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Biology

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56411
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Qui descriviamo i metodi per la valutazione della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta. Nell'analisi della base di microscopia, esaminiamo la localizzazione di biosensori fluorescente etichettati dopo breve stimolazione con flusso di shear. Ci prova anche l'attivazione di varie proteine di interesse in risposta alla stimolazione meccanica acuta biochimicamente.

Abstract

Chemiotassi, o la migrazione a una sfumatura di un fattore chemiotattico, è la modalità migliore capita di migrazione diretto. Gli studi utilizzando ameba sociale Dictyostelium discoideum hanno rivelato che una rete di trasduzione del segnale complesso di vie parallele amplifica la risposta di chemioattrattanti e conduce alla polimerizzazione dell'actina prevenuto e sporgenza di un pseudopodo nella direzione di una sfumatura. Al contrario, i meccanismi molecolari guida altri tipi di migrazione diretto, ad esempio, a causa di esposizione a taglio di flusso o campi elettrici, non sono noti. Molti regolatori di chemiotassi esibiscono localizzazione presso il bordo iniziale o in ritardo di una migrazione delle cellule, come pure mostrano cambiamenti transitori in localizzazione o attivazione dopo stimolazione globale con un fattore chemiotattico. Per comprendere i meccanismi molecolari di altri tipi di migrazione diretto abbiamo sviluppato un metodo che consente l'esame della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta basata sull'esposizione breve (2-5 s) per la tosatura del flusso. Questa stimolazione può essere trasportata in un canale mentre le cellule che esprimono con etichetta fluorescente biosensori per esaminare il comportamento delle singole celle di imaging. Inoltre, la popolazione delle cellule può essere stimolata in un piatto, lisate e immunoblotted usando gli anticorpi che riconoscono le versioni attive di proteine di interesse. Combinando entrambi i test, si può esaminare una vasta gamma di molecole attivate dai cambiamenti nella localizzazione subcellulare e/o fosforilazione. Utilizzando questo metodo abbiamo determinato che acuta stimolazione meccanica innesca l'attivazione delle reti di citoscheletro l'actina e la trasduzione del segnale chemiotattico. La capacità di esaminare le risposte cellulari agli stimoli meccanici acuta è importante per comprendere l'origine eventi necessari per motilità indotta da flusso di shear. Questo approccio fornisce anche uno strumento per lo studio della rete di trasduzione del segnale chemiotattico senza l'influenza di confusione del recettore chemoattractant.

Introduction

Migrazione delle cellule eucariotiche è prevenuto da diversi stimoli chimici e fisici nell'ambiente, compresi gradienti di chemioattrattanti solubile o associata a substrato, rigidità variabile del flusso di shear, campi elettrici o substrati. Anche se ci sono stati molti progressi nella nostra comprensione dei meccanismi molecolari guida chemiotassi, meno si sa sugli altri tipi di migrazione diretto e come questi segnali diversi sono integrati a livello cellulare per produrre un unificato migratori risposta.

Regia di migrazione verso una crescente concentrazione di un chemoattractant coinvolge tre componenti comportamentali: motilità, rilevamento direzionale e polarità1. Motilità si riferisce al movimento casuale delle cellule raggiunto dalla sporgenza pseudopodo. Rilevamento è la capacità di una cellula per individuare la fonte di un chemoattractant direzionale, che può verificarsi anche in immobilizzato cellule. Polarità si riferisce alla distribuzione asimmetrica più stabile di componenti intracellulari tra il leader e il bordo in ritardo di una cella, che conduce a una maggiore persistenza in movimento.

Risposta cellulare ad un chemoattractant dipende dall'attività delle quattro reti di regolazione concettualmente definiti: recettore / proteina G, trasduzione del segnale, citoscheletro di actina e polarità1. Associazione di fattore chemiotattico per i recettori accoppiati a proteine G trasmette il segnale tramite α proteine G eterotrimeriche e βγ per la rete di trasduzione del segnale a valle, che amplifica il segnale direzionale. Le vie multiple all'interno della rete di trasduzione del segnale agiscono in parallelo e alimentano la rete del citoscheletro di actina per polimerizzazione dell'actina bias e conseguente pseudopodio protrusione, in direzione della sfumatura. Tra importanti regolatori della chemiotassi sono Ras GTPase, TorC2, fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), omologo della fosfatasi e tensin (PTEN) e la ciclasi di guanylyl. Meccanismi di feedback all'interno della rete di trasduzione del segnale e tra la trasduzione del segnale e reti di citoscheletro di actina ulteriormente amplificano la risposta. Infine, la rete di polarità mal definiti riceve input dal citoscheletro di actina e ulteriormente biases rete di trasduzione del segnale per promuovere la migrazione persistente nella direzione della sfumatura.

Gran parte della nostra comprensione meccanicistica della chemiotassi è stato reso possibile a causa dello sviluppo di biosensori fluorescente contrassegnati per i vari componenti delle reti di regolamentazione. Molti regolatori di chemiotassi hanno una distribuzione asimmetrica la molecola regolamentazione stessa o la sua attività. Ad esempio, biosensori che riconoscono attivato versioni di piccolo GTPases Ras e Rap1 – Ras-associazione domini di Raf1 (denominato RBD qui) e RalGDS, rispettivamente – localizzare a bordo di una cella di chemotassi2,3. Allo stesso modo, PI3K e suo prodotto fosfatidilinositolo (3, 4,5)-trifosfato (PIP3), riconosciuto da un dominio di omologia (PH) di pleckstrin, mostrano anche la localizzazione nella parte anteriore di una cella4,5. Al contrario, un 3-fosfatasi PTEN, che converte il PIP3 torna a fosfatidilinositolo (4,5)-bisphosphate, si localizza al bordo della cella6in ritardo. D'importanza, questi biosensori cambiano loro localizzazione in risposta alla stimolazione globale con un fattore chemiotattico. Marcatori di avanguardia, che sono citosolici o sulle punte delle sporgenze in una cella di riposo, rilocalizzare alla corteccia, considerando che in ritardo di marcatori di bordo, che hanno localizzazione corticale e sono assenti dalle punte delle sporgenze in una cella di riposo, diventano citosolico dopo stimolazione. Analisi della distribuzione di biosensore in risposta alla stimolazione globale con un chemoattractant riduce al minimo il contributo della motilità e della polarità, che spesso confondono le osservazioni. Stimolazione globale o uniforme di una sospensione di cellule con un chemoattractant è utilizzata anche come strumento per valutare i cambiamenti di tutta la popolazione nell'attivazione di proteine, spesso rilevato da proteina fosforilazione7,8,9 . Questa analisi biochimica viene utilizzata principalmente per ottenere informazioni temporali, mentre microscopia viene utilizzata per raccogliere informazioni spaziali e temporali sul comportamento dei vari componenti delle reti di regolamentazione.

Rete di trasduzione del segnale incorpora le caratteristiche di un sistema eccitabile10,11. Le risposte agli stimoli chemiotattici supra-soglia sono "definitiva" e visualizzare i periodi refrattari. Le risposte vengono anche attivate casualmente e possono mostrare comportamento oscillatorio. Eventi di trasduzione del segnale sono localizzati nelle regioni della corteccia che si propagano come onde12,13,14,15. Anteriore, indietro, marcatori sono reclutati per o dissociano da, zone attive delle onde moltiplicazione. A causa della regione refrattaria finali della zona attiva, le onde in modo opposto dirette annichilano come si incontrano. La moltiplicazione delle onde di trasduzione di segnale sottendono le sporgenze cellulari che mediano la cella migrazione10.

Molte delle suddette informazioni su chemiotassi è venuto dagli studi sull'ameba sociale Dictyostelium discoideum, anche se simili meccanismi regolatori sono applicabili anche ai neutrofili e altri tipi di cellule di mammifero16 . Dictyostelium è un organismo modello ben consolidata che ha una robusta risposta chemiotattica durante l'inedia, quando migliaia di singole cellule di migrazione verso un centro di aggregazione, alla fine formano un corpo fruttifero multicellulare contenente spore. La chemiotassi è essenziale anche durante la fase di crescita di singola cellula di questo organismo per l'individuazione di fonti di cibo batterica. D'importanza, la migrazione di singole cellule di Dictyostelium è notevolmente simile alla migrazione di mammiferi neutrofili o cellule tumorali metastatiche, i quali subiscono molto rapida migrazione ameboide-tipo. Infatti, entrambi la topologia globale delle reti regolamentari, così come molte delle vie di trasduzione del segnale individuali coinvolte nella chemiotassi sono conservate tra Dictyostelium e leucociti mammiferi17. Inoltre, altre cellule, come i fibroblasti, utilizzano recettori tirosin chinasici (RTK) invece di GPCR; Tuttavia, RTK può alimentano reti simili.

A differenza di chemiotassi, conoscenza approfondita dei meccanismi di segnalazione che guidano varie altre modalità di migrazione diretto è carente. Analogamente alle cellule la migrazione in una sfumatura di chemoattractant parecchi studi hanno riferito l'attivazione e/o localizzazione di marcatori tipici all'avanguardia, tra cui polimerizzazione dell'actina, PIP3 e/o chinasi segnale-regolata extracellulare (ERK) 1/2, presso il parte anteriore delle cellule che subiscono diretto migrazione in risposta a taglio di flusso o modifiche in campi elettrici18,19,20,21. Tuttavia, in questi studi l'esposizione allo stimolo ha provocato anche nella migrazione cellulare, lasciando aperta la questione se, ad esempio, i marcatori di avanguardia localizzare specificamente in risposta ad uno stimolo, o se semplicemente si localizza all'avanguardia a causa di aumento del numero di pseudopodi nella parte anteriore di una migrazione delle cellule.

Abbiamo sviluppato le analisi che ci permettono di osservare la risposta delle cellule a perturbazione meccanica acuta inviati come flusso di shear sia a livello di popolazione e come singole celle22. Simile alla stimolazione globale con un chemoattractant, stimoli acutizione con flusso di shear permette lo studio di una risposta cellulare ad uno stimolo meccanico senza il contributo di confondimento da motilità o polarità. Combinando questi saggi biochimici e microscopici con perturbazioni genetiche o farmacologiche permette di imparare a stimoli meccanici come sono percepiti e trasmessi. Inoltre, questo approccio fornisce anche un metodo novello per attingere il sistema a valle del recettore chemoattractant in assenza di un fattore chemiotattico, isolando quindi le reti di citoscheletro l'actina e la trasduzione del segnale dal recettore/G rete di proteina.

Utilizzando le tecniche descritte qui di seguito abbiamo recentemente dimostrato che acuta lo shear stress conduce all'attivazione di più componenti del segnale chemiotattico trasduzione e l'actina citoscheletrica reti22. Applicando lo stimolo meccanico acuto a intervalli variabili, abbiamo dimostrato che, analogamente ai segnalanti, risposta agli stimoli meccanici anche esibisce caratteristiche di un sistema eccitabile, incluso il comportamento definitivo della risposta sotto saturando le condizioni e la presenza di un periodo refrattario. Infine, mediante la combinazione di stimolazione meccanica e chimica abbiamo mostrato che i due stimoli condividano segnale trasduzione e actina citoscheletrica reti, che probabilmente consentono l'integrazione di molteplici stimoli per migrazione delle cellule di sbieco.

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Protocol

1. preparazione di soluzioni

  1. preparare HL-5 media utilizzando il seguente: Destrosio 10 g/L, 10 g/L proteose peptone, Estratto di lievito 5 g/L, Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 g/L KH 2 0,965 g/L PO 4 e, se non diversamente indicato, la streptomicina 0,03 g/L in acqua deionizzata. Autoclave il mezzo e conservare a temperatura ambiente.
    Nota: A causa delle differenze tra proteose peptone e lievito estratto acquisito dai fornitori differenti, nonché tra i singoli lotti, pH dei media potrebbe essere necessario regolare l'intervallo tipico di 6.4 a 6.7.
  2. Piastre SM preparare utilizzando il seguente: 10 g/L destrosio, peptone 10 g/L, 1 g/L di lievito estratto, 2,31 g/L KH 2 PO 4, 1G/L K 2 HPO 4 e agar 20 g/L in acqua deionizzata. Autoclave, raffreddare e versare 30 mL della soluzione agar a 10 cm di Petri. Una volta che l'agar solidifica, conservare le piastre a 4 ° C per 1 mese.
  3. Preparare 10 x Phosphate Buffer (PB) utilizzando 13,4 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O e 6,8 g/L KH 2 PO 4 in acqua deionizzata. Conservare lo stock di 10 x a 4 ° C. Diluire a 1x con acqua demineralizzata per uso.
  4. Preparare Buffer DB completando 1 X PB con MgSO 4 di 2 mM e 0,2 mM CaCl 2.
  5. Preparare 100 millimetri di caffeina in acqua deionizzata. Conservare a − 20 ° C.
  6. Preparare 100 mM campo stock soluzione sciogliendo accampamento sodio sale monoidrato in acqua deionizzata. Preparare un lavoro stock in acqua deionizzata di 1 mM. Conservare entrambe le soluzioni stock a − soluzione accampamento finale del 20 ° C. preparazione alla concentrazione desiderata in DB il giorno dell'esperimento.
    Nota: Soluzioni Stock è possibile congelare-sciolto un paio di volte.
  7. Preparare 25 mM acido folico in 1x PB. Aggiungere poche gocce di 1 N NaOH fino a quando la polvere si scioglie completamente. Conservare a − 20 ° C.
  8. Preparare 3 x campione tampone utilizzando il seguente: 187,5 mM Tris-HCl a pH 6.8, 6% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS), 30% glicerolo, 126 mM dithiothreitol e blu di bromofenolo 0,03% (p/v). Aliquotare e conservare a − 20 ° C.
    1. Prima di utilizzare, scongelare in bagnomaria a 37 ° C e procedere per preparare il tampone con inibitori di proteasi e fosfatasi diluendo 3 x tampone del campione a 1x e aggiungendo 50 mM NaF, 2mm Na 3 VO 4, pirofosfato di sodio di 25 mM e 1 x completa senza EDTA inibitore della proteasi cocktail in acqua deionizzata. Aggiungere gli inibitori immediatamente prima di iniziare la procedura descritta nei passaggi 3.1.2-3.1.3.
  9. Preparare 5 mM Latrunculina A soluzione in DMSO. Aliquotare e conservare a − 20 ° C.

2. Preparazione delle cellule di d. discoideum

Nota: mantenere le cellule d. discoideum HL-5 media sia in piastre di coltura tissutale o in una sospensione di cultura come descritto in precedenza 23. Quando necessario, trasformazione cellule con biosensori fluorescente etichettati secondo protocolli di elettroporazione standard 24. Vari ceppi di d. discoideum, nonché di plasmidi codificanti biosensori o altri geni di interesse possono essere reperite le Dicty Stock Center (dictybase.org).

  1. Crescita e raccolta delle cellule Vegetative d. discoideum
    1. per l'analisi di cellule vegetative, crescere le cellule in presenza di batteri per ridurre il numero di macropinosomes, che in genere sono stati osservati in le cellule coltivate axenically 25.
      1. Preparare una cultura della Klebsiella aerogenes inoculando un piccolo numero di cellule da uno stock di glicerolo o da una cultura precedente nel volume desiderato di HL-5 medium senza antibiotici. Incubare la coltura batterica su agitatore orbitale a 200 giri/min (0.42 x g) a temperatura ambiente (20-22 ° C) per 16-18 h.
        Nota: Il K. aerogenes ceppo usato qui è non patogeni (Vedi la Tabella materiali).
    2. Raccogliere d. discoideum nella fase di crescita esponenziale da piastre di coltura del tessuto o da una cultura di sospensione e contare le celle utilizzando un emocitometro secondo produttore ' s istruzioni. Spread 1 x 10 5 d. discoideum celle con sospensione di K. aerogenes 260 µ l su una piastra di SM. Girare la piastra di testa in giù il giorno successivo. Crescere le cellule a temperatura ambiente fino a quando le cellule di d. discoideum iniziano compensazione prato batterico ma prima di iniziare l'aggregazione (~ 36-48 h).
    3. Raccogliere le cellule d. discoideum nel buffer di 5ml DB da loro raschiare con una spatola di vetro. Trasferire le cellule a un tubo in polipropilene da 50 mL. Sciacquare la piastra con un altro buffer 5ml DB e la piscina con la sospensione originale. Riempire il tubo da 50 mL con tampone DB.
    4. Centrifugare la sospensione d. discoideum a 360 x g per 3-4 min. aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 50 mL di Buffer di DB. Ripetere i passaggi di lavaggio fino a quando il surnatante è chiaro (~ 3 o 4 lavaggi). Risospendere il pellet cellulare finale nel buffer DB ad una densità finale di ~ 5 x 10 6 cellule/mL.
  2. Preparazione di aggregazione-cellule competenti d. discoideum
    1. cellule di sviluppare d. discoideum da inedia 1h seguita da 4 h di inedia e una pulsazione con campo di 50 nM ogni 6 min secondo la norma protocolli 23.
    2. a seguito di sviluppo, misurare il volume finale della sospensione cellulare.
    3. Basato sul numero iniziale di celle utilizzate per lo sviluppo, calcolare la densità delle cellule della sospensione finale.
      Nota: Se cAMP è consegnato in volumi di 100 µ l di ogni 6 min, volume cellulare aumenta da 1 mL per ogni ora di accampamento pulsare. Così, per le condizioni standard di utilizzo di 8 x 10 7 cellule in 4 mL di DB, dopo 4 h di sviluppo il volume finale è 7 mL e la densità di cella finale è ~1.1 x 10 7 cellule/mL.

3. Analisi biochimiche della risposta delle cellule a meccanica o stimolazione chimica

cellule
  1. Acuta meccanica stimolazione delle cellule seguita da lisi cellulare
    1. Plate 2 x 10 6 aggregazione-competente (dal punto 2.2) dopo 4 h di sviluppo in piatti di 35mm con 2 mL DB. Permettono alle cellule di fissare per 10 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule due volte con 1 mL DB. Incubare le cellule in DB con 2,5 millimetri di caffeina per 30 min senza alcun disturbo delle piastre.
      Nota: Se le cellule hanno bisogno di essere trattati con un inibitore farmacologico, aggiungere desiderata concentrazione dell'inibitore o lo stesso volume del veicolo appropriato durante basalation con caffeina.
    2. Di applicare lo stimolo meccanico, posizionare la piastra (uno alla volta) su un agitatore orbitale e accenderlo immediatamente a 150 giri/min (0,24 x g) per 5 s.
      Nota: La piastra può anche essere manualmente stimolata dal movimento in maniera trasversali per circa 5 s.
      3. Volte
    3. aspirato buffer indicato dopo l'inizio della stimolazione. Immediatamente lisare le cellule aggiungendo 100 µ l di tampone di campione con inibitori di proteasi e fosfatasi.
    4. Collocare la piastra sul ghiaccio e raccogliere il lisato in una provetta da 1,5 mL. Per ' tempo 0 ', lisare le cellule senza agitazione. Immediatamente dopo la lisi, trasferire i tubi a un blocco di calore di 95 ° C per 10 min. Procedere con immunoblotting o memorizzare lisati a -20 ° C.
  2. Stimolazione delle cellule con un Chemoattractant
    1. Basalate cellule competenti di aggregazione dopo 4 h di sviluppo agitando rapidamente li in presenza di caffeina di 5 mM a 200 giri/min (0.42 x g) su agitatore orbitale per 30 min.
      1. Centrifuga la sospensione cellulare a 360 x g per 3-4 min. aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di Buffer DB ghiacciata. Ripetere la fase di lavaggio.
    2. Risospendere il pellet cellulare finale nel buffer di DB ghiacciata ad una densità finale di 4 x 10 7 cellule/mL sulla base del numero di cellula iniziale utilizzato per sviluppare le cellule (Vedi punto 2.2). Mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio prima stimulation.
      1. Pipetta 50 µ l di 10 µM cAMP o veicolo in una tazza di polistirolo disposto su agitatore orbitale.
    3. Per stimolare le cellule, aggiungere 450 µ l di sospensione cellulare ghiacciata nella medesima tazza e attivare immediatamente lo scuotitore a 200 giri/min (0.42 x g). In vari momenti dopo l'inizio della stimolazione (ad es. 10, 30, 45, 60, 120 s), brevemente interrompere lo shaker, estrarre 50 aliquote µ l di sospensione cellulare e lisare le cellule aggiungendoli ai tubi 1,5 mL contenente 25 µ l 3 X tampone del campione.
      1. Per ' tempo 0 ', utilizzare le celle da una sospensione cellulare ghiacciata non stimolate.
        Nota: La temperatura finale della sospensione delle cellule durante la stimolazione è ~ 9 ° C 26. In queste condizioni la risposta di picco si verifica un po' più tardi rispetto al picco osservato per stimolazione eseguita a temperatura ambiente (ad esempio chemoattractant stimolazione delle cellule aderenti sul microscopio, o stimolazione meccanica delle cellule aderenti).
    4. i tubi di trasferimento a un blocco di calore di 95 ° C per 10 min immediatamente dopo la lisi. Procedere con immunoblotting o memorizzare lisati a -20 ° C.
  3. Analisi della risposta delle cellule dall'Immunoblotting
    1. eseguire lisati (da passaggi 3.1.3 o 3.2.4) su un gel di poliacrilammide di Tris-HCl 4-15%, trasferire su una membrana di fluoruro di polivinilidene, blocco e immunoblot con phospho-PKC Ζ Thr410 (per rilevare fosfo-PKBR1 e fosfo-PKBA). Rilevare il segnale tramite incubazione con rafano perossidasi-coniugati anti-coniglio anticorpo secondario, seguita da chemiluminescenza usando il substrato di chemiluminescenza.
    2. Per il rilevamento delle proteine multiple, striscia la macchia con buffer di strippaggio e ri-sonda con un anticorpo primario contro fosfo-p42/44 MAPK Thr302/304 (per rilevare fosfo-ERK2). Confermare la proteina uguale carico macchiando la membrana di fluoruro di polivinilidene con Coomassie Brilliant Blue.

4. Acuta stimolazione meccanica e Live Imaging di singole cellule sul microscopio

  1. valutazione della risposta alla stimolazione meccanica acuta utilizzando un dispositivo di flusso
    1. raccogliere e diluire vegetativo o aggregazione-competente cellule a ~ 1 x 10 6 cellule/mL in DB come descritto ai punti 2.1 e 2.2, rispettivamente. ~ 600 µ l di carico nella diapositiva con un canale (vedere la Tabella di materiale per i dettagli). Permettono che le cellule attaccare per 10 min. Assicurarsi che tutte le insenature nella diapositiva sono completamente riempite. Rabboccare con tampone extra se necessario.
      Nota: La diapositiva particolare utilizzata per analisi ha tre ingressi, che alimentano i canali stretti, di 1 mm, ma quindi unire ad un canale di larghezza, 3 mm. L'altezza del canale è di 0,4 mm. Anche se le cellule sono placcate in tutto il canale, solo la porzione ampia è imaged.
    2. Passare una delle linee che è collegato ad un serbatoio di 50 mL attraverso la valvola di destra anteriore dell'unità fluidica (Vedi la Tabella materiali per dettagli). Utilizzando il software per la pompa, assicurarsi che la valvola è chiusa (cioè a sinistra). Riempire il serbatoio con DB.
      1. Impostare la pressione a 50 mbar e accenderlo. Riempire e sciacquare la linea con DB cliccando sulla valvola per aprirlo. Girare la pressione torna a 0 e chiudere la valvola dopo ~ 30 s.
    3. Collegare la linea di una delle tre insenature su un lato della diapositiva senza intrappolare eventuali bolle d'aria. Collegare le altre due insenature. Collegare la linea dallo scarico all'entrata del singolo sul secondo lato della diapositiva.
      Nota: Il tubo utilizzato per le linee di ingresso e scarico in questa configurazione ha un diametro interno di 1,6 mm.
    4. Mettere il vetrino sul microscopio sotto un obiettivo di aria X 20. Per sciacquare il canale, passare la valvola per aprire la riga e fare clic su " pressione ON ", a partire da una pressione più elevata (~ 50 mbar o ~ 40 dyn/cm 2) per spingere il liquido attraverso allo scarico.
      1. Una volta che il liquido esce lo scarico, ridurre la pressione esterna a zero (cioè. gravità flusso solo, ~ 15 dyn/cm 2) e continuare a sciacquare per ~ 30 s. interruttore della valvola nella posizione opposta per fermare il flusso.
    5. Acquisire immagini con illuminazione RFP o GFP su un microscopio a fluorescenza invertito sotto un 40 X obiettivo olio a intervalli di 3 s. Con la valvola in posizione chiusa, accendere la pressione alla pressione desiderata, in genere tra 15 e 40 dyn/cm 2 (0 - 50 mbar).
    6. Dopo l'acquisizione di 5 fotogrammi, fornire lo stimolo di commutazione della valvola per il " aprire " posizione. Spegnere il flusso dopo 2-5 s di commutazione della valvola nella direzione opposta.
      Nota: Per alcuni biosensori più debole (ad es. PTEN, CynA e RalGDS) potrebbe essere necessario a celle di immagine utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con un 40 X obiettivo olio.
  2. Effetti di Testing di inibitori farmacologici sulla risposta alla stimolazione meccanica acuta utilizzando un dispositivo di flusso
    1. piatto di cellule nella diapositiva con un canale come descritto al punto 4.1.1. Impostare due righe: passare una linea attraverso la valvola di destra anteriore come descritto al punto 4.1.2, e la seconda attraverso la parte posteriore sinistra valvola. Bloccare la linea di sinistra e la valvola il " chiuso " posizione (sinistra). Riempire una riga con DB contenente il veicolo appropriato e la seconda con la soluzione contenente un inibitore farmacologico di interesse (ad es. 5 µM Latrunculina A).
      Nota: È necessario bloccare fisicamente la linea di sinistra perché il " chiuso " posizione sinistra apre la valvola per tale riga.
    2. Riempimento e sciacquare il diritto linea attivando la pressione a 50 mbar e la valvola di commutazione il " aprire " posizione (a destra). Commutare la valvola a sinistra dopo circa 30 s. riempimento e sciacquare la linea sinistra rimuovendo il morsetto per ~ 30 s. Connect entrambe le linee a due delle insenature su un lato della diapositiva con un canale, collegare l'ingresso rimanente e collegare lo scarico all'entrata del singolo sul secondo lato. < / l Ho >
    3. lavare il vetrino con il buffer in linea giusta ed eseguire la stimolazione nello stesso buffer come descritto ai punti 4.1.3 e 4.1.4 sopra.
      Nota: Anche se la linea giusta è stato scelto come il primo in questa configurazione, l'ordine potrebbe essere invertito.
    4. Seguito a stimolazione, commutare la valvola per aprire la linea giusta a pressione zero (cioè flusso di gravità solo, ~ 15 dyn/cm 2). Rimuovere il morsetto dalla linea a sinistra e passare la valvola a sinistra per aprire quella linea. Bloccare la prima riga.
    5. Dopo l'esecuzione di 3-5 mL di tampone con inibitore attraverso, passare la valvola a destra per interrompere il flusso e incubare le cellule con l'inibitore per la durata richiesta di tempo (ad es. 15 min). Attivare il flusso di commutazione della valvola ogni ~ 10 min per ~ 15 s per evitare la privazione dell'ossigeno. Ripetere la stimolazione con la seconda riga.
  3. Metodo alternativo per valutare la risposta alla stimolazione meccanica acuta utilizzando una micropipetta
    1. impostare la micropipetta riempita con DB secondo protocollo standard 23. Mantenere la pressione di compensazione a 1.500 psi.
    2. Raccogliere e diluire le cellule vegetative come descritto al punto 2.1. Gocce di posto 25 µ l di ~7.5 x 10 5 cellule/mL in una camera a 1-pozzetto, permettono di rispettare per almeno 10 min e coprire con 3ml DB.
    3. Posizionare la camera di un microscopio di fluorescenza invertito equipaggiata con un obiettivo di olio X 40. Individuare le celle. Abbassare delicatamente la micropipetta nel bel mezzo del campo visivo fino a prima toccare il fondo della camera.
      Nota: Poiché la pressione di compensazione è stata fissata a 1.500 Psi, le cellule saranno continuamente esposti ad un flusso molto lento di DB dalla micropipetta.
    4. Iniziare l'acquisizione di immagini con illuminazione RFP o GFP a 3 intervalli di s. Applicare il ' pulite ' funzione per rilasciare un bolo di liquido dalla micropipetta. Continuare io di imagingla presenza di flusso dovuto pressione di compensazione solo n.
  4. Un metodo alternativo per valutare la risposta alla stimolazione meccanica acuta utilizzando bulk buffer aggiunta
    1. raccogliere e diluire le cellule vegetative come descritto al punto 2.1. Posto 20 µ l gocce di cellule a ~ 1 x 10 6 cellule/mL in DB al centro un pozzo da un alloggiamento di 8 pozzetti. Consentire alle cellule di aderire per almeno 10 min.
    2. Iniziare l'acquisizione di immagini con illuminazione RFP - o GFP-specifico su un microscopio di fluorescenza invertito dotato di un obiettivo 40x a 3 intervalli di s. Concentrarsi su un'area vicino al bordo della goccia.
    3. Rapidamente µ l 430 di DB su un lato del pozzo. Continuare la formazione immagine.
    4. Per l'analisi dell'interazione tra stimoli meccanici e chimici, 12 o 45 s segue lo stimolo meccanico, delicatamente aggiungere 50 µ l di acido folico (concentrazione finale 20 nM) o veicolo (DB) senza indurre una risposta meccanica. Continuare la formazione immagine.
  5. Quantificazione della risposta
    1. aprire il file TIFF a 32-bit del software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali particolari) 27.
    2. Sotto il ' Analyze ' scheda, vanno a " impostare misure ". Selezionare la casella per ' dire valore grigio '. Assicurarsi che le altre caselle non vengono controllate. Fare clic su " OK ".
    3. Sotto la ' processo ', fare clic " sottrarre sfondo ". Mantenere il raggio di rotolamento sfere a 50 pixel e fare non controllo le opzioni elencate nel menu. Zoomare su una cella utilizzando il ' lente di ingrandimento ' strumento.
    4. Usando il ' rettangolo ' strumento, disegnare una casella (~2.5 x 2,5 µm 2) nel citosol, assicurandosi che non disegnare sopra il nucleo o la membrana plasmatica. Premere " Ctrl " + " M " tasti o andare alla ' Analyze ' scheda e fare clic su " misura " per determinare il valore di grigio medio della scatola. Anticipo per i fotogrammi successivi e misura ancora una volta, assicurandosi che la casella rimane nel citosol.
      Nota: Poiché le cellule d. discoideum si muovono molto rapidamente la casella può essere spostata da un fotogramma a quello successivo di tenerlo nel citosol.
    5. Dopo tutto dei telai sono state analizzate, copiare i valori in un foglio di calcolo. Per tenere conto cellula--cellula variazione nei livelli di espressione di diversi biosensori, normalizzare i valori per il valore di grigio medio osservato al tempo 0. Calcolare il reciproco dei valori in modo da riflettere l'accumulo del segnale sulla corteccia.

5. Continuo stimolo meccanico e Live Imaging di singole cellule sul microscopio

  1. impostare le celle esattamente come descritto sopra per l'analisi di stimolazione meccanica acuta nei passaggi 4.1.1 - 4.1.3. Aprire il tappo che copre il serbatoio con il buffer, quindi il volume può essere superato se la risposta è analizzato per più di pochi minuti alla volta.
    Nota: Poiché il serbatoio rimane aperto per tutta la durata dell'esperimento, questa analisi è condotta in assenza di pressione esterna e si basa sul flusso di gravità da solo. Per aumentare il tasso di flusso per gravità, lo scarico può essere collocato su un tavolo sotto il microscopio.
  2. Iniziare le cellule con illuminazione RFP - o GFP-specifico su un microscopio di fluorescenza invertito dotato di un obiettivo 40x a 3 intervalli di s per l'analisi delle risposte di biosensore di imaging. In alternativa, l'immagine con contrasto di fase utilizzando un obiettivo X 20 a intervalli di 10 s per l'analisi di migrazione globale cellulare.
  3. Accendere il flusso dopo diversi frame con l'impostazione di pressione zero (ovvero flusso è dovuto gravità da solo o ~ 15 dyn/cm 2) commutando la valvola nella posizione di apertura. Quando il livello del liquido scende a 5-10 mL nel serbatoio, rabboccare con buffer di più. Assicurarsi di aggiungere il liquido attentamente così bolle d'aria non rimanere intrappolate nelle linee.
    Nota: È importante aggiungere liquido alla stessa temperatura per evitare una risposta allo shock nelle cellule.
  4. Quantificare la velocità di cella e persistenza utilizzando software di analisi di migrazione (Vedi la Tabella materiali particolari) secondo produttore ' istruzioni s.

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Representative Results

Risposta temporale dei regolatori di chemiotassi alla stimolazione meccanica acuta

Per valutare la risposta delle cellule di d. discoideum a stimolo meccanico, le cellule aderenti di aggregazione-competenti sono stati esposti a un breve impulso di flusso di shear. Aggregazione-competenti D. discoideum cellule secernono cAMP, che può essere percepita dai cellule vicine. Per superare il contributo di segnalazione della cellula-cellula, le cellule sono state trattate con caffeina, che inibisce l'adenilato ciclasi d. discoideum e quindi impedisce la secrezione campo28. Infatti, le cellule pretrattate con caffeina era molto bassa attività basale di PKBR1 ed ERK2 e ha mostrato un robusto incremento nella fosforilazione dei residui chiave di queste chinasi dopo 5 s stimolazione con flusso di shear (Figura 1A). La risposta era transitoria e ha alzato intorno a 10-15 s per PKBR1 e circa 30 s per ERK2, similmente in precedenza pubblicato i risultati per l'attivazione di queste proteine con un chemoattractant7.

Anche se è difficile valutare l'efficienza della risposta considerando il basso livello basale, studi preliminari che hanno portato allo sviluppo di questo test, rispetto da soli (o con un veicolo) a stimolazione con flusso di shear shear flusso in presenza di un chemoattractant cAMP (Figura 1B). Questa analisi non ha mostrato un aumento nella risposta con il campo, suggerendo che la risposta della rete di trasduzione del segnale per la tosatura del flusso è saturo. Anche se in questo test cAMP non ha aumentato la fosforilazione di PKBR1, risposta delle cellule a chemoattractant può essere osservato mediante un protocollo di stimolazione standard dove le cellule aggregazione-competenti sono tenute in sospensione, stimolate con cAMP e lisate in vari punti di tempo dopo stimolazione. Come illustrato nella Figura 1, in queste condizioni c'è un aumento transitorio nella fosforilazione di PKBR1 in risposta a chemoattractant, ma non il veicolo. La risposta di picco si osserva a 30 s in questo test perché la temperatura della sospensione delle cellule durante il dosaggio è ~ 9 ° C, rispetto a ~ 22 ° C per l'analisi di stimolazione meccanica descritto sopra26.

Risposta spatiotemporal del leader e in ritardo di marcatori di bordo alla stimolazione meccanica acuta

Poiché il dosaggio della popolazione sopra fornisce solo informazioni temporali sul comportamento dei regolatori di chemiotassi, cellule inoltre sono state esposte ad un breve stimolo meccanico mentre essere osservata con un microscopio. Questa analisi può essere eseguita sia con aggregazione-competenti o vegetativo d. discoideum cellule che esprimono diversi biosensori con etichetta fluorescente cui localizzazione è stata definita in cellule stimolate con un fattore chemiotattico. Due indicatori di avanguardia, dominio di PH di Crac e calceΔcoil, che sono stati reclutati dalla PIP3 o appena polimerizzati actina, entrambi hanno mostrato principalmente citosolico localizzazione nelle cellule a riposo come precedentemente riportato (Figura 2A, supplementare Movie 1 )4,29. In cellule che erano basalmente attive, questi biosensori potrebbero essere visto anche sulle punte di pseudopodi. Seguito alla stimolazione con flusso di shear per 2 s, i biosensori rapidamente glocalizzati alla corteccia con un picco a ~ 6 a 10 s e restituito al cytosol da ~ 30 s. Al contrario, un indicatore di bordo in ritardo PTEN localizzato presso la corteccia prima di stimolazione (Figura 2A). Dopo un breve impulso con flusso di shear, citosolica PTEN intensità aumentata, seppur con dinamiche più lento rispetto per i biosensori di avanguardia. Un cambiamento nella localizzazione di biosensore dal citosol alla corteccia e viceversa, si vede chiaramente come un cambiamento nell'intensità citosolico permettendo per semplice quantificazione della risposta.

Il comportamento osservato di biosensori in risposta alla stimolazione meccanica acuta è coerenza con i principali e in ritardo di sviluppo bordo localizzazione dinamica in risposta alla stimolazione con chemoattractant uniforme. Questo comportamento non è univoco per i tre biosensori mostrati. Come precedentemente pubblicati, simili cambiamenti nella localizzazione inoltre sono stati osservati per gli indicatori di avanguardia RBD e RalGDS, che riconoscono attivato Ras e Rap1, rispettivamente, come pure per quanto riguarda un altro marcatore di bordo in ritardo CynA22,30.

Un dosaggio simile può essere utilizzato per valutare gli effetti di vari inibitori da una semplice modifica del setup sperimentale da una singola riga di input a una doppia. Utilizzando questo metodo, le cellule possono essere in primo luogo esposto a condizioni di controllo e quindi passa al buffer che contiene l'agente di test desiderato. Ad esempio, aggiunta di droga actina-destrin LatA bloccato la risposta di RBD, nonché calceΔcoil, alla stimolazione meccanica acuta (Figura 2B).

Risposta globale precede migrazione cellulare sotto stimolazione prolungata con flusso di shear

L'approccio descritto qui potrebbe anche essere adattato per studiare gli effetti del flusso di shear sulla migrazione di d. discoideum . Infatti, se il flusso non è stato interrotto dopo 2 s ma è rimasto per tutta la durata dell'esperimento, cellule vegetative ha mostrato diretto migrazione contro il flusso (Figura 3supplementare Movie 2). Si noti che il flusso di shear necessario per suscitare una risposta migratoria era inferiore alla pressione che veniva in genere utilizzata per ottenere una risposta globale con stimolazione acuta a cellule vegetative (ad esempio, come si vede in Figura 2B). Tuttavia, anche a bassa pressione, cellule visualizzato una risposta uniforme robusta, come misurato da un cambiamento nella localizzazione diΔcoil di calce, che ha preceduto qualsiasi cambiamento nella posizione della cella stessa. Così, questi esperimenti hanno mostrato chiaramente che 1) la risposta globale non dipendono dal movimento della cellula, e 2) la risposta globale precede migrazione diretto.

Approcci alternativi di test risposta alla stimolazione meccanica acuta

Anche se l'uso di una camera a flusso continuo presenta chiari vantaggi per lo studio della risposta alla stimolazione meccanica acuta, abbiamo validato anche due ulteriori analisi per testare la risposta delle cellule individuali alla stimolazione meccanica acuta. Come illustrato nella Figura 4, calceΔcoil rapidamente e transitoriamente ri-localizzato dal citosol alla corteccia quando le cellule sono state stimolate da aggiunta di bolo del buffer consegnato mediante una micropipetta (Figura 4A) o manualmente utilizzando bulk Aggiunta di tampone con una pipetta (Figura 4B). Si deve osservare che un chiaro svantaggio di entrambi di queste analisi è che l'esatta quantità di forza di taglio consegnato alla cella è sconosciuta e non possono essere facilmente modificate. Tuttavia, per le situazioni dove è richiesto il passaggio tra stimoli meccanici e chimici, alla rinfusa buffer aggiunta offre un'alternativa solida alla stimolazione nel dispositivo di flusso.

Figure 1

Figura 1: rappresentante risultati per valutazione biochimica della risposta delle cellule di d. discoideum alla stimolazione meccanica o chimica acuta. Aggregazione-competente cellule sono state esposte a stimoli meccanici o chimici, lisate presso i punti di tempo indicato, e immunoblotted usando gli anticorpi che riconoscono fosforilato PKBR1 o ERK2. (A) le cellule aderenti sono state stimolate in un agitatore orbitale per 5 s. La membrana è stata macchiata con Coomassie Brilliant Blue (CBB) per mostrare la proteina uguale carico. (B) le cellule aderenti sono state stimolate dal movimento manuale della piastra in modo trasversali per circa 5 seguenti s stimolazione chimica a causa dell'aggiunta di cAMP 1 µM o buffer (veicolo), o senza alcuna stimolazione chimica (-). I due immunoblots mostrano l'entità della variazione nell'attivazione basale di PKBR1 visualizzata al tempo 0. Occasionalmente, l'attivazione di PKBA anche potrebbe essere rilevato da questa tecnica, come mostrato nel pannello inferiore. (C) sospensione le cellule sono state stimolate con cAMP 1 µM o buffer (veicolo). Parte (A) di questa figura è stato modificato da Artemenko et al. (2016) 22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: rappresentante risultati per stimolazione meccanica acuta e formazione immagine diretta di singole cellule sul microscopio. (A) aggregazione-competenti d. discoideum cellule esprimenti calce RFP-etichettaΔcoil, o GFP-etichettato PH-Crac o PTEN sono state stimolate con flusso unidirezionale a 15 dyn/cm2 per 2 a 5 immagini s. sono stati raccolti ogni 3 s . Sono mostrate rappresentante cellule che mostrano traslocazione dei biosensori in risposta alla stimolazione meccanica. Accumulo di ogni biosensore alla corteccia è stato quantificato come l'inverso dell'intensità media citoplasmico normalizzato per tempo 0. La risposta media del 18 (calceΔcoil), 20 (PH-Crac) o 6 celle (PTEN) è mostrata. I valori sono media ± SE. (B) cellule Vegetative che esprimono RFP-etichetta calceΔcoil- RFP e GFP-etichettato RBD sono stati trattati con veicolo o 5 µM LatA per almeno 15 minuti e quindi stimolate con flusso unidirezionale a 41 dyn/cm2 per 2 s. le immagini sono stati raccolti ogni 3 s. RBD-GFP e accumulo di calceΔcoil- RFP alla corteccia è stato quantificato come in (A). I valori sono media ± SE. Il numero delle cellule analizzate è indicato accanto a ciascuna condizione. Barra della scala = 10 µm. Questa figura è stata modificata da Artemenko et al. (2016) 22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rappresentante risultati per la risposta delle cellule di d. discoideum alla stimolazione prolungata con flusso. (A) cellule Vegetative che esprimono RFP-etichetta calceΔcoil sono stati esposti a flusso laminare unidirezionale continuo a 15 dyn/cm2 ed imaged ogni 3 s. tracce di 11 celle sono mostrate in (B). Barra della scala = 10 µm. Questa figura è stata modificata da Artemenko et al. (2016) 22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: rappresentante risultati per approcci alternativi ai test risposta alla stimolazione meccanica acuta. (A) vegetativo d. discoideum cellule esprimenti calce RFP-etichettaΔcoil sono stati esposti a una micropipetta (*) rilasciando basalmente tampone del saggio ad un ritmo lento. Un breve aumento nel tasso di flusso è stata raggiunta una consegna rapida di un bolo di tampone del saggio al tempo 0. Immagini sono state raccolte ogni 3 cellule del vegetativo discoideum d. s. (B) che esprimono RFP-etichetta calceΔcoil placcato come una piccola goccia in un aula di microscopia sono state stimolate meccanicamente tramite l'aggiunta di un grande volume di buffer per il camera. Immagini sono state raccolte ogni 3 s. scala bar = 10 µm. parte (A) di questa figura è stato modificato da Artemenko et al. (2016) 22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplemental Movie 1: Stimolazione meccanica acuta innesca traslocazione rapida e transitoria di calceΔcoil- RFP o PH-Crac-GFP dal citosol alla corteccia di aggregazione-competenti d. discoideum cellule che esprimono questi biosensori. Flusso unidirezionale è stato acceso per 5 s al tempo 0 e le cellule erano imaged a 3 intervalli di s. La velocità di riproduzione è 5 fotogrammi/s. Sono riportati due esempi per ogni linea cellulare. Barra della scala = 10 µm. Questo film corrisponde alla Figura 2A ed è stato modificato da Artemenko et al. (2016) 22. per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplemental Movie 2: Continuo stimolo meccanico innesca traslocazione rapida e transitoria di calceΔcoil- RFP dal citosol alla corteccia prima della migrazione delle cellule contro la direzione del flusso. Cellule vegetative esprimendo la calceΔcoil- RFP sono stati esposti alla sollecitazione di taglio continuo alle 15 dyn/cm2 a partire dal tempo 0 e ripreso a 3 intervalli di s. La velocità di riproduzione è 10 fotogrammi/s. scala bar = 10 µm. Questo film corrisponde alla Figura 3 e precedentemente è stato pubblicato in Artemenko et al. (2016) 22. per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

I metodi descritti qui offrono un modo pratico per valutare la popolazione e comportamento delle singole celle in risposta a di taglio di flusso. D'importanza, mentre gli studi precedenti analizzati localizzazione dei principali e in ritardo di marcatori di bordo durante la migrazione, l'attuale approccio permette di indagine degli effetti immediati applicando il flusso di shear acutamente. Usando questo metodo abbiamo dimostrato che, in realtà, la risposta iniziale delle cellule per la tosatura del flusso non richiede migrazione cellulare. Invece, la risposta rapida e transitoria per lo stimolo del flusso di taglio iniziale precede la migrazione direzionale vista con l'esposizione prolungata a taglio di flusso, allo stesso modo la risposta globale iniziale vista con una sfumatura di chemoattractant.

Gli approcci biochimici e microscopici di ottenere dati complementari anche se ciascun metodo ha vantaggi e svantaggi. Stimolazione seguita da lisi cellulare e immunoblotting di bcp, KrsB ed ERK, ad esempio, analizza un'intera popolazione di cellule e così in media variazione di cellula--cellula, a differenza di un saggio che esamina il comportamento delle singole celle. Tuttavia, saggi basati sulla popolazione tendono a sottili cambiamenti maschera nel comportamento delle cellule che possono essere osservati facilmente analizzando le singole celle. Inoltre, l'analisi biochimica descritto qui è solo efficace con cellule aggregazione-competenti, per motivi che saranno discussi in seguito. Al contrario, il dosaggio di base di microscopia di rilocalizzazione di RBD, RalGDS, PH-Crac, calceΔcoile PTEN, ad esempio, tra la corteccia e il citosol è efficace per sia cellule vegetative di aggregazione-competente e così permette osservazioni che sono ampiamente applicabili alle cellule con vari gradi di polarizzazione. Ciò che rende i due approcci complementari è il fatto che esaminano diversi insiemi di indicatori disponibili leader/rivestimento isolante bordo, ampliando così la copertura del segnale trasduzione e actina citoscheletrica reti testati con il test del flusso di shear.

Rimane poco chiaro perchè cellule vegetative, che rispondono molto robusto in saggi basati su microscopia, non rispondono alla stimolazione seguita da immunoblotting e lisi cellulare. Una possibilità è che la quantità di forza di taglio applicata alle cellule quando la piastra è ruotata non corrisponde la forza sperimentata da parte delle cellule in una camera di flusso. Cellule sviluppate, al contrario, potrebbero avere una soglia più bassa per l'attivazione e, così, rispondere sotto una delle due condizioni. È improbabile che i biosensori in cui l'attività viene misurata dall'analisi biochimica non sono espressi o non sono attivati in cellule vegetative, poiché la stimolazione di cellule vegetative con acido folico conduce all'attivazione robusto di PKBR1/PKBA e di ERK2 (dati non mostrato). Inoltre, cellule vegetative mostrano chiara assunzione di PH-Crac, che riflette l'accumulo di PIP3, nell'analisi della base di microscopia. Poiché il reclutamento PKBA dipende anche PIP3, sembra improbabile che PKBA non risponderebbe alla stimolazione meccanica acuta, a meno che le condizioni nel test biochimici non sono ottimale, come accennato in precedenza. Questo rimane un'area di ricerca attiva.

L'analisi biochimica dei regolatori di chemiotassi necessaria la presenza di caffeina in tutto l'esperimento. Originariamente la caffeina è stato aggiunto per impedire la segnalazione della cellula per cellula dovuto la secrezione di cAMP. Tuttavia, sembra che la caffeina ha un altro ruolo oltre ad inibizione dell'adenilato ciclasi (ACA) poiché le cellule ACA-null ancora richieste caffeina per la fosforilazione di PKBR1 in risposta alla stimolazione meccanica acuta. In precedenza, la caffeina ha dimostrato di bloccare TorC2 attività26. È possibile che l'inibizione di TorC2 bloccato alcuni motilità basale delle cellule e così abbassato l'attivazione basale di PKBR1 e altri componenti di reti di citoscheletro l'actina e la trasduzione del segnale. Bassa attività basale era imperativo per osservare la risposta al flusso di taglio. Infatti, quando le cellule sono state raccolte ai precedenti punti di tempo durante lo sviluppo, hanno visualizzato l'attività basale aumentata e una risposta ridotta shear-flusso indotto. È interessante notare che, è noto che cellule vegetative hanno proporzionalmente più PKBA attività e meno PKBR1 rispetto al sviluppato cellule31. È possibile che lo stato basale è regolamentato in modo un po' diverso in cellule vegetative e aggregazione-competenti, contribuendo ulteriormente alla mancanza di una risposta delle cellule vegetative nell'analisi biochimica. Curiosamente, quando le cellule sono state raccolte nei punti successivi di sviluppo, avevano anche una ridotta risposta, probabilmente a causa della forte influenza di polarità sulla localizzazione e l'attivazione di vari regolatori di chemiotassi esaminati in questo test.

Stimolazione delle cellule in una camera di microscopia ha rivelato che sia la forza e la durata dello stimolo contribuire alla risposta massima22. In altre parole, una risposta massima può essere raggiunto anche con una forza di taglio basso se viene applicato per un periodo di tempo prolungato (10 s rispetto a 2 s). Questa osservazione spiega perché le cellule hanno una risposta globale iniziale quando in primo luogo sono esposti ad uno stimolo continuo, ma debole, che conduce alla migrazione indotta da flusso di taglio. Con l'apparato attuale, siamo stati in grado di generare flussi di taglio abbastanza basso per indagare l'estremità inferiore della gamma.

Forse, l'implicazione più importante degli studi condotti mediante stimolazione meccanica acuta è che stimoli sia meccanici che chimici sembrano alimentano comune trasduzione del segnale e reti del citoscheletro di actina. Anche se abbiamo mostrato che i due stimoli integrano utilizzando bulk buffer aggiunta per la stimolazione meccanica, gli studi futuri avrà lo scopo di sviluppare un sistema dove chemoattractant può essere trasportato rapidamente in flusso continuo canale, che sarebbe stato un molto più versatile e potente modo per valutare l'integrazione di stimoli meccanici e chimici. Purtroppo, chemoattractant addizioni utilizzando l'installazione di due-linea corrente sono associato un secondo stimolo di flusso di shear perché il chemoattractant deve essere consegnato in presenza di flusso. Una valida alternativa può essere laser-ha stimolato il rilascio di un fattore chemiotattico da un precursore in gabbia, come ha dimostrato con successo per il cAMP Westendorf et al. 32. in futuro, sarebbe anche interessante esaminare l'integrazione di altri stimoli, ad esempio, flusso e campi elettrici variabili di taglio o shear flusso e rigidità variabile substrato. Nell'esempio di quest'ultimo è interessante perché si tratta di due tipi di stimolazione meccanica, anche se la ricezione del segnale iniziale potrebbe differire tra loro. Conferma che tutti gli stimoli che inducono la migrazione diretto condividono la stessa rete di trasduzione di segnale e variano solo in quanto lo stimolo è percepito spiegherà come cellule potranno spostarsi in ambienti complessi. Infine, abbiamo già dimostrato che la stimolazione acuta con flusso di shear conduce alla diffusione di cellule umane del neutrofilo-come22. Lavoro futuro esaminerà ulteriormente la localizzazione e l'attivazione di vari componenti delle reti segnale trasduzione e l'actina citoscheletrica con stimoli meccanici in cellule di mammifero.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzione di salute R35 GM118177 a PND.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dextrose Fisher D16-1 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone Fisher DF0120-17-6 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract Fisher 50-550-445 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O Fisher S373-500 Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4 Fisher P386-500 Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) Fisher ICN10040525 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto) Fisher DF0118-17-0 Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4 Fisher P288-100 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar Fisher BP1423-500 Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4 Fisher M65-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2 Fisher C79-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine Fisher O1728-500 Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) Fisher 11-680-1100MG Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid Sigma F7876 Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base Fisher BP152-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol Fisher G33-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 1610610 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF Fisher S299-100 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4 Fisher 50-994-911 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate Fisher S390-500 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) Sigma 11873580001 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A Enzo Life Sciences BML-T119-0100 Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel Bio-Rad 3450029 Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane Bio-Rad 1620177 Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody Cell Signaling 2060 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody Cell Signaling 4370 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) GE Healthcare NA934-100UL Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) Bio-Rad 1705060 Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) Pierce PI46430 Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue Fisher PI20278 Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic) Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name Company Catalog Number Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) New Brunswick Scientific Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish Fisher FB0875712 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer Fisher 02-671-51B Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) Fisher 08-772A Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL) VWR 13915-985 Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) Ibidi 10902 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) Ibidi 80316 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) Ibidi 10978 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) Ibidi 10964 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) Ibidi 10842 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) Zeiss Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) Perkin-Elmer DM 16000 An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan Eppendorf 5252000021D and 5192000027 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) Eppendorf 930000035 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) Eppendorf 5242956.003 Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) Fisher 12-565-472 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) Fisher 12-565-338 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji) NIH https://fiji.sc/ Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) Gradientech http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia cellulare numero 129 trasduzione del segnale meccanotrasduzione shear stress chemiotassi rheotaxis migrazione indotta da flusso di shear migrazione diretto localizzazione biosensore stimolazione acuta
Valutazione della risposta di <em>Dictyostelium discoideum</em> alla stimolazione meccanica acuta
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Artemenko, Y., Devreotes, P. N.… More

Artemenko, Y., Devreotes, P. N. Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation. J. Vis. Exp. (129), e56411, doi:10.3791/56411 (2017).

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