetente celler, ytterligere bidrar til manglende svar vegetative celler i biokjemiske analysen. Merkelig, når cellene var samlet på senere poeng av utvikling, de hadde også en redusert svar, sannsynligvis på grunn av den sterke innflytelsen av polaritet på lokaliseringen og aktivering av ulike chemotaxis regulatorer undersøkt i denne analysen.

Stimulering av celler i en mikroskopi kammer avslørte at både styrken og varigheten av stimulans bidra til maksimal svaret22. Med andre ord, maksimal svar kan oppnås selv med en lav skjær kraft hvis brukes for en lengre periode (10 s versus 2 s). Denne observasjonen forklarer hvorfor celler har en første global respons når de først utsatt for en kontinuerlig, men svak stimulans som fører til skråstille flyt-indusert migrasjon. Med gjeldende apparater var vi ikke generere lavt nok skjær flyt for å undersøke den nedre enden av området.

Kanskje er den viktigste konsekvensen av studier utført med akutt mekanisk stimulering at både mekanisk og kjemisk stimuli synes å mate inn felles signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk. Selv om vi viste at to stimuli integrere bruker bulk buffer tillegg til mekanisk stimulering, mål fremtidige studier å utvikle et system der chemoattractant kan leveres raskt i gjennomflytsenhet kanalen, som ville være en mye mer allsidig og effektiv måte å vurdere integrering av mekanisk og kjemisk stimuli. Dessverre er chemoattractant tillegg Bruk gjeldende tolinjers forbundet med en annen skjær flyt stimulans fordi chemoattractant må leveres i nærvær av flyt. Et levedyktig alternativ kan være laser-stimulere utgivelsen av en chemoattractant fra en bur forløper som vellykket for leiren Westendorf et al. 32. i fremtiden, det vil også være interessant å undersøke integrering av andre stimuli, for eksempel skjær flyt og variabel elektrisk felt eller skjær flyt og variabel substrat stivhet. Det siste eksemplet er interessant fordi det omfatter to typer mekanisk stimulering, selv om det første mottaket kan variere mellom dem. Bekrefter at alle stimuli som induserer regissert overføring deler samme signal signaltransduksjon nettverk og varierer bare i hvordan stimulans oppfattes vil forklare hvordan celler kan navigere i komplekse miljøer. Til slutt, vi allerede vist at akutt stimulering med skjær flyt fører til spredning av nøytrofile-lignende menneskeceller22. Videre arbeidet vil ytterligere undersøke lokalisering og aktivering av ulike komponenter av signal signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk med mekanisk stimuli i pattedyrceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd R35 GM118177 til PND.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dextrose Fisher D16-1 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone Fisher DF0120-17-6 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract Fisher 50-550-445 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O Fisher S373-500 Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4 Fisher P386-500 Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) Fisher ICN10040525 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto) Fisher DF0118-17-0 Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4 Fisher P288-100 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar Fisher BP1423-500 Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4 Fisher M65-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2 Fisher C79-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine Fisher O1728-500 Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) Fisher 11-680-1100MG Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid Sigma F7876 Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base Fisher BP152-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol Fisher G33-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 1610610 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF Fisher S299-100 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4 Fisher 50-994-911 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate Fisher S390-500 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) Sigma 11873580001 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A Enzo Life Sciences BML-T119-0100 Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel Bio-Rad 3450029 Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane Bio-Rad 1620177 Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody Cell Signaling 2060 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody Cell Signaling 4370 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) GE Healthcare NA934-100UL Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) Bio-Rad 1705060 Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) Pierce PI46430 Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue Fisher PI20278 Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic) Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name Company Catalog Number Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) New Brunswick Scientific Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish Fisher FB0875712 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer Fisher 02-671-51B Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) Fisher 08-772A Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL) VWR 13915-985 Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) Ibidi 10902 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) Ibidi 80316 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) Ibidi 10978 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) Ibidi 10964 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) Ibidi 10842 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) Zeiss Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) Perkin-Elmer DM 16000 An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan Eppendorf 5252000021D and 5192000027 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) Eppendorf 930000035 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) Eppendorf 5242956.003 Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) Fisher 12-565-472 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) Fisher 12-565-338 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji) NIH https://fiji.sc/ Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) Gradientech http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Tags

Mobilnettet biologi problemet 129 signaltransduksjon mechanotransduction skjæring stress chemotaxis rheotaxis skjær flyt-indusert migrasjon regissert migrasjon biosensor lokalisering akutt stimulering
Vurdering av <em>Dictyostelium discoideum</em> svaret til akutt mekanisk stimulering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Artemenko, Y., Devreotes, P. N.… More

Artemenko, Y., Devreotes, P. N. Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation. J. Vis. Exp. (129), e56411, doi:10.3791/56411 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter