Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56411
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

Abstract

כימוטקסיס, או העברה את הדרגה של chemoattractant, הוא מצב הבין בצורה הטובה ביותר של ההעברה מכוונת. מחקרים באמצעות אמבה חברתית Dictyostelium discoideum גילה כי מורכבות האות התמרה חושית רשת של מסלולים מקבילים מגביר את התגובה chemoattractants, מוביל פלמור אקטין משוחד בליטה של פסאודופוד ב הכיוון של מעבר צבע. לעומת זאת, המנגנונים המולקולריים נהיגה סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, לדוגמה, עקב חשיפה להטיית זרימה או שדות חשמליים, לא ידועים. הרגולטורים רבים כימוטקסיס התערוכה לוקליזציה המובילים או לקרטע קצה תא נודדים, כמו גם להציג שינויים חולף לוקליזציה או הפעלת בעקבות גירוי גלובלית עם chemoattractant. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של סוגים אחרים של ההעברה מכוונת פיתחנו שיטה המאפשרת בחינת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני המבוסס על חשיפה קצר (2-5 s) להטיית זרימה. יכול להיות מועברת לגירוי הזה בערוץ תוך הדמיה תאים המבטאים שכותרתו fluorescently ביולוגיים לבחון התנהגות תא בודד. בנוסף, האוכלוסייה התא יכול להיות מגורה צלחת, lysed, ו immunoblotted באמצעות נוגדנים לזהות גירסאות פעיל של חלבונים עניין. על ידי שילוב שני מבחני, ניתן לבחון מגוון רחב של מולקולות מופעל על ידי שינויים לוקליזציה subcellular ו/או זירחון. בשיטה זו אנו נקבע כי גירוי מכני חריפה מפעיל הפעלה של התמרה חושית האות chemotactic ורשתות שלד התא אקטין. היכולת לבחון תגובות תאית חריפה גירוי מכני חשוב להבנת האירועים ייזום הכרחי עבור גזירה זרימה-induced תנועתיות. גישה זו מספקת גם כלי לימוד chemotactic האות התמרה חושית הרשת ללא השפעת מבלבלים הקולטן chemoattractant.

Introduction

ההעברה של התאים האיקריוטים מוטה על ידי רמזים כימיים מגוונים בסביבה, לרבות מעברי צבע של chemoattractants מסיסים או מאוגד המצע, נוקשות משתנה של מצעים, שדות חשמליים או הטיה זרימה. אמנם היו הרבה התקדמות בהבנתנו המנגנונים המולקולריים נהיגה כימוטקסיס, פחות ידוע על סוגים אחרים של ההעברה מכוונת, כמה אותות אלה מגוונים משולבים ברמה התאית לייצר מאוחדת נודדות תגובה.

ביים ההעברה לכיוון הגדלת ריכוז chemoattractant כוללת שלושה מרכיבים התנהגותיים: תנועתיות כיוונית חישה, קטביות1. תנועתיות מתייחס לתנועה אקראית של תאים מושגת על ידי בליטה pseudopod. כיוונים חישה היא היכולת של תא כדי לזהות את מקור chemoattractant, אשר יכול להתרחש אפילו באופן מתאושש תאים. קוטביות מתייחס ההתפלגות סימטרית יציבה יותר של רכיבים תאיים בין המוביל לבין לקרטע קצה תא, מה שמוביל התמדה מוגברת בתנועה.

תגובה תאית chemoattractant תלוי הפעילות של ארבע רשתות בקרה רגולטריות שהוגדר מושגית: קולטן / גרם חלבון, אותות, שלד התא אקטין, קוטביות1. Chemoattractant מחייב לקולטן G-חלבון בשילוב משדר את האות דרך heterotrimeric גרם חלבונים α וβγ לרשת התמרה חושית האות במורד הזרם, אשר מגביר את האות כיוונית. משעולים מרובות בתוך הרשת התמרה חושית אות לפעול במקביל, להאכיל לתוך הרשת שלד התא אקטין פלמור אקטין הסטייה ולאחר חדירת pseudopod הסוגר, בכיוון של מעבר הצבע. חשוב סמביוזה כימוטקסיס נמנים GTPase בראס, TorC2, phosphoinositide 3-קינאז (PI3K) homolog פוספטאז ו- tensin (PTEN), guanylyl cyclase. מנגנוני משוב בתוך הרשת התמרה חושית אות ובין אותות לבין אקטין שלד התא רשתות נוספות להגביר את התגובה. בסופו של דבר, הרשת קוטביות מוגדרת היטב מקבל קלט שלד התא אקטין, בהמשך biases האות התמרה חושית הרשת כדי לקדם את ההעברה מתמיד בכיוון של מעבר הצבע.

הרבה הבנתנו מכניסטית כימוטקסיס התאפשרה בשל התפתחות מתויג fluorescently ביולוגיים עבור רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות. הרגולטורים כימוטקסיס רבים יש של התפלגות סימטרית של המולקולה הרגולציה עצמה או הפעילות שלה. לדוגמה, ביולוגיים מזהה הופעלה גרסאות GTPases ראס קטן ולא Rap1 – ראס מחייב תחומים של Raf1 (המכונה "rbd" כאן), RalGDS, בהתאמה – בתרגום כדי בחוד החנית של2,תא chemotaxing3. באופן דומה, PI3K ו phosphatidylinositol המוצר שלה (3,4,5)-טריפוספט (PIP3), המוכר על ידי תחום הומולוגיה (PH) pleckstrin, גם להראות לוקליזציה בחזית תא4,5. לעומת זאת, PTEN 3-פוספטאז, אשר ממירה PIP3 בחזרה אל phosphatidylinositol (4.5)-bisphosphate, רגישה לקצה לקרטע תא6. חשוב, ביולוגיים אלה לשנות שלהם לוקליזציה בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant. הקצה המוביל סמנים, אשר cytosolic או על קצות בליטות בתא resting, relocalize אל קליפת המוח, ואילו מפגרות סמני קצה, אשר לוקליזציה קורטיקלית נעדרים מכל קצות בליטות בתא resting, הופכים cytosolic לאחר גירוי. ניתוח של התפלגות ביוסנסור בתגובה גירוי גלובלית עם chemoattractant ממזער את התרומה של תנועתיות, קוטביות, אשר פעמים רבות וחיסול התצפיות. גירוי גלובלי או אחיד של השעיה תא עם chemoattractant משמש גם ככלי להערכת שינויים ברמת האוכלוסייה בהפעלת חלבון, לעיתים קרובות זוהה על ידי חלבון זרחון7,8,9 . Assay הביוכימי זה משמש בעיקר כדי להשיג מידע זמני, ואילו מיקרוסקופ משמש לאיסוף מידע זמני והן מרחבי על התנהגותם של רכיבים שונים של רשתות רגולטוריות.

התמרה חושית אות הרשת משלבת תכונות של מערכת טמפרמנט10,11. תגובות לגירויים chemotactic העל-סף "all-or-none", להציג תקופות עקשן. תגובות מופעלות גם stochastically, יכול להראות התנהגות מתנדנדות. האות התמרה חושית אירועים הם נקודתיים לאזורים של קליפת המופצות גלים12,13,14,15. קדימה או אחורה, סמני את הנישה, או מביצועם מתוך, האזורים הפעילים של הגלים כציוד. בשל האזור עקשן נגררים אזור פעיל, הגלים מכוון הפוך להשמיד כאשר הם נפגשים. הגלים התמרה חושית אות כציוד ביסוד בליטות הסלולר המתווכות תא העברה10.

חלק גדול מהמידע הנ על כימוטקסיס הופיע במחקרים אמבה חברתית Dictyostelium discoideum, למרות מנגנונים רגולטוריים דומים חלים גם נויטרופילים, אחרים בתרבית של תאים סוגים16 . Dictyostelium הוא אורגניזם מודל ומבוססת שיש תגובה chemotactic חזקים במהלך רעב, כאשר אלפי תאים בודדים נודדים לכיוון מרכז צבירה, בסופו של דבר יוצרים גוף fruiting multicellular המכיל נבגי. כימוטקסיס חיוני גם בשלב הצמיחה תא בודד של האורגניזם לאיתור מקורות המזון חיידקי. חשוב, נדידה של תאים בודדים Dictyostelium דומה להפליא ההעברה. בתרבית של נויטרופילים או תאי סרטן גרורתי, אשר כולם עוברים העברה מסוג amoeboid מהירה מאוד. למעשה, שני הטופולוגיה הכוללת של רשתות רגולטוריות, כמו גם רבים מן המסלולים התמרה חושית אות בודדת מעורב כימוטקסיס נשמרים בין Dictyostelium בתרבית של לויקוציטים17. יתר על כן, תאים אחרים, כגון fibroblasts, להשתמש קולטן טירוזין kinases (RTK) במקום GPCRs; עם זאת, RTKs עשויים להאכיל לתוך רשתות דומות.

בניגוד כימוטקסיס, הבנה מעמיקה של המנגנונים איתות כי הכונן מצבי שונים של הגירה מכוון לוקה בחסר. בדומה לתאים בהעברה של מעבר הדרגתי chemoattractant מספר מחקרים דיווחו על הפעלה ו/או לוקליזציה של סמנים הקצה המוביל טיפוסי, כולל פלמור אקטין, PIP3 ו/או חוץ-תאית מוסדר אות קינאז (טיפשה) 1/2, ב הקדמי של תאים שעברו ביים ההעברה בתגובה להטיה זרימה או שינוי שדות חשמליים18,19,20,21. עם זאת, במחקרים אלה חשיפה מתמשכת הגירוי הביאה גם נדידת תאים, להשאיר פתוחה את השאלה אם, לדוגמה, הסימונים הקצה המוביל לשפה במיוחד בתגובה לגירוי, או אם הם פשוט להתאים לשפה בחוד בשל עלייה במספר pseudopods בחזית תא נודדים.

פיתחנו מבחני ומאפשרים לנו להתבונן התגובה של התאים חריפה ההפרעות מכני נמסר הטיה זרימה הן ברמת האוכלוסייה וכן תאים בודדים22. דומה גירוי גלובלית עם chemoattractant, stimula חריפהtion בתזרים הטיה מאפשר חקר תגובה תאית גירוי מכני ללא התרומה מבלבלים תנועתיות או קוטביות. שילוב של מבחני הביוכימי, מיקרוסקופית אלו עם לפליטת גנטית או תרופתי מאפשר לנו ללמוד על גירויים מכניים איך נתפסים משודר. יתר על כן, גישה זו מספק גם שיטה עבור הקשה לתוך המערכת במורד הזרם של הקולטן chemoattractant בהיעדר chemoattractant, ובכך לבודד את האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות מ הקולטן/G רשת חלבון.

תוך שימוש בטכניקות המתוארות להלן אנו לאחרונה הפגינו שגזירה חריפה הזה מוביל הפעלה של רכיבים מרובים של chemotactic האות התמרה חושית ואני אקטין שלד התא רשתות22. על-ידי החלת את הגירוי המכני חריפה במרווחי זמן שונים, להדגים, באופן דומה כדי chemoattractants, תגובה לגירויים מכני מפגין גם תכונות של מערכת טמפרמנט, כולל ההתנהגות all-or-none של התגובה תחת קולח תנאים ואת נוכחותם של תקופה עקשן. בסופו של דבר, על ידי שילוב של גירוי מכאני וכימי הראינו כי שני הגירויים לשתף האות התמרה חושית אקטין שלד התא ורשתות, המאפשרים סביר לשילוב של גירויים מרובים כדי נדידת תאים הסטייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ההכנה של פתרונות

  1. מדיה להכין HL-5 באמצעות הפעולות הבאות: 10 גרם/ליטר דקסטרוז, peptone proteose 10 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 g/L, 0.965 g/L נה 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0.485 g/L ח' 2 פו 4,, אלא אם צוין אחרת, סטרפטומיצין 0.03 נקודות g/L במים יונים. אוטוקלב המדיום וחנות בטמפרטורת החדר.
    הערה: עקב ההבדלים בין peptone proteose תמצית שמרים שנרכשה מן הספקים השונים, כמו גם בין קבוצות בודדות, ה-pH של המדיה ייתכן שיהיה צורך ניתן לכוונן את טווח טיפוסי של 6.4 ל 6.7.
  2. SM להכין צלחות באמצעות הפעולות הבאות: 10 גרם/ליטר דקסטרוז, peptone 10 גרם/ליטר, 1 g/L שמרים תמצית, 2.31 g/L ח' 2 PO 4, 1 g/L K-2-HPO-4 ו- 20 g/L אגר במים יונים. אוטוקלב, מגניב, ויוצקים 30 מ של הפתרון אגר לכל ס מ-10 צלחת פטרי. לאחר אגר מתמצק, אחסן את הצלחות ב 4 ° C עד כחודש.
  3. הכן 10 x באמצעות מאגר פוספט (PB) 13.4 g/L נה 2 HPO 4 ·7H 2 O ו- 6.8 g/L ח' 2 PO 4 במים יונים. לאחסן את המניה 10 x 4 ° C. Dilute עד 1 x עם מים יונים לשימוש.
  4. להכין מאגר DB מאת שכשהם 1 X חמאת בוטנים עם 2 מ מ MgSO 4 ו- 0.2 מ מ CaCl 2.
  5. הכן קפאין 100 מ מ במים יונים. חנות − 20 ° C
  6. להכין 100 מ מ מחנה פתרון מניות על ידי המסת monohydrate מלח נתרן המחנה במים יונים. הכן של 1 מ מ עובד מלאי במים יונים. לאחסן שני פתרונות מניות-− 20 מעלות צלזיוס. הכן המחנה הפתרון הסופי-הריכוז הרצוי ב- DB ביום של הניסוי-
    הערה: מלאי פתרונות ניתן להקפיא הקרת כמה פעמים.
  7. הכן חומצה פולית 25 מ מ ב- 1 x PB. מוסיפים כמה טיפות 1 N NaOH עד האבקה מתמוסס לחלוטין. חנות − 20 ° C
  8. להכין מאגר מדגם x 3, באמצעות הפעולות הבאות: pH מ מ 187.5 טריס-HCl 6.8, 6% (w/v) dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות), 30% גליצרול, 126 מ מ dithiothreitol, bromophenol 0.03% (w/v) כחול. Aliquot, בחנות − 20 מעלות צלזיוס
    1. מראש להשתמש, להפשיר באמבט מים 37 ° C ולהמשיך להכין מאגר מדגם עם מעכבי פרוטאז, פוספטאז על-ידי דילול 3 x דוגמת המאגר ל- 1 x, והוספת 50 מ"מ NaF, 2 מ מ נה 3 VO 4, 25 מ מ נתרן רב-תכליתי, ו- 1 x מלאה ללא EDTA פרוטאז מעכב קוקטייל במים יונים. הוסף את מעכבי מיד לפני תחילת ההליך המתואר צעדים 3.1.2-3.1.3.
  9. להכין 5 מ מ Latrunculin A פתרון דימתיל סולפוקסיד. Aliquot, בחנות − 20 מעלות צלזיוס

2. הכנה של תאים discoideum ד

הערה: לשמור על תאים discoideum ד בתקשורת HL-5 או תרביות רקמה צלחות או ההשעיה התרבות כפי שצוין בעבר תיאר 23. בעת הצורך, התמרת תאי עם fluorescently-ידי ביולוגיים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים אלקטרופורציה 24. שונים זנים discoideum ד, כמו גם פלסמידים קידוד ביולוגיים או אחרות הגנים של עניין ניתן לקבל ממרכז המניות של Dicty (dictybase.org).

  1. וצמיחה של אוסף תאים וגטטיבי discoideum ד
    1. לניתוח של תאי צמח, גדל התאים בנוכחות חיידקים כדי להפחית את מספר macropinosomes, אשר בדרך כלל הם נצפו תאים שגודלו axenically 25.
      1. הכן תרבות של קלבסיאלה aerogenes על ידי מזריקים מספר קטן של תאים מניה גליצרול או תרבות קודמות לתוך האחסון הרצוי של מדיום HL-5 ללא אנטיביוטיקה. דגירה התרבות חיידקי על שאכר מסלולית-200 סל ד (0.42 x g) בטמפרטורת החדר (20-22 מעלות צלזיוס) עבור ה 16-18
        הערה: K. זן aerogenes המשמש כאן הוא פתוגניים שאינם (ראה הטבלה של חומרים).
    2. לאסוף discoideum ד בשלב הגידול האקספוננציאלי תרביות רקמה צלחות או מתרבות ההשעיה, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer על פי היצרן ' s הוראות. מורחים 1 x 10 5 ד discoideum תאים עם 260 ההשעיה ק' aerogenes µL בצלחת SM. הפעל את הצלחת הפוכה למטה למחרת. לגדל תאים בטמפרטורת החדר עד התאים discoideum ד להתחיל לנקות את הדשא חיידקי, אבל לפני שהם מתחילים צבירה (~ 36-48 שעות).
    3. לאסוף תאים discoideum ד במאגר 5 מ ל DB על ידי גירוד אותם עם מפזר הזכוכית. העברת תאים צינור פוליפרופילן 50 מ. יש לשטוף את הצלחת עם עוד 5 מ ל DB מאגר ובריכה עם ההשעיה המקורית. למלא את הצינור כדי 50 מ עם מאגר DB.
    4. צנטריפוגה המתלה discoideum ד ב g 360 x עבור 3-4 דקות וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 50 מ ל DB מאגר. חזור על השלבים כביסה עד תגובת שיקוע לנקות (שוטף ~ 3-4). Resuspend בגדר התא האחרון במאגר DB כדי צפיפות הסופי של 5 ~ x 10 6 תאים למ"ל.
  2. הכנה של מצבור-תאים המוסמכת discoideum ד
    1. פיתוח discoideum ד תאים על ידי הרעבה 1 h ואחריו 4 שעות של הרעבה, הפועמים עם 50 ננומטר מחנה כל 6 דקות על פי תקן תקנות 23.
    2. בעקבות התפתחות, למדוד את עוצמת הקול הסופי של השעיה תא.
    3. מבוסס על המספר הראשוני של התאים המשמש לפיתוח, לחשב תא צפיפות של התליה האחרון.
      הערה: אם מחנה תימסר כרכים µL 100 לכל 6 דקות, נפח התאים מגדילה 1 מ"ל לכל שעה הפועמים המחנה. לפיכך, עבור התנאים רגיל באמצעות תאים 7 8 x 10 מ 4 ל DB, אחרי 4 שעות של פיתוח אמצעי האחסון הסופי הוא 7 mL ואת צפיפות תא הסופית היא ~1.1 x 10 7 תאים למ"ל.

3. ניתוח הביוכימי של התא התגובה מכנית או גירוי כימי

תאים
  1. חריפה מכני גירוי של תאים ואחריו פירוק התא
    1. צלחת 2 x 10 6 צבירת-מוסמך (מתוך שלב 2.2) לאחר 4 שעות של פיתוח במנות 35 מ מ עם 2 מ ל DB. לאפשר את התאים לצרף 10 דקות בטמפרטורת החדר. רחץ תאים פעמיים עם 1 מ ל DB. דגירה תאים ב- DB עם 2.5 מ"מ קפאין למשך 30 דקות ללא כל הפרעה הלוחיות.
      הערה: אם התאים צריכים להיות מטופלים עם מעכב תרופתי, להוסיף ריכוז הרצוי של מעכב או באותו אמצעי אחסון של הרכב המתאים במהלך basalation עם קפאין.
    2. כדי להחיל גירוי מכני, למקם את הצלחת (אחד בכל פעם) תפקודי לב / נשימה ולהדליק מייד ב 150 סל ד (0.24 x g) עבור 5 ס
      הערה: הצלחת יכול גם להיות באופן ידני מגורה על ידי התנועה באופן cross-wise כ 5 ס
    3. וביופסיה המאגר הצביעו פעמים לאחר תחילת הגירוי. מיד lyse בתאים על-ידי הוספת 100 מאגר מדגם µL עם מעכבי פרוטאז, פוספטאז.
    4. למקם את הצלחת על קרח, ולאסוף את lysate לתוך צינור 1.5-mL. עבור ' זמן 0 ', lyse התאים מבלי לרעוד. העברת הצינורות גוש חום 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות מיד לאחר פירוק. להמשיך עם immunoblotting או לאחסן lysates ב-20 מעלות צלזיוס
  2. גירוי של תאים עם Chemoattractant
    1. Basalate תאים צבירת-המוסמכת לאחר 4 שעות של פיתוח על ידי במהירות בטילטול בנוכחות קפאין 5 מ מ- 200 סל"ד (0.42 x g) על תפקודי לב / נשימה למשך 30 דקות.
      1. צנטריפוגה התליה תא ב- 360 x g עבור 3-4 דקות וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 10 מ"ל מאגר DB קר כקרח. חזור על השלב כביסה.
    2. Resuspend בגדר התא האחרון במאגר DB כקרח כדי צפיפות הסופי של 4 x 10 7 תאים למ"ל לפי מספר התא הראשוני השתמשו לפתח את התאים (ראה שלב 2.2). לשמור על התליה תא על הקרח לפני stimulהתקדמ.
      1. µL 50 פיפטה של 10 מיקרומטר למחנה או הרכב לתוך כוס פוליסטירן מונחת תפקודי לב / נשימה.
    3. כדי לגרות את התאים, להוסיף µL 450 של התליה תא קר כקרח מאותה הכוס ולפנות מיד ניעור ב 200 סל"ד (0.42 x גרם). At במועדים שונים לאחר תחילת הגירוי (למשל 10, 30, 45, 60, 120 s) בקצרה לעצור ניעור, להוציא 50 aliquots µL תא השעיה, lyse בתאים על-ידי הוספת אותם צינורות 1.5 mL המכיל 25 µL 3 X דוגמת המאגר.
      1. על ' זמן 0 ', השתמש תאים מן התליה תא קר כקרח unstimulated.
        הערה: הטמפרטורה הסופי של התליה תא במהלך גירוי היא ~ 9 ° C 26. בתנאים אלה התגובה שיא מתרחשת מעט מאוחר יותר שיא נצפתה לגירוי לבצע בטמפרטורת החדר (לדוגמה, גירוי chemoattractant של תאים חסיד על המיקרוסקופ, או גירוי מכני של תאים חסיד).
    4. להעביר הצינורות גוש חום 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות מיד לאחר פירוק. להמשיך עם immunoblotting או לאחסן lysates ב-20 מעלות צלזיוס
  3. ניתוח של התא תגובה Immunoblotting
    1. רוץ lysates (מן השלבים 3.1.3 או 3.2.4) ב 4-15% טריס-HCl לזיהוי ג'ל, להעביר polyvinylidene פלואוריד ממברנה בלוק, immunoblot עם פוספו-PKC אפי Thr410 (כדי לזהות פוספו-PKBR1 ופוספו-PKBA). לזהות את האות על ידי דגירה עם חזרת מצומדת peroxidase ארנב אנטי משני נוגדן, ואחריו chemiluminescence באמצעות chemiluminescence משופרת המצע.
    2. לצורך זיהוי של מספר חלבונים, להסיר את האבן החשופה עם מאגר הפשטת ולאחר בדיקה מחדש עם נוגדן ראשוני נגד פוספו-p42/44 MAPK Thr302/304 (כדי לזהות פוספו-ERK2). לאשר חלבון שווה טעינה על-ידי מכתימה את הקרום פלואוריד polyvinylidene עם כחול מבריק Coomassie.

4. גירוי מכני וחמורות לחיות הדמיה של תאים בודדים על המיקרוסקופ

  1. הערכה של התגובה חריפה גירוי מכני באמצעות התקן הזרימה
    1. לאסוף ו לדלל וגטטיבי או צבירת-כשיר תאים ~ 1 x 10 6 תאים/מ ל DB כפי שתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2, בהתאמה. לטעון ~ 600 µL לתוך השקופית עם ערוץ (ראה את הטבלה של חומר עבור פרטים). מאפשרים לתאים לצרף במשך 10 דקות לוודא כי כל פתחי הכניסה בשקופית מלאים לגמרי. למעלה למעלה עם מאגר נוסף במידת הצורך.
      הערה: השקופית מסוים המשמש לניתוח יש שלוש כניסות, אשר להאכיל לתוך ערוצי צר, 1 מ מ, אבל מכן למזג לערוץ אחד רחב, 3 מ מ. הגובה של הערוץ הוא 0.4 מ מ. למרות התאים הם מצופים לאורך הערוץ, עם תמונה רק את החלק רחב.
    2. לעבור את אחת השורות שמצורף ל מאגר 50-mL דרך השסתום הראשי של יחידת fluidic (ראה טבלה של חומרים לפרטים). באמצעות התוכנה עבור המשאבה, ודא השסתום נסגר (כלומר משמאל). למלא את האגם עם DB.
      1. לקבוע את הלחץ 50 mbar, תפעיל את זה. מילוי ולשטוף את הקו עם DB על-ידי לחיצה על השסתום כדי לפתוח אותו. להפוך את הלחץ שוב כ- 0, סגור את השסתום לאחר ~ 30 ס
    3. להתחבר לאחד פתחי הכניסה שלושה בצד אחד של השקופית הקו ללא השמנה בועות אוויר. חבר את פתחי הכניסה שני אחרים. מתחבר לקו הביוב לים יחיד בצד השני של השקופית.
      הערה: הצנרת המשמשים את השורות קלט וניקוז בהגדרת הזה יש של קוטר פנימי של 1.6 מ מ.
    4. במקום השקופית על המיקרוסקופ תחת מטרה אוויר X 20. לשטוף את הערוץ, להחליף את השסתום כדי לפתוח את הקו ולחץ " לחץ על ", להתחיל בלחץ גבוה (~ 50 mbar או ~ 40 רמות דינ/cm 2) לדחוף את הנוזל דרך לניקוז.
      1. , ברגע הנוזל שיוצא הניקוז, להפחית לחץ חיצוני לאפס (כלומר. הכבידה זורמים בלבד, ~ 15 רמות דינ/cm 2), ולהמשיך שטיפה ~ 30 ס' מתג את השסתום למיקום ההפוך כדי לעצור את הזרימה.
    5. לרכוש תמונות עם תאורה RFP או ה-GFP על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה תחת 40 X שמן המטרה במרווחי s 3. עם השסתום במצב סגור, להפעיל את הלחץ בבית הלחץ הרצוי, בדרך כלל בין 15 ל- 40 רמות דינ/ס מ 2 (0 - 50 mbar).
    6. לאחר רכישת 5 מסגרות, לספק את הגירוי על ידי מיתוג את השסתום " פתח " עמדה. לבטל את זרימת אחרי 2-5 s על-ידי החלפת השסתום בכיוון הפוך לכיוון.
      הערה: עבור ביולוגיים חלשים מסוימים (למשל PTEN, CynA ו RalGDS) זה ייתכן שיהיה צורך תאים התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 40 X שמן המטרה.
  2. בדיקה ההשפעות של מעכבי תרופתי על תגובה חריפה גירוי מכני באמצעות התקן הזרימה
    1. צלחת תאים בשקופית עם ערוץ כפי שמתואר בשלב 4.1.1. הגדרת שתי שורות: להעביר קו אחד השסתום קבלה כמו שלב 4.1.2, והשאיר השני דרך הגב שסתום. תהדק את הקו שמאל ומכניסים את השסתום " סגורה " עמדה (שמאל). למלא בשורה אחת עם DB המכיל את הרכב המתאים ביותר, והשני עם הפתרון הכולל מעכב תרופתי עניין (למשל 5 מיקרומטר Latrunculin. א).
      הערה: יש צורך פיזית תהדק את הקו שמאל כי " סגורה " מצב השמאלי פותח את השסתום לקו הזה.
    2. מילוי ולשטוף הזכות שורה על-ידי הפעלת הלחץ ב- 50 mbar ואת החלפת השסתום " פתח " עמדה (מימין). להחליף השסתום שמאלה אחרי ~ 30 ס' מילוי ולשטוף את הקו שמאל על ידי הסרת את המלחציים עבור התחברות ש ~ 30 שני הקווים שני פתחי הכניסה בצד אחד של השקופית עם ערוץ חבר לים הנותרים, להתחבר הביוב לים יחיד בצד השני. < /l אני >
    3. לרחוץ את השקופית הכוללת המאגר של הקו הנכון ולבצע גירוי במאגר אותו כפי שתואר בשלבים 4.1.3 ו- 4.1.4 לעיל.
      הערה: למרות הקו הנכון נבחר בפעם הראשונה בתוכנית התקנה זו, הצו יכול להיות הפוך.
    4. בעקבות גירוי, להחליף את השסתום כדי לפתוח את הקו הנכון בלחץ אפס (כלומר כוח המשיכה זרימה רק, ~ 15 רמות דינ/cm 2). להסיר את המלחציים מקו שמאל, להחליף את השסתום שמאלה כדי לפתוח את הקו הזה. תהדק את השורה הראשונה.
    5. לאחר הפעלת 3-5 מ של מאגר עם מעכב דרך, להחליף את השסתום ימינה כדי לעצור את הזרימה, דגירה התאים עם החומר המדכא עבור משך הזמן הנדרש (למשל 15 דקות). הפעל את הזרימה על-ידי החלפת השסתום כל מין ~ 10 ~ 15 s כדי למנוע מחסור בחמצן. חזור על גירוי עם השורה השניה.
  3. שיטה חלופית כדי להעריך בתגובה חריפה גירוי מכני באמצעות micropipette
    1. להגדיר את micropipette מלא עם DB על פי הנוהל המקובל 23. . תמשיכי ללחוץ פיצוי בבית 1,500 psi.
    2. לאסוף ו לדלל תאי צמח כפי שמתואר בשלב 2.1. מקום 25 טיפות µL של ~7.5 x 10 5 תאים למ"ל כדורים 1-ובכן, מאפשרים לדבוק לפחות 10 דקות ולכסות עם 3 מ ל DB.
    3. במקום החדר על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד עם מטרה שמן X 40. אתר את התאים. והורד בעדינות את micropipette לתוך באמצע שדה הראייה עד קודם שייגע בתחתית התא.
      הערה: מאז הלחץ הפיצוי נקבע בבית 1,500 Psi, התאים ללא הרף ייחשף לזרימה איטית מאוד של DB מ micropipette.
    4. מתחילים לרכוש תמונות עם תאורה RFP או ה-GFP במרווחי s 3. להחיל ' נקיים ' פונקציה לשחרר סיילין הנוזל. micropipette. המשך הדמיה אניn הנוכחות של זרימה בלחץ פיצוי לבד.
  4. שיטה חלופית כדי להעריך בתגובה חריפה גירוי מכני באמצעות תוספת מאגר בצובר
    1. לאסוף ו לדלל תאי צמח כפי שמתואר בשלב 2.1. µL מקום 20 טיפות של תאים-~ 1 x 10 6 תאים למ"ל ב DB באמצע טוב של חדר 8-. טוב. לאפשר תאים לדבוק במשך לפחות 10 דקות
    2. מתחילים לרכוש תמונות עם תאורה RFP-GFP ספציפיים או על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד עם מטרה X 40 במרווחי s 3. להתמקד באזור קרוב לקצה הירידה.
    3. להוסיף במהירות µL 430 של DB לצד אחד של הבאר. המשך הדמיה-
    4. לניתוח של האינטראקציה בין גירויים מכניים וכימיים, s 12 או 45 בעקבות גירוי מכני, בעדינות מוסיפים 50 µL של חומצה פולית (ריכוז סופי 20 ננומטר) או רכב (DB) ללא גרימת לתגובה מכני. המשך הדמיה-
  5. כימות של תגובה
    1. פתחו את התמונה TIFF 32 סיביות בתוכנת ניתוח התמונה (ראה טבלה של חומרים לפרטים) 27-
    2. תחת ' נתח ', עבור אל הכרטיסיה " הגדרת המידות ". סמן את התיבה עבור ' מתכוון ערך אפור '. ודא שהקופסאות אינן נבדקות. לחץ על " אישור ".
    3. תחת ' תהליך ' טאב, לחץ על " רקע לחסר ". לשמור את רדיוס הכדור מתגלגל 50 פיקסלים, לא סימון אחת או יותר מהאפשרויות המופיעים בתפריט. תקריב על שימוש תא אחד ' זכוכית מגדלת ' כלי.
    4. שימוש ' מלבן ' הכלי, ציירו תיבה (~2.5 x 2.5 מיקרומטר 2) בציטוזול, מוודא לא למשוך אותו הגרעין או קרום פלזמה. העיתונות " Ctrl " + " M " מפתחות או ללכת ' נתח ' טאב ולאחר מכן לחץ על " מידה " כדי לקבוע את הערך אפור הממוצע של התיבה. להתקדם המסגרות ולמדוד שוב, לוודא את תיבת נשאר ציטוזול.
      הערה: מאז תאים discoideum ד לנוע במהירות רבה תיבת ניתן להעביר למסגרת הבאה להשאיר ציטוזול-
    5. אחרי כל המסגרות יש נותחו, להעתיק את הערכים לתוך גיליון אלקטרוני. לקחת בחשבון-לתא וריאציה רמות הביטוי של ביולוגיים שונים, לנרמל את הערכים עבור ערך האפור רשע נצפתה בזמן 0. לחשב את הדדיים של הערכים כדי לשקף ההצטברות של האות על קליפת-

5. רציפה גירוי מכני, לחיות הדמיה של תאים בודדים על המיקרוסקופ

  1. להגדיר את התאים בדיוק כפי שתואר לעיל לניתוח גירוי מכני חריפה בשלבים 4.1.1 - 4.1.3. פתח את התקע כיסוי המאגר עם המאגר, אז יכול להיות עקף את אמצעי האחסון אם התגובה הוא ניתח יותר מ כמה דקות בכל פעם.
    הערה: כיוון המאגר נותר פתוח למשך הזמן של הניסוי, וזמינותו הזה מתקיים בהיעדר לחץ חיצוני וכן על זרימת הכבידה לבד. כדי להגביר את קצב הזרימה של חוק המשיכה, הניקוז ניתן להניח על השולחן מתחת למיקרוסקופ.
  2. להתחיל הדמיה תאים עם תאורה RFP-GFP ספציפיים או על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד עם מטרה X 40 במרווחי s 3 לצורך ניתוח של תגובות ביוסנסור. לחלופין, תמונה עם שלב החדות בעזרת מטרה X 20 במרווחי s 10 לניתוח של נדידת תאים הכללית.
  3. להפעיל את זרימת לאחר מספר מסגרות-הגדרת אפס-לחץ (כלומר זרימה הוא עקב כוח המשיכה לבד או ~ 15 רמות דינ/cm 2) על ידי מיתוג את השסתום למצב פתוח. כאשר רמת הנוזלים יורד עד 5-10 מ"ל במאגר המים, למעלה עם מאגר נוסף. הקפד להוסיף את הנוזלים בקפידה כך בועות אוויר לא להילכד בתוך הקווים.
    הערה: חשוב להוסיף נוזל של הטמפרטורה כדי למנוע תגובת הלם בתאים.
  4. לכמת תא מהירות והתמדה באמצעות תוכנת ניתוח ההעברה (ראה את הטבלה של חומרים לפרטים) על פי יצרן ' הוראות s.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זמני תגובה של הרגולטורים כימוטקסיס גירוי מכני חריפה

כדי להעריך את התגובה של תאי discoideum ד כדי גירוי מכני, תאים מצבור המוסמכים חסיד נחשפו דופק קצרה של זרימה הטיה. צבירת-כשיר ד discoideum תאים מפרישים מחנה, אשר יכול להיות חש על ידי תאים שכנים. כדי להתגבר על התרומה של איתות התא-התא, תאים טופלו קפאין, אשר מעכב cyclase adenylyl ב discoideum ד , וכך מונע את הפרשת המחנה28. אכן, תאים טרום טיפול עם קפאין הייתה פעילות הבזליים מאוד נמוכה של PKBR1, ERK2, הראו עלייה חזקה זירחון של משקעי מפתח אלה kinases בעקבות גירוי s 5 בתזרים הטיה (איור 1 א'). ההיענות היתה ארעית, חולה סביב 10-15 s עבור PKBR1, וליד 30 s עבור ERK2, באופן דומה כדי בעבר לאור הממצאים לצורך הפעלה של חלבונים אלה עם chemoattractant7.

למרות שקשה להעריך את היעילות של התגובה בהתחשב לרמת הבסיס נמוך, מחקרים ראשוניים שהובילו התפתחות זו assay, בהשוואה גירוי בתזרים הטיה לבד (או עם רכב) כדי להטות את זרימת רכוש מחנה chemoattractant (איור 1B). ניתוח זה לא הראה עלייה בתגובה עם המחנה, רומז כי התגובה של הרשת התמרה חושית אות להטיית זרימה רוויה. למרות ב assay זה מחנה לא להגביר זירחון של PKBR1, יכול להיות שנצפו תאי בתגובה chemoattractant באמצעות פרוטוקול גירוי רגיל שבו תאים מצבור המוסמכים שמרו על ההשעיה, גירוי עם המחנה, lysed שונים בעקבות גירוי נקודות זמן. כפי שמוצג באיור 1C, תחת תנאים אלה יש עלייה PKBR1 זרחון בתגובה chemoattractant, אבל לא רכב חולף. התגובה שיא נצפית 30 s ב- assay הזה כי הטמפרטורה של התליה תא במהלך וזמינותו היא ~ 9 ° C, בהשוואה ל ~ 22 ° C עבור assay גירוי מכני שתוארו לעיל26.

ייתכן התגובה של המוביל, משתרך סמני קצה כדי גירוי מכני חריפה

מאז וזמינותו האוכלוסייה הנ ל רק מספק מידע זמני על ההתנהגות של הרגולטורים כימוטקסיס, תאים נחשפו גם לגירוי מכני קצר בזמן הנצפה עם מיקרוסקופ. Assay זה יכול להתבצע עם צבירת-המוסמכת או וגטטיבי לבטא ביולוגיים שונים עם התווית fluorescently, לוקליזציה אשר הוגדר בתאים מגורה עם chemoattractant תאים discoideum ד . שני הקצה המוביל סמנים, תחום ה-PH של Crac וסידΔcoil, אשר גייסו ידי PIP3 או אקטין polymerized החדש, שניהם הראו בעיקר cytosolic לוקליזציה בתאים resting כפי שדווחה בעבר (איור 2 א, משלימה סרט 1 )4,29. התאים היו פעילים basally, ביולוגיים אלה גם ניתן היה לראות על קצות pseudopods. בעקבות גירוי בתזרים הטיה 2 s, את ביולוגיים relocalized במהירות אל קליפת המוח עם שיא ב ~ 6 עד 10 s, וחזר אל ציטוזול מאת ~ 30 s. לעומת זאת, סמן קצה לקרטע PTEN מקומי-קליפת לפני גירוי (איור 2 א). לאחר דופק קצרה עם הטיה זרימה, עוצמת PTEN cytosolic גדל, אמנם עם דינמיקה איטי יותר מאשר עבור ביולוגיים הקצה המוביל. שינוי ביוסנסור לוקליזציה של ציטוזול קליפת המוח, ולהיפך, הוא ראה בבירור כמו שינוי בעוצמת cytosolic המאפשר כימות פשוטה של התגובה.

התנהלות ביולוגיים בתגובה חריפה גירוי מכני שנצפה הוא עקבי עם מובילים, משתרך קצה dynamics לוקליזציה בתגובה לגירוי עם chemoattractant אחיד. התנהגות זו איננה ייחודית ביולוגיים שלוש המוצגים. כפי שפורסמו בעבר, בדומה לשינויים לוקליזציה נצפו גם עבור סמני החדשנית "rbd" ו RalGDS, אשר מזהה מופעל Ras ו- Rap1, בהתאמה, כמו גם באשר פיגר אחריו עוד קצה סמן22,CynA30.

Assay דומים ניתן להעריך את ההשפעות של מעכבי שונים על-ידי שינוי פשוט של ההתקנה ניסיוני מקו קלט אחד אחד כפול. באמצעות שיטה זו, התאים יכולים להיות נחשפה לראשונה לתנאי בקרה, ואחר כך הוא החליף את המאגר המכיל את הסוכן המבחן הרצוי. לדוגמה, תוספת של תרופה depolymerizing-אקטין LatA חסם את התגובה של RBD, כמו גם לייםΔcoil, כדי גירוי מכני חריפה (איור 2B).

התגובה הכללית מקדים נדידת תאים תחת גירוי ממושך עם הטיה זרימה

הגישה המתוארת כאן גם יכול להיות מותאם כדי לחקור את ההשפעות של זרימה הטיה על הגירה discoideum ד . למעשה, אם הזרם היה לא כבה לאחר 2 s אבל נשארו על משך זמן הניסוי, תאי צמח הראה ביים ההעברה נגד הזרם (איור 32 הסרט משלים). יצוין, כי הזרם הטיה צורך מביאות לתגובה הנדידה היה נמוך יותר מאשר הלחץ בו בדרך כלל כדי להשיג מענה עם גירוי אקוטי בתאי צמח (לדוגמה, כפי שניתן לראות להבין 2B). עם זאת, אפילו בלחץ נמוך, תאים מוצגים תגובה אחידה חזקים, כפי שהיא נמדדת על ידי שינוי בלוקליזציהΔcoil ליים, שקדמה לכל שינוי בעמדה של התא עצמו. לפיכך, הניסויים הראו בבירור כי 1) התגובה הכללית אינה תלויה על תנועת התא, 2) התגובה הכללית מקדם ההעברה מכוונת.

גישות חלופיות של בדיקות בתגובה חריפה גירוי מכני

למרות השימוש תא זרימה דרך יש יתרונות משמעותיים עבור חקר בתגובה חריפה גירוי מכני, אנחנו גם תוקף שני מבחני נוספים לבדיקת התגובה של תאים בודדים גירוי מכני חריפה. כפי שמוצג באיור4, לייםΔcoil במהירות, transiently מחדש מקומית מ ציטוזול קליפת המוח כאשר התאים היו מגורה על ידי תוספת בולוס של מאגר נמסרות או על ידי micropipette (איור 4A) או באופן ידני באמצעות בצובר בנוסף המאגר עם פיפטה (איור 4B). יצוין, כי בעמדת נחיתות ברורה של שני מבחני אלה הוא כי הסכום המדויק בכוח גזירה להעביר את התא אינו ידוע, לא יכול להיות מגוון בקלות. עם זאת, עבור מצבים בו מעבר בין גירויים מכניים וכימיים היא הרצויה, בצובר מאגר תוספת מציע אלטרנטיבה מוצק הגירוי במכשיר זרימה.

Figure 1

איור 1: נציג תוצאות עבור הערכה הביוכימי של התגובה של התאים discoideum ד כדי גירוי כימי מכניים או חריפה. צבירת-המוסמכת תאים נחשפו לגירויים כימי או מכני, lysed בנקודות זמן המצוין, ואת immunoblotted באמצעות נוגדנים מזהה phosphorylated PKBR1 או ERK2. (א) דוגל התאים היו מגורה על תפקודי לב / 5 s. הקרום היה מוכתם עם Coomassie מבריק כחול (CBB) כדי להראות שווה חלבון טעינה. (B) תאים חסיד היו מגורה על ידי תנועה ידני של הצלחת באופן cross-wise עבור הבאים s כ 5 גירוי כימי בשל תוספת של 1 מיקרומטר למחנה או מאגר (הרכב), או ללא כל גירוי כימי (-). Immunoblots שני הצג את היקף וריאציה הפעלת הבזליים PKBR1 ראיתי בזמן 0. לעיתים, הפעלת PKBA יכול גם יזוהו על-ידי טכניקה זו, כפי שמוצג בחלונית התחתונה. (ג) השעיה התאים היו מגורה עם 1 מיקרומטר למחנה או מאגר (הרכב). (א) חלק איור זה השתנה מ Artemenko et al. (2016) 22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג תוצאות עבור גירוי מכני חריפה והדימות בשידור חי של תאים בודדים על המיקרוסקופ. (א) צבירת-כשיר discoideum ד תאים ליים מתויג RFP לביטויΔcoil, או מתויג GFP PH-Crac או PTEN היו מגורה עם כיווני זרימה שכבתית-15 רמות דינ/cm2 עבור 2 עד 5 תמונות ס' היו נאספים כל 3 s . נציג תאים מציג טרנסלוקציה של ביולוגיים בתגובה גירוי מכני מוצגים. הצטברות של כל ביוסנסור-קליפת הייתה לכמת כמו ההופכי של עוצמת cytoplasmic רשע מנורמל בפעם 0. התגובה הממוצע של 18 (סידΔcoil), 20 (PH-Crac) או 6 תאים (PTEN) מוצג. ערכים הם מתכוון ± SE. (B) תאי צמח ביטוי מתויג RFP סידΔcoil- RFP ו מתויג GFP RBD טופלו עם הרכב או 5 מיקרומטר LatA למשך 15 דקות לפחות, ו מגורה ואז עם כיווני זרימה שכבתית-רמות דינ/cm 412 2 ס תמונות נאספו כל 3 ס' RBD-GFP, סידΔcoil- RFP הצטברות-קליפת הייתה לכמת כמו (A). ערכים הם זאת אומרת ± SE. מספר התאים ניתח מסומן לצד כל תנאי. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ. Artemenko et al. (2016) 22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נציג תוצאות עבור התגובה של התאים discoideum ד כדי גירוי ממושך עם זרימה. (א) תאי צמח ביטוי מתויג RFP לייםΔcoil נחשפו רציפה חד כיווני זרימה שכבתית-15 רמות דינ/cm2 , עם תמונה כל 3 מסלולים ס' 11 תאים מוצגות באיור (B). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ. Artemenko et al. (2016) 22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נציג תוצאות עבור גישות אלטרנטיביות בדיקות בתגובה חריפה גירוי מכני. (א) צמח discoideum ד תאים לביטוי מתויג RFP לייםΔcoil נחשפו micropipette (*) basally שחרור assay מאגר בקצב איטי. עלייה קצרה קצב הזרימה הושג על-ידי אספקה מהירה של סיילין assay מאגר בזמן 0. תמונות שנאספו באמצעות תאים 3 כל צמח discoideum ד ס (B) ביטוי מתויג RFP לייםΔcoil מצופה כמו ירידה קטנה בתוך תא מיקרוסקופ היו מגורה באופן מכני על ידי תוספת של נפח גדול של המאגר . תא תמונות שנאספו כל 3 ס' סולם בר = 10 מיקרומטר. (א) חלק דמות זו שונתה מ. Artemenko et al. (2016) 22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה סרט 1: גירוי מכני חריפה מפעיל מהירה וחולף טרנסלוקציה של סידΔcoil- RFP או PH-Crac-GFP מן ציטוזול אל קליפת המוח בצבירת-כשיר discoideum ד תאים המבטאים ביולוגיים אלה. זרימה שכבתית חד כיווני היה מופעל עבור 5 s בזמן 0 ותאים היו עם תמונה במרווחי s 3. מהירות ההפעלה הוא 5 מסגרות/s. שתי דוגמאות עבור כל קו תא מוצגים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. הסרט הזה מקביל איור 2A , שונתה מ. Artemenko et al. (2016) 22. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 2: גירוי מכני רציפה מפעיל מהירה וחולף טרנסלוקציה של סידΔcoil- RFP מ ציטוזול אל קליפת המוח לפני ההעברה של תאים נגד כיוון הזרימה. התאים וגטטיבי לבטא סידΔcoil- RFP היו חשופים גזירה רציפה-15 רמות דינ/cm2 מתחיל בזמן 0, עם תמונה במרווחי s 3. מהירות ההפעלה הוא 10 מסגרות/ס סולם בר = 10 מיקרומטר. הסרט הזה המתאים באיור 3 , שפורסם בעבר ב- Artemenko. et al. (2016) 22. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות המתוארות כאן מציעים דרך נוחה כדי להעריך את האוכלוסייה והן תא בודד התנהגות בתגובה להטיה זרימה. חשוב, ואילו מחקרים קודמים ניתח לוקליזציה של המוביל, משתרך סמני קצה במהלך ההעברה, הגישה הנוכחית מאפשרת חקירת תופעות מיידית על-ידי החלת זרימת הטיה בחריפות. בשיטה זו אנו הוכיח כי, למעשה, התגובה הראשונית של תאים להטיית הזרימה אינה דורשת נדידת תאים. במקום זאת, התגובה המהירה וחולף הגירוי זרימה הטיה הראשונית מקדים כיווניות ההעברה ראיתי עם חשיפה ממושכת להטיית זרימה, בדומה התגובה הכללית הראשונית עם מעבר צבע chemoattractant.

הגישות הביוכימי, מיקרוסקופיים תשואות נתונים משלימים למרות לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות. גירוי ואחריו פירוק התא, immunoblotting של PKBs, KrsB, טיפשה, לדוגמה, מנתח אוכלוסיה שלמה של תאים, ובכך ממוצעים וריאציה מתא לתא, בניגוד וזמינותו זה בוחן את התנהגות תא בודד. עם זאת, האוכלוסייה המבוססת על מבחני נוטים מסכת שינויים עדינים בהתנהגות התא זה יכול להיות שנצפו בקלות על-ידי ניתוח תאים בודדים. בנוסף, וזמינותו הביוכימי המתוארים כאן יעיל רק עם תאי מצבור המוסמכים, מסיבות נדון בהמשך. לעומת זאת, וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה של relocalization של RBD, RalGDS, PH-Crac, לייםΔcoilPTEN, לדוגמה, בין קליפת המוח לבין ציטוזול יעיל עבור תאים הן וגטטיבי לבין צבירת-מוסמך, ובכך מאפשר תצפיות זה ישימות בהרחבה על תאים עם דרגות שונות של קיטוב. מה שהופך את שתי הגישות משלימים היא העובדה כי הם בוחנים קבוצות שונות של סמני קצה מובילים/לקרטע זמין, ובכך להרחיב את הכיסוי של האות התמרה חושית ואני אקטין שלד התא הרשתות שנבדקו עם הטיה זרימה וזמינותו.

זה עדיין לא ברור מדוע אינם מגיבים תאים וגטטיבי, אשר מגיבות מאוד robustly מבחני מבוסס מיקרוסקופיה, גירוי ואחריו פירוק התא, immunoblotting. אפשרות אחת היא כי הסכום בכוח גזירה המוחלים על תאים כאשר מסובבים את הצלחת אינו תואם הכוח מנוסים על ידי התאים בתוך תא זרימה. תאים מפותחת, לעומת זאת, אולי יש סף נמוך יותר עבור ההפעלה, ולהגיב, לפיכך, בתנאי גם. אין זה סביר כי ביולוגיים שפעילותם נמדד על ידי וזמינותו ביוכימיים אינם מבוטאים או לא מופעלים בתאי צמח, מאז גירוי של תאים וגטטיבי עם חומצה פולית מוביל הפעלה חזקה של PKBR1/PKBA ו- ERK2 (נתונים לא מוצג). יתר על כן, תאי צמח מראים ברור גיוס של PH-Crac, המשקף הצטברות PIP3, מבוסס מיקרוסקופיה וזמינותו. מאז הגיוס PKBA תלויה גם PIP3, זה נראה לא סביר כי PKBA אינם מגיבים גירוי מכני חריפה, אלא אם תנאי וזמינותו ביוכימיים אינם מיטביים כאמור לעיל. . זה נותר שטח של חקירה פעילה

ניתוח הביוכימי של הרגולטורים כימוטקסיס נדרשת הנוכחות של קפאין לאורך כל הניסוי. במקור קפאין נוספה כדי למנוע לתא איתות עקב הפרשת מחנה. עם זאת, נראה כי קפאין יש תפקיד נוסף מלבד עיכוב של adenylyl cyclase (ACA) מאז תאים ריקים ACA עדיין נדרש קפאין זירחון של PKBR1 בתגובה חריפה גירוי מכני. קפאין הוכח בעבר כדי לחסום את פעילות TorC226. זה אפשרי כי עיכוב של TorC2 חסמו כמה תנועתיות התאים הבזליים, ובכך הורידה את ההפעלה הבזליים של PKBR1 ורכיבים אחרים של האות התמרה חושית ורשתות שלד התא אקטין. פעילות הבסיס נמוך היה הכרחי להבחנה התגובה להטיית זרימה. למעשה, כאשר התאים שנאספו בנקודות זמן מוקדם יותר במהלך הפיתוח, להציגם פעילות מוגברת הבזליים ו לתגובה מופחתת הטיה-flow המושרה. מעניין, זה ידוע כי תאי צמח יש פעילות PKBA באופן פרופורציונלי יותר, פחות PKBR1 בהשוואה פיתחו תאים31. זה אפשרי המדינה הבזליים מוסדר באופן שונה במקצת בתאי צמח, צבירת-המוסמכת, לתרום יותר חוסר תגובה של תאים וגטטיבי וזמינותו הביוכימי. בסקרנות, כאשר התאים שנאספו בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, הם היו גם לתגובה מופחתת, כנראה עקב השפעה חזקה של קוטביות לוקליזציה והפעלה של הרגולטורים כימוטקסיס שונים שנבדקו זה וזמינותו.

גירוי של תאים בתוך תא מיקרוסקופ חשף כי גם הכוח וגם משך הזמן של גירוי לתרום תגובה מקסימלי22. במילים אחרות, תגובה מקסימלי יכולה להיות מושגת גם עם כוח גזירה נמוכה אם הוא מוחל לתקופה ממושכת של זמן (10 s לעומת 2 s). התבוננות זו מסבירה מדוע תאים יש תשובה הגלובלית הראשונית כאשר הם נחשפים לראשונה גירוי מתמשך, אבל חלש, שמובילה להטיית העברת זרימה-induced. עם המנגנון הנוכחי, היינו אין אפשרות ליצור זרימה הטיה נמוכה מספיק כדי לחקור את הקצה התחתון של הטווח.

אולי החשוב ביותר של מחקרים נערך באמצעות גירוי מכני חריפה שהרמיזה גירויים מכניים וכימיים מופיעים להאכיל לתוך נפוצות אותות ורשתות שלד התא אקטין. למרות הראינו כי שני הגירויים לשלב שימוש בצובר מאגר תוספת גירוי מכני, מחקרים עתידיים ינהל לפתח מערכת איפה chemoattractant יכול להישלח במהירות זרימה דרך הערוץ, אשר יהיה הרבה יותר תכליתי דרך עוצמה להערכת שילוב של גירויים מכניים וכימיים. למרבה הצער, בנוסף chemoattractant באמצעות הכיוונון הנוכחי שתי שורות מזוהה עם גירוי זרימת הטיה השניה כי chemoattractant חייב להימסר בנוכחות זרימה. אלטרנטיבה מעשית עשוי להיות מגורה-לייזר שחרורו של chemoattractant מן הקדמה בכלובים כפי הוצגה בהצלחה למחנה מאת Westendorf et al. 32. בעתיד, זה גם יהיה מעניין לבחון שילוב של גירויים אחרים, לדוגמה, להטות את זרימת ואת שדות חשמליים משתנים או להטות את זרימת וקשיחות המצע משתנה. הדוגמה השנייה אמנם מעניין כי היא כוללת שני סוגים של גירוי מכני, הקבלה אות הראשונית עשויים להיות שונים ביניהם. המאשר כי כל שנוצרים זירוז ההעברה מכוונת לחלוק באותה האות התמרה חושית רשת, להשתנות רק איך הגירוי נתפס יסביר כיצד תאים באפשרותך לנווט בתוך סביבות מורכבות. בסופו של דבר, אנחנו כבר הוכיחה כי גירוי חריף בתזרים הטיה מוביל התפשטות של תאים אנושיים כמו נויטרופילים22. בעבודתה העתידית נבחן נוסף לוקליזציה והפעלה של רכיבים שונים של האות התמרה חושית ואני אקטין שלד התא הרשתות עם גירויים מכניים בתאי יונקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק R35 GM118177 PND.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dextrose Fisher D16-1 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone Fisher DF0120-17-6 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract Fisher 50-550-445 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O Fisher S373-500 Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4 Fisher P386-500 Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) Fisher ICN10040525 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto) Fisher DF0118-17-0 Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4 Fisher P288-100 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar Fisher BP1423-500 Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4 Fisher M65-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2 Fisher C79-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine Fisher O1728-500 Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) Fisher 11-680-1100MG Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid Sigma F7876 Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base Fisher BP152-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol Fisher G33-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 1610610 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF Fisher S299-100 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4 Fisher 50-994-911 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate Fisher S390-500 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) Sigma 11873580001 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A Enzo Life Sciences BML-T119-0100 Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel Bio-Rad 3450029 Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane Bio-Rad 1620177 Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody Cell Signaling 2060 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody Cell Signaling 4370 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) GE Healthcare NA934-100UL Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) Bio-Rad 1705060 Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) Pierce PI46430 Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue Fisher PI20278 Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic) Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name Company Catalog Number Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) New Brunswick Scientific Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish Fisher FB0875712 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer Fisher 02-671-51B Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) Fisher 08-772A Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL) VWR 13915-985 Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) Ibidi 10902 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) Ibidi 80316 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) Ibidi 10978 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) Ibidi 10964 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) Ibidi 10842 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) Zeiss Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) Perkin-Elmer DM 16000 An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan Eppendorf 5252000021D and 5192000027 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) Eppendorf 930000035 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) Eppendorf 5242956.003 Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) Fisher 12-565-472 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) Fisher 12-565-338 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji) NIH https://fiji.sc/ Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) Gradientech http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 129 אותות mechanotransduction גזירה כימוטקסיס rheotaxis הטיה הנוצרות על-ידי זרם הגירה הגירה מכוון ביוסנסור לוקליזציה גירוי אקוטי
הערכה של <em>Dictyostelium discoideum</em> בתגובה חריפה גירוי מכני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Artemenko, Y., Devreotes, P. N.… More

Artemenko, Y., Devreotes, P. N. Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation. J. Vis. Exp. (129), e56411, doi:10.3791/56411 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter