Her beskriver vi metoder for å vurdere cellulær respons til akutt mekanisk stimulering. I mikroskopi-baserte analysen undersøker vi lokalisering av fluorescently-merket biosensors etter kort stimulering med skjær flyt. Vi tester også av interesse i svaret til akutt mekanisk stimulering biokjemisk.
Chemotaxis eller migrering opp gradering av en chemoattractant, er det beste forståtte modusen rettet migrasjon. Studier med sosiale amoeba Dictyostelium discoideum avslørte at et komplekst signal signaltransduksjon nettverk av parallelle forsterker responsen på chemoattractants, og fører til partisk begrepsordbok polymerisasjon og protrusion av en pseudopod i den retning på en forløpning. Derimot er molekylære mekanismer kjører andre typer regissert migrasjon, for eksempel på grunn av eksponering for skråstille flyt eller elektrisk felt, ikke kjent. Mange regulatorer av chemotaxis utstillingen lokalisering ledende eller henger kanten av en overføring celle, samt vise forbigående endringer i lokalisering eller etter globale stimulering med en chemoattractant. For å forstå molekylære mekanismer av andre typer regissert migrasjon utviklet vi en metode som tillater undersøkelse av cellulær respons til akutt mekanisk stimulering basert på kort (2-5 s) eksponering å skråstille flyt. Denne Stimuleringen kan leveres i en kanal mens imaging celler som uttrykker fluorescently-merket biosensors for å undersøke enkeltcelle atferd. I tillegg stimuleret celle befolkningen plate, lysed, og immunoblotted ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner aktive versjoner av proteiner av interesse. Ved å kombinere begge analyser, kan en undersøke en rekke molekyler aktivert av endringer i subcellular lokalisering og/eller fosforylering. Benytter denne metoden vi funnet ut at akutt mekanisk stimulering avtrekker aktivisering av chemotactic signal signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk. Muligheten til å undersøke mobilnettet svar til akutt mekanisk stimulering er viktig for å forstå initiering hendelsene nødvendig for skjær flyt-indusert motilitet. Denne tilnærmingen har også et verktøy for å studere chemotactic signal signaltransduksjon nettverket uten forvirrende påvirkning av chemoattractant reseptoren.
Migrering av eukaryote celler er partisk av ulike kjemiske og fysiske signaler i miljøet, inkludert graderinger av løselig eller substrat bundet chemoattractants, variabel stivhet av underlag, elektrisk felt eller skjær flyt. Selv om det har vært mange fremskritt i vår forståelse av molekylære mekanismer kjøring chemotaxis, mindre er kjent om andre typer regissert migrasjon og hvordan disse ulike signaler er integrert på cellenivå å produsere en enhetlig trekkfugler svar.
Regisserte migrering mot en økende konsentrasjon av en chemoattractant innebærer tre atferdsmessige komponenter: motilitet, retningsbestemt sensing og polaritet1. Motilitet refererer til tilfeldige movement celler ved pseudopod protrusion. Retningsbestemt sensing er muligheten for en celle for å finne kilden til en chemoattractant, noe som kan skje selv i immobilisert celler. Polaritet refererer til mer stabil asymmetrisk fordeling av intracellular komponenter mellom ledende og henger kanten av en celle, som fører til økt utholdenhet i bevegelse.
Cellulær respons til en chemoattractant, avhengig av aktiviteten til fire konseptuelt definerte regulatoriske nettverk: reseptor / G protein, signaltransduksjon, begrepsordbok cytoskjelett og polaritet1. Chemoattractant binding til G protein-kombinert reseptoren overfører signalet via heterotrimeric G proteiner α og βγ til nedstrøms signal signaltransduksjon nettverket som forsterker retningsbestemt signalet. Flere veier i signal signaltransduksjon nettverket fungerer parallelt og mate inn utgangen cytoskjelett nettverket bias begrepsordbok polymerisasjon og påfølgende pseudopod protrusion, i retning av graderingen. Blant viktige regulatorer av chemotaxis er Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), fosfatase og tensin homolog (PTEN) og guanylyl cyclase. Tilbakemelding mekanismer i signal signaltransduksjon nettverket og mellom signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk ytterligere forsterke svaret. Endelig, dårlig definerte polaritet nettverket mottar inndata fra utgangen cytoskjelett, og ytterligere skjevheter signal signaltransduksjon nettverket for å fremme vedvarende migrasjon i retning av graderingen.
Mye av vår mekanistisk forståelse av chemotaxis ble gjort mulig på grunn av utviklingen av fluorescently-merket biosensors for ulike komponenter av regulatoriske nettverk. Mange chemotaxis regulatorer har en asymmetrisk fordeling på regulatoriske molekylet seg selv eller sin virksomhet. For eksempel biosensors som gjenkjenner aktivert versjoner av små GTPases Ras og Rap1-Ras-bindende domener av Raf1 (referert til som RBD her) og RalGDS, henholdsvis-lokalisere til forkanten av en chemotaxing celle2,3. Tilsvarende PI3K og dens fabrikat phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), gjenkjennes av et pleckstrin homologi (PH) domene, viser lokalisering på forsiden av en celle4,5. I kontrast, en 3-fosfatase PTEN, konverterer som PIP3 tilbake til phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate, regionaliserer henger kanten av cellen6. Viktigere, endre disse biosensors deres lokalisering svar på globale stimulering med en chemoattractant. Ledende markører, som er cytosolic eller på tuppen av utstikkende deler i en hvile celle, relocalize til cortex, mens henger kanten markører, som har kortikale lokalisering og er fraværende fra tuppen av utstikkende deler i en hvile celle, blir cytosolic etter stimulering. Analyse av biosensor distribusjon svar på globale stimulering med en chemoattractant minimerer bidrag av motilitet og polaritet, som ofte forvirrer observasjoner. Global eller uniform stimulering av en celle hjuloppheng med en chemoattractant brukes også som et verktøy til å vurdere endringer for hele befolkningen i protein aktivisering, ofte oppdages av protein fosforylering7,8,9 . Denne biokjemiske analysen brukes hovedsakelig å få timelige informasjon, mens mikroskopi brukes til å samle både timelig og romlig informasjon om virkemåten av ulike komponenter av regulatoriske nettverk.
Signalet signaltransduksjon nettverket har funksjoner av en nervøs systemet10,11. Svar på supra-terskel chemotactic stimuli er “all-or-none” og vise ildfaste periodene. Svar også utløses stochastically og kan vise oscillasjon atferd. Signalet signaltransduksjon hendelser er lokalisert i områder på cortex som overføres som bølger12,13,14,15. Foran, tilbake, markører er rekruttert til eller dissociate fra, de aktive sonene av overfører bølger. På grunn av ildfaste regionen etterfølgende aktive sonen, tilintetgjøre oppositely rettet bølgene som de møter. Overfører signalet signaltransduksjon bølgene ligger de mobilnettet utstikkende deler som megle celle migrasjon10.
Mye av den nevnte informasjonen om chemotaxis kom fra studiene på den sosiale amoeba Dictyostelium discoideum, selv om lignende regulatoriske mekanismer er også nøytrofile og andre pattedyr cellen typer16 . Dictyostelium er en veletablert modell organisme har en robust chemotactic reaksjon under sult, når tusenvis av enkeltceller migrere mot en aggregering senter, til slutt danne en flercellet frukt kroppen inneholder sporer. Chemotaxis er også avgjørende under én celle vekst stadium i denne organismen for å finne bakteriell mat kilder. Viktigere, er migrering av Dictyostelium enkeltceller bemerkelsesverdig lik migrering av pattedyr nøytrofile eller metastatisk kreftceller, som gjennomgå meget rask amoeboid-type overføring. Faktisk, er både generelle topologien regulatoriske nettverk, samt mange av de individuelle signaltransduksjon trasé involvert i chemotaxis bevart mellom Dictyostelium og leukocytter hos pattedyr17. Videre bruke andre celler, for eksempel fibroblaster, receptor tyrosine kinaser (RTK) i stedet for GPCRs; men kan RTKs mate inn lignende nettverk.
I motsetning til chemotaxis mangler grundig forståelse av signalnettverk mekanismer som driver ulike transportmåter regissert migrasjon. Tilsvarende cellene migrerer en chemoattractant stigning flere studier har rapportert utløsning eller lokalisering av typiske ledende markører, inkludert begrepsordbok polymerisasjon, PIP3 og/eller ekstracellulær signal regulert kinase (ERK) 1/2, på den fronten celleområde gjennomgår regisserte migrering Svar å skråstille flyt eller endringer i elektrisk felt18,19,20,21. Men i disse studiene resulterte kontinuerlig eksponering til stimulans også i celle migrasjon, forlate åpne spørsmålet om, for eksempel den ledende markører lokalisere spesielt som svar på en stimulans, eller om de bare lokalisere i forkant på grunn av økt antall eukaryotene på forsiden av en overføring celle.
Vi utviklet analyser som tillater oss å observere svaret celleområde akutt mekanisk forstyrrelsene levert som skjær flyt både på befolkningsnivå og individuelle celler22. Ligner på globale stimulering med en chemoattractant, akutt stimulerendesjon med skjær flyt kan studere en cellulær respons til en mekanisk stimulans uten forvirrende bidrag fra motilitet eller polaritet. Kombinere disse biokjemiske og mikroskopiske analyser med genetisk eller farmakologiske forstyrrelser tillater oss å lære om hvordan mekanisk stimuli oppfattes og overføres. Videre, denne tilnærmingen gir også en ny metode for å trykke inn systemet nedstrøms chemoattractant reseptoren i fravær av en chemoattractant, og dermed isolere signalet signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverkene fra reseptor/G protein nettverk.
Bruke teknikkene nedenfor vi nylig vist at akutt skjæring stress fører til aktivering av flere komponenter i chemotactic signal signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk22. Ved å bruke akutt mekanisk stimulans på ulike intervaller, viste vi at tilsvarende til chemoattractants, respons på mekanisk stimuli også viser funksjonene i en nervøs systemet, inkludert all-or-none virkemåten til svaret under Mette forhold og tilstedeværelse av en ildfast periode. Til slutt, ved å kombinere mekanisk og kjemisk stimulering vi viste at to stimuli dele signalet signaltransduksjon og utgangen cytoskjelett nettverk, som sannsynligvis gir mulighet for integrering av flere stimuli til bias celle migrasjon.
Metodene som er beskrevet her tilbyr en praktisk måte å vurdere både befolkning og enkeltcelle virkemåten svar hvis du vil skråstille flyt. Viktigere, mens tidligere studier analysert lokalisering av fører og henger kanten markører under overføringen, kan nåværende tilnærming etterforskning til umiddelbare virkninger ved å bruke skjær flyten akutt. Benytter denne metoden viste vi at, faktisk, første reaksjon av celler for å skråstille flyt ikke krever celle migrasjon. I stedet, rask og forbigående svaret…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd R35 GM118177 til PND.
Reagents | |||
Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials and Equipment | |||
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |