Summary
여기는 심각한 기계적인 자극에 세포질 응답을 평가 하기 위한 방법에 설명 합니다. 현미경 기반 분석 결과에서 우리 전단 흐름 간략 한 자극에 따라 붙일 표시 된 바이오 센서의 지역화를 검사 합니다. 우리는 또한 화학적 심각한 기계적인 자극에 응답에 대 한 관심의 다양 한 단백질의 활성화를 테스트합니다.
Abstract
Chemotaxis, 또는 chemoattractant의 그라디언트를 마이그레이션 마이그레이션 감독된의 최고의 이해 모드입니다. 연구 사회 아메바를 사용 하 여 Dictyostelium discoideum 공개 병렬 통로의 복잡 한 신호 전달 네트워크 chemoattractants에 대 한 응답을 증폭 하 고 한쪽으로 치우친된 걸 중 합 및에 pseudopod의 돌출은 기온 변화도의 방향입니다. 반면에, 전단 흐름 또는 전기 분야에 노출으로 인해 감독된 이동의 다른 종류를 운전 하는 분자 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. Chemotaxis의 많은 레 귤 레이 터에 선행 또는 후행 가장자리 마이그레이션 셀의 지역화 전시 뿐 아니라 지역화 또는 활성화는 chemoattractant와 함께 글로벌 자극 다음에 과도 변화를 보여. 감독된 이동의 다른 종류의 분자 메커니즘을 이해 하기 우리는 전단 흐름에 간단한 (2-5 s) 노출에 따라 심각한 기계적인 자극에 세포질 응답의 시험을 허용 하는 방법 개발 했다. 이 자극 검사 개별 셀 동작을 붙일 표시 된 바이오 센서를 표현 하는 세포 이미징 하는 동안 채널에 전달할 수 있습니다. 또한, 세포 인구 lysed, 격판덮개 및 관심사의 단백질의 활성 버전을 인식 하는 항 체를 사용 하 여 immunoblotted에 자극 될 수 있습니다. 결합 하 여 두 분석 실험, 하나 변화 subcellular 지 방화 및 인 산화에 의해 활성화 하는 분자의 광범위를 검사할 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 우리가 심각한 기계적인 자극 혈 신호 변환 및 말라 골격 네트워크의 활성화를 유발 결정. 심각한 기계적인 자극에 세포질 응답을 검사 하는 시작 이벤트 전단 흐름 유도 운동에 필요한 이해 중요 합니다. 이 접근은 또한 chemoattractant 수용 체의 혼동 영향 없이 혈 신호 전달 네트워크 연구는 도구를 제공 합니다.
Introduction
진 핵 세포의 용 해 또는 기판 chemoattractants의 그라데이션, 기판, 전기 분야, 또는 전단 흐름의 가변 강성을 포함 한 환경에서 다양 한 화학 및 물리적 신호에 의해 바이어스 이다. 적은 감독된 마이그레이션 및 통합 된 생산 세포 수준에서 이러한 다양 한 신호는 통합 하는 방법의 다른 종류에 대해 알고 있다 비록 많은 발전 chemotaxis를 운전 하는 분자 메커니즘에 대 한 우리의 이해에 왔다, 철새 응답입니다.
지시는 chemoattractant의 증가 농도 쪽으로 이동 세 가지 행동 구성 요소를 포함: 운동 성, 방향 감지 및 극성1. 운동 성 세포 pseudopod 돌출에 의해 달성의 임의의 움직임을 말합니다. 방향 감지는 chemoattractant의 소스를 감지 하는 세포의 능력은에 발생할 수 있는 움직일 수 셀. 극성의 선도 운동에 증가 지 속성에 이르게 셀의 후행 가장자리 사이의 세포내 구성 요소 보다 안정적인 비대칭 분포를 나타냅니다.
chemoattractant에 세포질 응답 4 개념적 정의 규제 네트워크의 활동에 따라 달라 집니다: 수용 체 / G 단백질 신호 변환, 말라 골격, 극성1. Chemoattractant G 단백질 결합 된 수용 체에 바인딩 heterotrimeric G 단백질 α와 방향 신호를 증폭 하류 신호 전달 네트워크에 βγ를 통해 신호를 전송 합니다. 신호 전달 네트워크 내의 여러 경로 동시에 행동 하 고 바이어스 말라 합 하는 기온 변화도의 방향에 따른 pseudopod 돌출 말라 골격 네트워크에 피드. Chemotaxis의 중요 한 레 귤 레이 터 중 고 Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-키 (PI3K), 인산 가수분해 효소 그리고 tensin 동족 체 (PTEN) guanylyl 있고. 피드백 메커니즘 네트워크 내에서 신호 변환 및 신호 변환와 말라 골격 네트워크 추가 응답을 증폭. 마지막으로, 가난 하 게 정의 된 극성 네트워크 말라 골격에서 입력을 받습니다 그리고 더 그라데이션의 방향에 영구 이주를 촉진 하는 신호 변환 네트워크 편견.
많은 chemotaxis의 우리의 기계 이해 되었습니다 규제 네트워크의 다양 한 구성 요소에 대 한 태그 붙일 바이오 센서의 개발 때문에. 많은 chemotaxis 레 귤 레이 터는 비대칭 분포 규제 분자 자체 또는 그것의 활동 중 하나 있다. 예를 들어 바이오 센서 인식 하는 버전의 작은 GTPases Ras 및 Rap1-Raf1 (라고도 RBD 여기)의 Ras 바인딩 도메인 활성화 하 고 RalGDS, chemotaxing 셀2,3의 앞 가장자리에 각각-지역화. 마찬가지로, PI3K 및 그것의 제품 phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), pleckstrin 호몰로지 (PH) 도메인에서 인식 또한 셀4,5의 앞에 지역화를 표시. 반면, 3 인산 가수분해 효소 PTEN는 변환 PIP3 다시 phosphatidylinositol (4, 5)-bisphosphate, localizes6셀 후행 가장자리에. 중요 한 것은, 이러한 바이오 센서는 chemoattractant와 함께 글로벌 자극에 그들의 지 방화를 변경합니다. Cytosolic 또는 후행 가장자리 마커, 대뇌 피 질의 지역화 있고 결 석 한 반면 휴식 셀에 돌출부의 끝에는 피 질 relocalize 첨단 마커 휴식 셀에서 돌출 끝에서 후 cytosolic 될 자극입니다. 바이오 센서는 chemoattractant와 함께 글로벌 자극에 대 한 응답에서 분포의 분석 운동 성 및 극성, 자주 혼동은 관측의 기여를 최소화 합니다. chemoattractant와 셀 서 스 펜 션의 전역 또는 일정 한 자극은 단백질 활성화, 단백질 인 산화7,,89 자주 감지에 인구 전체의 변화를 평가 하는 도구로 사용 된다 . 이 생 화 확 적인 분석 결과 현미경 검사 법은 규제 네트워크의 다양 한 구성 요소 동작에 대 한 시간적, 공간 정보를 수집 하는 데 사용 됩니다 반면 시간적 정보를 얻기 위해 주로 사용 됩니다.
신호 전달 네트워크는 고르기가 시스템10,11의 기능을 통합합니다. 임계값 위에 혈 자극에 응답 "all-or-none"는 고 내 화물 기간을 표시 합니다. 응답 또한 확률론 촉발 하 고 진동 동작을 표시할 수 있습니다. 신호 변환 이벤트 파도12,13,,1415로 전파 하는 피 질 영역에 지역화 됩니다. 정면, 또는 다시, 마커, 채용 또는 전파 파도의 활성 영역에서 해리. 활성 영역을 후행 하는 내 화 지역 때문에 반대로 감독된 파도 그들은 나로 몰 살. 전파 신호 변환 파도 셀 마이그레이션10중재 셀룰러 돌출 기반이 됩니다.
대부분의 chemotaxis에 상기 정보 온 연구에서 사회적 아메바 Dictyostelium discoideum, 유사한 규제 메커니즘 중 성구 및 다른 포유류 세포 유형16 도 있지만 . Dictyostelium 는 단일 세포의 수천 집계 센터, 결국 포자를 포함 하는 다세포 fruiting 몸 형성으로 마이그레이션할 때 기아, 중 강력한 혈 응답을 가진 기초가 튼튼한 모델 생물. Chemotaxis 또한 세균 음식 소스를 찾기 위해이 유기 체의 단일 셀 성장 단계 필수적 이다. 중요 한 것은, 단일 Dictyostelium 세포의 이동은 현저 하 게 포유류 호 중구 또는 전이성 암 세포, 모두의 매우 빠른 amoeboid 형식 마이그레이션 받아야 마이그레이션 비슷합니다. 사실, 규제 네트워크의 두 전체 토폴로지 뿐만 아니라 개별 신호 변환 통로 chemotaxis에 참여의 많은 Dictyostelium 와 포유류 백혈구17사이 보존 됩니다. 게다가, 다른 세포, 섬유 아 세포 등 GPCRs; 대신 수용 체 티로신 kinases (RTK) 사용 그러나, RTKs는 비슷한 네트워크에 피드 수 있습니다.
Chemotaxis, 달리 감독된 이동의 다양 한 다른 모드 드라이브 신호 메커니즘의 철저 한 이해 부족 이다. 마찬가지로 셀 chemoattractant 그라데이션에 마이그레이션에 여러 연구 보고가 활성화 또는 일반적인 첨단 마커, 말라 합, PIP3 이나 extracellular 신호 통제 키 니 아 제 (ERK) 1/2의 지역화에는 전면의 셀 받고 전단 흐름 또는 전기 분야18,19,,2021에 변화에 대 한 응답에서 마이그레이션 지시. 그러나, 이러한 연구에는 자극에 지속적으로 노출 또한 귀착되 었 다 열어두고 질문, 예를 들어 첨단 마커는 자극에 응답에서 특히 지역화 여부 그들은 단순히 첨단에서 지역화 하는 경우 셀 마이그레이션 마이그레이션 셀의 앞에 pseudopods의 증가 수 때문에
우리는 우리가 심각한 기계적 섭 동 및 개별 셀22인구 수준에서 모두 전단 흐름으로 전달에 대 한 셀의 응답을 관찰할 수 있도록 분석 실험 개발. Chemoattractant, 급성 stimula와 글로벌 자극 비슷합니다기의 전단 흐름 운동 성 또는 극성에서 혼란 기여 없이 기계적 자극에 세포질 응답의 연구를 수 있습니다. 어떻게 기계적 자극에 대 한 인식 됩니다 배울 수 있습니다 이러한 생화학 및 현미경 분석 실험 유전 또는 약리학 섭 결합 및 전송. 또한,이 이렇게 또한 chemoattractant 수용 체는 chemoattractant, 따라서 수용 체/G에서 신호 변환 및 말라 골격 네트워크 격리의 부재에서의 다운스트림 시스템에 도청에 대 한 새로운 방법의 제공 한다 단백질 네트워크입니다.
최근 우리가 아래에 설명 된 기술을 사용 하 여 급성 전단 스트레스는 혈 신호 변환 및 말라 골격 네트워크22의 여러 구성 요소 활성화 리드 설명 했다. 다양 한으로 심각한 기계적인 자극을 적용 하 여 우리는, 유사 하 게 chemoattractants, 기계적 자극에 응답 또한 전시에서 응답의 all-or-none 동작을 포함 하 여 고르기가 시스템의 기능 시연 포화 상태 고 내 화물 기간의 존재. 마지막으로, 기계적, 화학적 자극을 결합 하 여 우리는 두 자극 신호 변환 및 말라 골격 네트워크, 바이어스 셀 마이그레이션 여러 자극의 통합 가능성이 허용 공유 보였다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 준비의 솔루션
- 준비 HL-5 미디어 다음을 사용 하 여: 10 g/L 포도 당, 10 g/L proteose 펩 5 g/L 효 모 추출 물, 0.965 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0.485 g/L KH 2 포 4, 그리고 이온된 수에 0.03 g/L 스 별도로 명시 하지 않는 한. 오토 클레이 브는 매체 및 실내 온도에 상점.
참고: 개별 일괄 처리 사이 에서도 proteose 펩과 효 모 추출 물에서 다른 공급 업체, 인수 간의 차이로 인해 미디어의 pH 야 6.4 6.7의 일반적인 범위를 조정할 수. - 준비 SM 접시는 다음을 사용 하 여: 10 g/L 포도 당, 10 g/L 펩, 1 g/L 효 모 추출, 2.31 g/L KH 2 포 4, 1 g/L K 2 HPO 4 및 이온을 제거 된 물 한 천 20 g/L. 압력솥, 냉각, 그리고 10 cm 배양 접시 당 천 솔루션의 30 mL를 붓고. agar 굳은, 일단 최대 1 개월 4 ° C에서 접시를 저장.
- 준비 10 인산 버퍼 (PB) 사용 하 여 x 13.4 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O 및 6.8 g/L KH 2 포 4 이온된 수. 4에서 10 배 재고 저장 사용에 대 한 이온된 수로 1 x ° C. Dilute.
- PB 2 m MgSO 4 m와 0.2 m m CaCl 2 X 1을 보완 하 여 DB 버퍼 준비.
- 이온된 수에 준비 100mm 카페인입니다. 에 저장 − 20 ° c.
- 준비 100 m m 캠프 캠프 나트륨 이온을 제거 된 물에 소금 토스를 용 해 하 여 재고 솔루션. 1mm 이온된 수에 작업을 준비 합니다. 저장에 모두 재고 솔루션 − 20 ° C. 준비 최종 캠프 솔루션 실험 당일 DB에서 원하는 농도에서.
참고: 재고 솔루션 수 동결-해 동 몇 번. - 준비 1 x에서 25 m m 엽 산 PB. 분말이 완전히 해소 될 때까지 1 N NaOH의 몇 방울을 추가 합니다. 에 저장 − 20 ° c.
- 준비는 다음을 사용 하 여 3 x 샘플 버퍼: 187.5 m m Tris HCl pH 6.8, 6% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 30% 글리세롤, 126 m m dithiothreitol과 0.03% (w/v) bromophenol 블루. 약 수 및 저장소에 − 20 ° C.
- 이전 사용, 37 ° C 물 욕조에 녹여 샘플 버퍼 1 x x 3를 diluting 50mm NaF, 2mm 나 3 보 4, 25 m m 나트륨 파이 인산 및 1 x를 추가 하 여 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제와 샘플 버퍼 준비를 진행 하 완전 한 EDTA 무료 protease 억제제 이온된 수에 칵테일. 즉시 단계 3.1.2-3.1.3에 설명 된 절차를 시작 하기 전에 억제제를 추가.
- 5mm DMSO에 Latrunculin A 솔루션을 준비. 약 수 및 저장소에 − 20 ° c.
2. D. discoideum 세포의 준비
참고: HL-5 미디어에서 D. discoideum 세포 조직 배양 접시에서 유지 또는 정지에 문화 앞 23에서 설명한. 필요한 경우 변환 표준 electroporation 프로토콜 24에 따라 붙일 표시 된 바이오 센서와 세포. 다양 한 디 discoideum 변종으로 인코딩 바이오 센서 또는 관심의 다른 유전자를 플라스 미드 Dicty 재고 센터 (dictybase.org)에서 구할 수 있습니다.
- 성장과 식물 디 discoideum 셀의 컬렉션
- 식물 세포의 분석에 대 한 성장에서 일반적으로 관찰 되는 macropinosomes의 수를 줄이기 위해 박테리아의 세포 axenically 성장 세포 25.
- 준비 항생제 없이 HL-5 매체의 원하는 볼륨으로 이전 문화 또는 글리세롤 주식에서 세포의 작은 수를 접종 하 여 Klebsiella aerogenes의 문화. 16-18 헤 실 온 (20-22 ° C)에서 200 rpm (0.42 x g)는 궤도 흔드는에 세균성 문화를 품 어
참고:는 당신부터 K 있습니다. 여기에 사용 되는 aerogenes 긴장은 비 병원 성 (재료의 표 참조).
- 준비 항생제 없이 HL-5 매체의 원하는 볼륨으로 이전 문화 또는 글리세롤 주식에서 세포의 작은 수를 접종 하 여 Klebsiella aerogenes의 문화. 16-18 헤 실 온 (20-22 ° C)에서 200 rpm (0.42 x g)는 궤도 흔드는에 세균성 문화를 품 어
- 조직 문화 접시 또는 현 탁 액 문화에서 지 수 성장 단계에 디 discoideum를 수집 하 고 제조 업체에 따르면 hemocytometer를 사용 하 여 셀 ' s 지시. 1 x 10 5 디 discoideum 셀 260 µ L K. aerogenes 서 스 펜 션 SM 접시에 확산. 다음 날 내려 거꾸로 접시를 설정 합니다. D. discoideum 세포 세균 잔디밭을 지우기 시작 때까지 하지만 집계 시작 하기 전에 실내 온도에 세포를 성장 (36 ~ 48 h).
- 수집 D. discoideum 셀 5 mL DB 버퍼 유리 분산기와 된다고 하 여. 50ml 폴 리 프로필 렌 튜브에 세포를 전송. 또 다른 5 mL DB 버퍼와 접시 및 원래 서 스 펜 션 수영장 린스. DB 버퍼에 채워 50 ml 튜브.
- 분리기 360 x g 디 discoideum 정지 3-4 분은 상쾌한 발음 및 50 mL에 펠 릿을 resuspend DB 버퍼. 세척 단계는 상쾌한 때까지 취소 (세척 ~ 3 ~ 4)를 반복 합니다. ~ 6 셀/10ml x 5의 최종 밀도에 DB 버퍼에서 최종 셀 펠 릿 resuspend.
- 식물 세포의 분석에 대 한 성장에서 일반적으로 관찰 되는 macropinosomes의 수를 줄이기 위해 박테리아의 세포 axenically 성장 세포 25.
- 집계의 준비-유능한 D. discoideum 셀
- 개발 디 discoideum 표준 마다 6 분 뒤에 기아와 50 nM 캠프와 펄스의 4 h 1 h 기아에 의해 세포 프로토콜 23.
- 개발, 다음 셀 서 스 펜 션의 최종 부피를 측정.
- 개발 작업에 사용 하는 셀의 초기 수에 마지막 정지의 셀 밀도 계산.
참고: 만약 캠프 마다 6 분 100 µ L 볼륨에 전달 됩니다, 셀 볼륨 증가 1 mL에 의해 캠프 펄스의 모든 시간에 대 한. 따라서, 8 x 10 7 셀 DB의 4 mL를 사용 하 여 표준 조건에 대 한 개발의 4 h 후 최종 볼륨 7 mL 이며 마지막 셀 밀도 ~1.1 x 10 7 셀/mL.
3. 생 화 확 적인 분석의 셀에 대 한 응답 기계 또는 화학 자극
- 플레이트 2 x 10 6 집계 유능한 심각한 기계적인 자극의 셀 뒤 세포 세포 세포 (2.2 단계) 후의 4 h 2 mL DB와 함께 35 mm 요리에서 개발. 실 온에서 10 분 동안 연결할 셀 수 있습니다. 셀 1 mL DB와 두 번 씻는 다. 2.5 m m 플레이트의 어떤 소요도 없이 30 분 동안 카페인 셀 DB에 품 어.
참고: 셀 약리 억제제로 치료를 해야 하는 경우 추가 억제제의 원하는 농도 또는 적절 한 차량 같은 양의 카페인으로 basalation 동안.
기계적 자극, 적용할 - 접시 (한 번에 하나씩)에 궤도 통 놓고 즉시 150 rpm (0.24 x g) 5에 그것을 설정 s.
참고: 접시도 자극 될 수 수동으로 운동에 의해 약 5 cross-wise 방식에서 s. - Aspirate 버퍼에 제시 된 자극의 시작 후 시간. 바로 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제와 100 µ L 견본 버퍼를 추가 하 여 세포를 lyse.
- 얼음, 접시 놓고는 lysate 1.5 mL 튜브에 수집 합니다. 대 한 ' 시간 0 ', 동요 하지 않고 세포를 lyse. 세포의 용 해 후 즉시 10 분 동안 95 ° C 열 블록에 튜브를 전송. Immunoblotting 진행 또는 저장 lysates-20에 ° c.
- 플레이트 2 x 10 6 집계 유능한 심각한 기계적인 자극의 셀 뒤 세포 세포 세포 (2.2 단계) 후의 4 h 2 mL DB와 함께 35 mm 요리에서 개발. 실 온에서 10 분 동안 연결할 셀 수 있습니다. 셀 1 mL DB와 두 번 씻는 다. 2.5 m m 플레이트의 어떤 소요도 없이 30 분 동안 카페인 셀 DB에 품 어.
- 자극의 세포는 Chemoattractant와
- 빠르게 30 분 동안 궤도 셰이 커에 5mm 카페인 200 rpm (0.42 x g)의 면 전에 서 그들을 흔들어 집계 유능한 세포 개발의 4 h 후 Basalate.
3-4 분에 대 한
- 분리기 세포 현 탁 액 360 x g는 상쾌한 발음 및 펠 릿 10 ml에서 resuspend 얼음 DB 버퍼. 세척 단계를 반복 합니다.
- 4 x 10 7 셀/ml (단계 2.2 참조) 셀을 개발 하는 데 사용 하는 초기 휴대폰 번호에 따라 최종 밀도에 얼음 처럼 차가운 DB 버퍼에서 최종 셀 펠 릿 resuspend. Stimul 이전 얼음에 세포 현 탁 액을 유지ation입니다.
- 궤도 셰이 커에 피 펫 50 µ L 10 µ M 캠프 또는 폴리스 티 렌 컵으로 차량 배치.
- 세포를 자극, 같은 컵에 얼음 세포 현 탁 액의 450 µ L을 추가 하 고 즉시 200 rpm (0.42 x g) 흔드는 설정. 여러 번 자극의 시작 후에 (예: 10, 30, 45, 60, 120 s), 잠시 중지 흔드는, 세포 현 탁 액의 50 µ L aliquots에 밖으로 하 고 샘플 버퍼 X 25 µ L 3를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 추가 하 여 세포를 lyse.
- 위한 ' 시간 0 ', unstimulated 얼음 세포 현 탁 액에서 세포를 사용 하 여.
참고: 자극 동안 세포 현 탁 액의 최종 온도 26 ~ 9 ° C. 이러한 조건 하에서 피크 응답 피크 (chemoattractant, 현미경에 부착 세포의 자극 또는 부착 세포의 기계적 자극 등) 실 온에서 수행 하는 자극에 대 한 관찰 보다는 약간 늦게 발생 합니다.
- 빠르게 30 분 동안 궤도 셰이 커에 5mm 카페인 200 rpm (0.42 x g)의 면 전에 서 그들을 흔들어 집계 유능한 세포 개발의 4 h 후 Basalate.
3-4 분에 대 한
- 세포 직후 10 분 동안 95 ° C 열 블록에 튜브를 전송. Immunoblotting 진행 또는 저장 lysates-20에 ° c.
- 4-15% Tris HCl polyacrylamide 젤에 lysates (3.1.3 또는 3.2.4 단계)에서 실행, polyvinylidene 불 소 막, 블록, 그리고 인 PKC와 immunoblot에 전송 Ζ (및 검출 하기 위하여 인 PKBR1 인 PKBA) Thr410. 양 고추냉이 과산화 효소 활용 반 토끼 이차 항 체, 화학 향상 된 화학 기판을 사용 하 여 뒤를 가진 외피에 의해 신호를 감지.
- 여러 단백질의 검출, 스트립 버퍼, 오 점 벗기고 다시 1 차 항 체에 대 한 인-p42/44 MAPK Thr302/304 (인-ERK2 감지)를 가진 조사. 동일한 단백질 얼룩 Coomassie 화려한 블루 polyvinylidene 불 소 막 여 로드 확인.
4. 급성 기계적 자극과 라이브 이미징의 단일 셀 현미경
- 흐름 장치를 사용 하 여 심각한 기계적인 자극에 응답의 평가
- 수집 및 식물 또는 집계 유능한 희석 1 ~ 6 셀/10ml db 각각 2.1, 2.2, 단계에 설명 된 대로 x 셀. 채널 슬라이드에 ~ 600 µ L 로드 (자세한 내용은 재료의 표 참조). 모든 슬라이드에 후미의 완전히 가득 해야 10 분 연결할 셀 수 있습니다. 필요한 경우 추가 버퍼와 최대 최고.
참고: 특정 슬라이드 분석에 사용 되는 좁은, 1 mm 채널로 피드 하지만 다음 병합 한 넓은, 3 m m 채널을 3 개의 입력. 채널의 높이 0.4 m m입니다. 넓은 부분에만 몇 군데 있지만 세포는 채널에 걸쳐 도금,. - 유체 단위의 전면 오른쪽 밸브를 통해 50 mL 저수지에 연결 된 줄 중 하나를 전달 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료를 참조). 밸브가 닫혀 있는지 확인 펌프에 대 한 소프트웨어를 사용 하 여 (즉, 왼쪽). DB로 저수지를 채우십시오.
- 50 mbar에서 압력을 설정 하 고 그것을 켭니다. 작성 하 고 DB와 라인 밸브 열기를 클릭 하 여 씻어. 압력을 0으로 다시 설정 하 고 ~ 30 후 밸브를 닫습니다 s.
- 트래핑 어떤 기포 없이 한 슬라이드의 1 개의 측에 3 개의 후미의 라인 연결. 다른 두 후미를 연결 합니다. 슬라이드의 두 번째 측면에 단일 입구에는 배수에서 선을 연결.
참고:이 설치 프로그램에서 입력 및 드레인 라인에 사용 되는 튜브는 1.6 m m의 내부 직경. - 20 X 어 목표 아래 현미경에 슬라이드를 놓습니다. 채널을 씻어, 하는 라인을 열고 클릭을 밸브 전환 " 압력에 ", 더 높은 압력 (~ 50 mbar 또는 40 dyn/cm 2) 드레인을 액체를 밀어 시작.
- 액체 드레인 온다, 일단 0으로 외부 압력을 감소 (즉. 중력 흐름, ~ 15 dyn/cm 2), ~ 30 s. 스위치에 대 한 흐름을 중지 하려면 반대 위치에 밸브 rinsing 계속.
- 3 s 간격 오일 목표 X 40에서 거꾸로 형광 현미경에 RFP 또는 GFP 조명 이미지. 닫힌된 위치에서 밸브 설정 압력 일반적으로 사이 15 그리고 40 dyn/cm 2 원하는 압력 (0-50 mbar).
- 5 프레임, 인수 후에 밸브를 전환 하 여 자극을 제공 합니다 " 열 " 위치. 해제 흐름 2-5 s 후 전환 밸브 반대 방향으로 하 여.
참고: 특정 약한 바이오 센서 (예: PTEN, CynA, 및 RalGDS)에 대 한 그것은 해야 할 수 있습니다 오일 목표 X 40을 갖춘 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지 셀.
- 수집 및 식물 또는 집계 유능한 희석 1 ~ 6 셀/10ml db 각각 2.1, 2.2, 단계에 설명 된 대로 x 셀. 채널 슬라이드에 ~ 600 µ L 로드 (자세한 내용은 재료의 표 참조). 모든 슬라이드에 후미의 완전히 가득 해야 10 분 연결할 셀 수 있습니다. 필요한 경우 추가 버퍼와 최대 최고.
- 흐름 장치를 사용 하 여 심각한 기계적인 자극에 응답에 약리 억제제의 효과 테스트
- 4.1.1 단계에 설명 된 대로 채널 슬라이드에 세포 격판덮개. 두 줄 설정: 4.1.2, 단계에서 전면 오른쪽 밸브를 통해 한 줄을 통과 뒷면을 통해 두 번째 왼쪽 밸브. 왼쪽된 라인 클램프 그리고 밸브는 " 닫힌 " (왼쪽된) 위치. 관심 (예: 5 µ M Latrunculin A)의 약리 억제제를 포함 하는 솔루션으로 적절 한 차량, 그리고 두 번째를 포함 하는 DB와 한 줄을 채우기.
참고: 그것은 때문에 왼쪽된 라인을 물리적으로 클램프 하는 데 필요한는 " 닫힌 " 왼쪽된 위치 그 라인에 대 한 밸브를 엽니다. - 채우기 및 린스 오른쪽 라인에서 50 mbar 압력 설정 하 고 전환 밸브를 여는 " 열 " (오른쪽) 위치. 전환 밸브 왼쪽 후 ~ 30 s. 채우기와 왼쪽된 라인 ~ 30 미 연결에 대 한 클램프를 제거 하 여 씻어 두 채널 슬라이드의 1 개의 측에 후미의 두 라인, 나머지 입구를 연결 하 고 두 번째 측면. 단일 입구에 드레인을 연결 < /l 난 >
- 오른쪽 라인에 해당 버퍼와 함께 슬라이드를 세척 하 고 4.1.3와 4.1.4 위의 단계에서 설명한 대로 동일한 버퍼에 자극을 수행.
참고:이 설치 프로그램에서 첫 번째 오른쪽 라인 선정 되었다, 비록 순서 수 바꿀 수. - 자극, 다음 제로 압력 (즉 중력 흐름만, ~ 15 dyn/cm 2)에서 오른쪽 라인을 열고 밸브를 전환. 왼쪽된 라인에서 클램프를 제거 하 고 그 라인을 열고 왼쪽에 밸브를 전환. 첫 번째 줄을 클램프.
- 통해 억제제와 버퍼의 3-5 mL를 실행 한 후 전환 밸브, 흐름을 중지 하려면 오른쪽 하 고 필요한 시간 길이 대 한 억제제와 셀을 품 어 (예: 15 분). 전환 밸브 매 ~ 10 분 ~ 15에 대 한 흐름을 켜고 산소 박탈을 방지 하기 위해 s. 두 번째 줄에와 함께 자극을 반복.
- 4.1.1 단계에 설명 된 대로 채널 슬라이드에 세포 격판덮개. 두 줄 설정: 4.1.2, 단계에서 전면 오른쪽 밸브를 통해 한 줄을 통과 뒷면을 통해 두 번째 왼쪽 밸브. 왼쪽된 라인 클램프 그리고 밸브는 " 닫힌 " (왼쪽된) 위치. 관심 (예: 5 µ M Latrunculin A)의 약리 억제제를 포함 하는 솔루션으로 적절 한 차량, 그리고 두 번째를 포함 하는 DB와 한 줄을 채우기.
- 는 micropipette를 사용 하 여 심각한 기계적인 자극에 응답을 평가 하기 위해 다른 방법
- 표준 프로토콜 23에 따라 DB로 가득 micropipette 설정. 1500 psi에서 보상 압력 유지.
- 수집 하 고 단계 2.1에에서 설명 된 대로 식물 세포를 희석. 장소 25 µ L 방울 ~7.5 x 10 5 셀/mL 1 잘 실에서 10 분 이상 준수 그리고 3 mL DB 커버 허용.
- 40 X 오일 목표를 갖춘 거꾸로 형광 현미경에는 챔버를 놓습니다. 셀을 찾습니다. 처음 챔버의 하단을 터치 될 때까지 보기의 필드의 중간에는 micropipette를 부드럽게 내립니다.
참고: 1500 Psi에서 보상 압력 설정 이후 셀 지속적으로 노출 될 DB의 매우 느린 흐름에는 micropipette에서. - 시작 RFP 또는 GFP 조명 3 s 간격으로 이미지를 취득 합니다. 적용은 ' 클린 ' 함수는 micropipette에서 액체의 bolus 출시. 내가 이미징 계속n 혼자 보상 압력 흐름의 존재.
- 대량 버퍼 추가 사용 하 여 심각한 기계적인 자극에 응답을 평가 하는 다른 방법
- 수집 및 단계 2.1에에서 설명 된 대로 식물 세포를 희석. 장소 20 µ L ~ 1 x 10 6 셀/mL db에서 8 잘 실에서 잘 중간에 셀의 삭제합니다. 적어도 10 분에 대 한 준수를 셀 수 있도록
- 시작 3 s 간격 40 X 목표를 갖춘 거꾸로 형광 현미경에 RFP 또는 GFP 특정 조명 이미지를 취득 합니다. 드롭의 가장자리에 가까운 지역에 초점.
- 급속 하 게 우물의 1 개의 측에 DB의 430 µ L를 추가합니다. 계속 영상.
- 기계적, 화학적 자극 사이 상호 작용의 분석, 기계적 자극, 다음 12 또는 45 s 부드럽게 추가 엽 산 (최종 농도 20 nM) 또는 차량 (DB)의 50 µ L 기계 응답 유도 없이. 계속 영상.
- 정량화의 응답
- 이미지 분석 소프트웨어에서 32 비트 TIFF 이미지를 열고 (자세한 내용은 참조 테이블의 자료) 27.
- 아래는 ' 분석 ' 탭, 이동 " 설정 측정 ". 확인란에 대 한 ' 회색 값 의미 '. 다른 상자는 선택 하지 있는지 확인 합니다. 클릭 " 확인 ".
- 아래는 ' 프로세스 ' 탭, 클릭 " 배경 빼기 ". 50 픽셀, 롤링 볼 반지름을 유지 하 고 옵션 메뉴에 나열 된 확인 하지 마십시오. 한 셀을 사용 하 여 확대는 ' 돋보기 ' 도구.
- 사용 하는 ' 사각형 ' 도구, 핵 또는 원형질 막 그려 하지 않도록 만들기 cytosol에서 상자 x 2.5 µ m 2 (~2.5)를 그립니다. 보도 " Ctrl " + " M " 키 또는 이동은 ' 분석 ' 탭을 클릭 " 측정 " 상자의 평균 회색 값을 결정 하. 프레임을 다시 측정 사전 상자를 확인 하는 cytosol에서 숙박.
참고: 이후 디 discoideum 셀 매우 빠르게 이동 상자 이동할 수 있습니다 한 프레임에서 다음는 cytosol에서 그것을 유지. - 결국 프레임의 분석 된, 스프레드시트에 값 복사. 다양 한 바이오 센서의 식 수준에 셀 변화에 대 한 계정에 시간 0에서 평균 회색 값에 대 한 값을 정상화. 피 질에 신호의 축적을 반영 하기 위해 값의 상호 계산.
5. 지속적인 기계적 자극과 라이브 이미징의 단일 셀 현미경
- 세포에 심각한 기계적인 자극 분석 단계 4.1.1-4.1.3에서에서 위에서 설명한 대로 정확 하 게 설정. 한 번에 몇 분 이상 응답을 분석 하는 경우 볼륨을 얹어 될 수 있도록 해당 버퍼와 함께 저수지를 덮고 플러그를 열고.
참고: 때문에 저수지는 실험 기간 동안 열려,이 분석 결과 외부 압력의 부재에 진행 되며 혼자 중력 흐름에 의존. 중력에 의해 흐름의 속도 증가, 드레인 현미경 아래 테이블에 배치할 수 있습니다. - 는 바이오 센서 응답의 분석을 위한 3 s 간격 40 X 목표를 갖춘 거꾸로 형광 현미경에 RFP 또는 GFP 특정 조명 세포 이미징 시작. 또는 전체 셀 이동의 분석을 위해 10 s 간격 20 X 목표를 사용 하 여 단계 대조 이미지.
- 흐름 0 압력 설정에서 여러 프레임 후 설정 (즉, 흐름은 중력 혼자 또는 ~ 15 dyn/cm 2) 전환 밸브를 열림 위치로 하 여. 액체의 수준 떨어지는 저수지에서 5-10 mL 때 더 많은 버퍼 가기. 공기 방울 라인에 갇혀 얻을 하지 않습니다 그래서 신중 하 게 액체를 추가할 수 있는지 확인.
참고: 그것은 세포에서 충격 응답을 피하기 위해 동일한 온도의 액체를 추가 하는 것이 중요. - 셀 속도 지 속성 마이그레이션 분석 소프트웨어를 사용 하 여 계량 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료를 참조) 제조 업체에 따르면 ' s 지침.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
심각한 기계적인 자극 chemotaxis 레 귤 레이 터의 시간 응답
D. discoideum 세포의 기계적 자극에 응답을 평가 하기 위해 부착 집계 유능한 세포 전단 흐름의 짧은 펄스에 노출 되었다. 집계 유능한 D. discoideum 세포 분 비 캠프, 이웃 세포에 의해 감지 될 수 있습니다. 극복 하기 위해-셀 신호의 기여, 셀 디 discoideum 에서 adenylyl 있고 억제을 따라서 캠프 분 비28방지 카페인 치료 했다. 실제로, 셀으로 미리 치료 카페인 ERK2, PKBR1의 매우 낮은 기저 활동 했 고 이러한 kinases 5 s 자극 전단 흐름 (그림 1A)와 다음의 주요 잔류물의 인 산화에 강력한 증가 보였다. 반응은 과도 하 고 주위 정점 PKBR1, 및 30 주위 10-15 s s ERK2, 마찬가지로 이전 연구 결과 발표 chemoattractant7이 단백질의 활성화를 위한.
비록 낮은 기저 수준,이 분석 결과의 개발을 주도 하는 예비 연구를 고려 하는 응답의 효율성을 평가 하기가 비교할 전단 흐름 자극 (또는 차량) 혼자 전단 흐름의 존재는 chemoattractant 야영지 (그림 1B)입니다. 이 분석 전단 흐름에 신호 전달 네트워크의 응답 포화 제안 캠프에 대 한 응답 증가 보여주지 않았다. 이 분석 결과에서 캠프는 PKBR1의 인 산화를 증가 하지 않았다, 비록 chemoattractant 세포의 응답 수 있습니다 수 관찰 집계 유능한 세포 현 탁 액에 유지 됩니다 표준 자극 프로토콜을 사용 하 여 캠프, 자극 다양 한에서 lysed 포인트 자극 다음 시간. 그림 1C에서 같이, 이러한 조건 하에서 있다 chemoattractant, 하지만 하지 차량에 대 한 응답에서 PKBR1 인 산화에 일시적인 증가. 피크 응답 30에 관찰은이 분석 결과에 s26위에서 설명한 기계적 자극 분석 결과 대 한 ~ 22 ° C에 비교 하는 분석 결과 중 세포 현 탁 액의 온도 ~ 9 ° C, 때문에.
선행 및 후행 가장자리 마커 심각한 기계적인 자극의 spatiotemporal 응답
위의 인구 분석 결과 chemotaxis 레 귤 레이 터의 동작에 대 한 임시 정보를 제공 하므로 셀 현미경으로 관찰 되는 동안에 간단한 기계적 자극에도 노출도 되었다. 집계 관할 또는 식물이 분석 결과 수행할 수 있는 다양 한 붙일 표시 된 바이오 센서는 chemoattractant와 자극된 셀에 정의 되어 있는 그 지역화를 표현 하는 디 discoideum 셀. 2 개의 첨단 마커, Crac와 라임Δcoil의 전화 도메인 PIP3 또는 새로 생산 걸 모집을 둘 다 보였다 cytosolic 지역화 주로 휴식 셀에 이전에 보고 된 (그림 2A, 보충 영화 1 )294,. Basally 활성화 셀에이 바이오 센서는 pseudopods의 팁에도 볼 수 있었다. 2 전단 흐름 자극에 따라 s, 빠르게 ~ 6 ~ 10에서 피크와 피 질 relocalized 바이오 센서 s, ~ 30는 cytosol에 반환 s. 반면, 후행 가장자리 마커 PTEN 자극 (그림 2A) 전에 피 질에서 지역화. 후 전단 흐름 짧은 펄스, cytosolic PTEN 강도 증가, 첨단 바이오 센서에 대 한 보다 느린 역학와 함께 쓰 신. 바이오 센서는 cytosol에서 지역화에 변화 피 질, 그리고 그 반대도 명확 하 게 볼 수 있다 변화 응답의 간단한 정량화에 대 한 허용 cytosolic 강도에.
급성 기계적 자극에 대 한 응답에서 바이오 센서의 관찰 된 행동은 선행 및 후행 가장자리 지역화 역학 균일 한 chemoattractant와 자극에 대 한 응답에서 일치 합니다. 이 동작은 표시 된 3 개의 바이오 센서에 고유한 아니었다. 지역화에 이전, 비슷한 변화 또한 첨단 마커 RBD 및 RalGDS에 대 한 관찰 했다, 인식 하는 활성화 Ras Rap1, 뿐만 아니라, 각각 다른 지체 지 마커 CynA22,30에 관해서는.
유사한 분석 결과 이중 한 단일 입력된 라인에서 실험적인 체제의 간단한 수정에 의해 다양 한 억제제의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 셀 수 제어 조건에 처음 노출 되며 원하는 테스트 에이전트를 포함 하는 버퍼 다음 전환. 예를 들어 걸 depolymerizing 마약 달의 추가 RBD, 응답 차단 뿐 아니라 라임Δcoil, 급성 기계적 자극 (그림 2B).
글로벌 응답 앞 전단 흐름 장기간된 자극 아래 셀 마이그레이션
여기서 설명 하는 접근 또한 D. discoideum 마이그레이션에 전단 흐름의 효과 연구에 적용할 수 있습니다. 사실, 흐름 2 후 차단 했다 s 그러나 실험 동안에 남아, 식물 세포 (그림 3보충 영화 2) 흐름에 대 한 마이그레이션 지시 했다. 철새 응답을 유도 하는 데 필요한 전단 흐름은 일반적으로 (예를 들어에서 보듯이 그림 2B) 식물 세포에 급성 자극 글로벌 응답을 달성 하는 데 사용 된 압력 보다 낮은 주목 한다. 그러나, 낮은 압력 에서도 셀 라임Δcoil 지역화, 세포 자체의 위치에 어떤 변화를 앞에 변화에 의해 측정으로 강력한 균일 한 응답 표시. 따라서, 이러한 실험은 명확 하 게 1) 글로벌 응답, 세포의 운동에 의존 하지 않습니다과 2) 글로벌 응답 앞에 감독된 마이그레이션 보여주었다.
심각한 기계적인 자극에 응답을 테스트의 대체 방법
흐름을 통해 챔버를 사용 하 여 심각한 기계적인 자극에 응답의 연구에 대 한 명확한 이점이 있다, 하지만 우리 또한 개별 셀의 심각한 기계적인 자극에 응답을 테스트 하기 위한 두 개의 추가 분석 실험 검증. 그림 4에서처럼 라임Δcoil 신속 하 고 뚜렷이 다시 지역화는 cytosol에서 피 질 세포 (그림 4A) micropipette 여 배달 또는 대량을 사용 하 여 수동으로 버퍼의 bolus 추가 의해 자극 했다 때 피 펫 (그림 4B)와 버퍼 또한. 그것은 그는 분명이 분석 실험의 단점은 셀을 전달 하는 전단 력의 정확한 금액 알, 그리고 쉽게 변화 될 수 없습니다 주목 해야한다. 그러나, 전환 기계적, 화학적 자극을 원하는 경우, 대량 버퍼 추가 흐름 장치에 자극에 고체 대안을 제공 합니다.
그림 1: 대표 급성 기계적 또는 화학적 자극 하 디 discoideum 세포의 응답의 생 화 학적 평가 대 한 결과. 집계 유능한 세포 기계적 또는 화학적 자극에 노출 됐다표시 시간 점에서 lysed 및 인식 하는 항 체를 사용 하 여 immunoblotted PKBR1 또는 ERK2 phosphorylated. (A) 5 궤도 통에 부착 한 세포 자극 했다 s. 막와 Coomassie 화려한 블루 (CBB) 같은 단백질 로딩 표시 얼룩 했다. (B) 부착 한 세포는 약 5 s 다음에 대 한 cross-wise 방식으로 접시의 수동 운동에 의해 자극 했다 때문에 또한 1 µ M 캠프 또는 버퍼 (차량), 또는 어떤 화학 자극 (-) 없이 화학 자극. 두 immunoblots 시간 0에서 PKBR1의 기저 활성화에 변화의 범위를 표시 합니다. 때때로, PKBA 활성화 수 또한 검출 될이 기술에 의해 하단 패널에 표시 된 대로. (C) 현 탁 액 셀 1 µ M 캠프와 버퍼 (차량) 자극 했다. 이 그림의 일부 (A) Artemenko 외에서 수정 되었습니다. (2016) 22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 심각한 기계적인 자극 및 현미경에 단일 셀의 라이브 이미징 결과. (A) 집계-유능한 D. discoideum 세포 표현 RFP 태그 라임Δcoil또는 PH-Crac GFP 태그 또는 PTEN 15 dyn/cm2 단방향 층 류와 2-5 미 이미지 수집 모든 3에 대 한 자극 했다 s . 기계적 자극에 대 한 응답에는 바이오 센서의 전 좌를 보여주는 대표적인 셀 표시 됩니다. 피 질에서 각 바이오 센서의 축적 시간 0에 대 한 정규화 의미 세포질 강도의 역으로 정량 했다. 18 (라임Δcoil), 20 (PH-Crac) 또는 6 (PTEN) 세포의 평균 응답에 표시 됩니다. 값은 ± SE. (B) 식물 세포 RFP 태그 라임Δcoil표현 의미는-RFP 및 GFP 태그 RBD 차량 또는 5 µ M로 치료 했다 달 적어도 15 분, 그리고 다음 2 41 dyn/cm2 단방향 층 류와 자극 s. 이미지 수집 된 모든 3 s. RBD GFP와 피 질에 라임Δcoil-RFP 축적 (A)와 같이 계량 했다. 값은 평균 ± SE. 분석 하는 셀의 수는 각 상태 옆에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림 Artemenko 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. (2016) 22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표는 디 discoideum 세포의 응답에 대 한 검색 결과 흐름 장기간된 자극을. RFP 태그 라임Δcoil 15 dyn/cm2 연속 단방향 층 흐름에 노출 됐다 고 모든 3 s. 트랙 11 셀의 이미지를 표현 하는 (A) 식물 세포 (B)에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림 Artemenko 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. (2016) 22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표 심각한 기계적인 자극에 응답을 테스트 하는 대체 방법에 대 한 결과. (A) 식물 디 discoideum 세포 표현 RFP 태그 라임Δcoil basally 느린 속도로 분석 결과 버퍼를 해제 (*)는 micropipette에 노출 됐다. 유량에 대 한 간략 한 증가 했다 분석 결과 버퍼의 bolus의 신속한 배달 시간 0에서에 달성 됩니다. 이미지 수집 된 모든 3 미 (B) 식물 디 discoideum 셀 RFP 태그 라임Δcoil 현미경 챔버에 작은 방울으로 도금을 표현 했다 기계적으로 버퍼의 큰 볼륨의 추가 의해 자극 하는 약 실입니다. 이미지 수집 된 모든 3 규모 s. 바 = 10 µ m.이 그림의 일부 (A)는에서 수정 된 Artemenko 외. (2016) 22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
추가 동영상 1: 급성 기계적 자극 유발 라임Δcoil의 신속 하 고 일시적인 전 좌-RFP 또는 PH-Crac-GFP는 cytosol에서 집계 유능한 D. discoideum 에 피 질 세포이 바이오 센서를 표현. 단방향 층 흐름 설정 위한 5 시간 0에서 s와 셀 3 s 간격에 몇 군데 있었다. 재생 속도 5 프레임/s입니다. 각 셀 라인에 대 한 두 가지 예제는 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 영화 그림 2A 와 Artemenko 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. (2016) 22. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
추가 영화 2: 지속적인 기계적 자극 유발 라임Δcoil의 신속 하 고 일시적인 전 좌-RFP는 cytosol에서 흐름의 방향에 대 한 셀의 마이그레이션 전에 피 질. 식물 셀 라임Δcoil표현-RFP 15 dyn/cm2 시간 0에 시작에서 연속 전단 응력에 노출 되었고 3 s 간격으로 몇 군데. 재생 속도가 10 프레임/s의 규모 바 = 10 µ m. 이 영화 그림 3 에 해당 하며 Artemenko 외. 이전 게시 되었습니다. (2016) 22. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명 된 방법 인구와 개별 셀 동작 응답에서 전단 흐름을 평가 하는 편리한 방법을 제공 합니다. 중요 한 것은, 이전의 연구 선도 및 마이그레이션하는 동안 가장자리 마커를 후행의 지역화 분석 하는 동안 현재 접근 심하게 전단 흐름을 적용 하 여 즉각적인 효과의 조사를 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 우리는, 사실, 전단 흐름을 셀의 초기 응답 하지 않아도 셀 마이그레이션 시연 했다. 대신, 초기 전단 흐름 자극에 신속 하 고 과도 응답 전단 흐름, 유사 하 게 chemoattractant 그라데이션으로 본 초기 글로벌 응답에 장기간된 노출으로 본 방향 마이그레이션 보다 우선 합니다.
생화학 및 미세한 접근도 불구 하 고 각 방법에는 고유한 장점과 단점 보완 데이터 양보. 세포 세포의 용 해 및 PKBs, KrsB, 및 ERK, immunoblotting 자극은 예를 들어 셀의 전체 인구를 분석 하 고 따라서 개별 셀 동작 검사 분석 결과는 달리 셀 유사 평균. 그러나, 인구 기반 분석은 개별 셀을 분석 하 여 쉽게 관찰 될 수 있다 세포 행동에 마스크 미묘한 변화 경향이 있다. 또한, 여기에 설명 된 생 화 확 적인 분석 결과가입니다만 집계 유능한 세포와 효과적인 이유는 나중에 설명 합니다. 대조적으로, RBD, RalGDS, PH Crac, 라임Δcoil, 및 PTEN, relocalization의 현미경 기반 분석 결과 예를 들어 피 질 사이 cytosol 식물 및 집계 유능한 세포에 대 한 효과적 이며 따라서 수 관찰에 대 한 그는 셀 분극의 다양 한 각도 광범위 하 게 적용 됩니다. 두 가지 방법을 보완 하 게 그들은 사용 가능한 선행/후행 가장자리 마커, 따라서 전단 흐름 분석 결과 함께 테스트 신호 변환 및 말라 골격 네트워크의 범위를 확대의 다른 세트를 검사 하는 사실 이다.
그것은 매우 엄격 하 게 현미경 기반 분석 실험에 대응, 식물 세포 세포 세포의 용 해 및 immunoblotting 자극에 응답 하지 않는 왜 불분명 남아 있습니다. 1 개의 가능성은 접시 회전 하는 경우 셀에 적용 하는 전단 력의 양이 흐름 챔버에 세포에 의해 발생 하는 힘을 일치 하지 않습니다. 개발된 세포, 대조적으로, 활성화에 대 한 낮은 임계값을가지고 되 고, 따라서, 어느 조건 하에서 반응. 그것은 가능성이 그 활동은 생 화 확 적인 분석 실험에 의해 측정 바이오 센서 표현 되지 않는다 또는 엽 산 식물 세포의 자극의 PKBR1/PKBA 그리고 ERK2 강력한 활성화에 이르게 이후 식물 세포에서 활성화 되지 않습니다 (데이터 하지 표시). 또한, 식물 세포 현미경 기반 분석 결과에서 PIP3 축적을 반영 하는 PH Crac의 명확한 모집을 보여줍니다. 생 화 확 적인 분석 실험에서 조건 위에서 언급 한 최적 되지 않는 PKBA 모집 또한 PIP3에 따라, 이후 그것은 PKBA 심각한 기계적인 자극에 응답 하지 않을 것 이다 확률이 낮게 보인다. 이 활성 조사의 지역에 남아 있다.
Chemotaxis 레 귤 레이 터의 생 화 확 적인 분석 실험을 통해 카페인의 존재를 필요합니다. 원래 카페인 셀을 캠프의 분 비로 인해 신호를 방지 하기 위해 추가 되었습니다. 그러나, 그것은 카페인은 adenylyl 있고 (ACA)의 억제 외 다른 역할 ACA null 셀 여전히 응답에 PKBR1의 인 산화에 대 한 카페인 데 필요 심각한 기계적인 자극에 나타납니다. 카페인을 이전 TorC2 활동26차단 하도록 표시 되었습니다. 그것은 TorC2의 억제는 세포의 일부 기초 운동 차단 따라서 PKBR1의 기저 활성화 및 신호 변환 및 말라 골격 네트워크의 다른 구성 요소를 인하 가능. 낮은 기저 활동 전단 흐름에 대 한 응답을 관찰 하는 것이 필수적 이었다. 사실, 세포는 개발 하는 동안 이전 시간 지점에서 수집 된, 그들은 표시 기저 활동 증가 감소 전단 흐름에 유도 된 응답. 흥미롭게도, 식물 세포가 비례적으로 더 PKBA 활동 및 적은 PKBR1에 비해 개발 셀31알려져 있다. 그것은 기저 상태 식물 및 집계 유능한 세포에 다소 다르게 규제는 가능한 더 생 화 확 적인 분석 결과에서 식물 세포의 응답의 부족에 기여. 호기심 때 셀 개발의 이후 지점에서 수집 된, 그들은 또한 지역화에 극성의 강한 영향 및 다양 한 chemotaxis 레 귤 레이 터가 분석이 결과에서 시험의 활성화 가능성이 감소 응답을 했다.
현미경 챔버에 세포의 자극 강도 및 자극의 기간이 최대한 응답22에 기여 공개. 즉, 최대한 응답 달성 될 수 있다 낮은 전단 힘으로도 시간의 연장된 기간 동안 적용 되는 경우 (10 2 대 s s). 이 관찰 그들은 먼저 전단 흐름 유도 마이그레이션 하는 지속, 하지만 약한, 자극에 노출 되 면 세포 초기 글로벌 응답을가 왜 설명 합니다. 현재 장치 함께 우리 조사 범위의 낮은 끝에 충분히 낮은 전단 흐름을 생성 하지 못했습니다.
아마도, 심각한 기계적인 자극을 사용 하 여 실시 하는 연구의 가장 중요 한 의미는 기계적, 화학적 자극 일반적인 신호 변환 및 말라 골격 네트워크에 피드를 표시. 비록 우리가 두 자극 기계적 자극에 대 한 대량 버퍼 추가 사용 하 여 통합 보여, 미래 연구 chemoattractant는 흐름을 통해 채널을 훨씬 더 다양 한 것에 빠르게 전달 될 수 있는 시스템을 개발을 목표로 한다 그리고 기계 및 화학 자극의 통합을 평가 하는 강력한 방법은. 불행 하 게도, 현재 두 줄 설치 프로그램을 사용 하 여 chemoattractant 추가 chemoattractant 흐름의 배달할 수 있기 때문에 두 번째 전단 흐름 자극과 연결 됩니다. 성공적으로 보여 줬던 캠프 스텐 외대안 레이저 자극 출시 한 chemoattractant의 갇힌된 선구자에서 있을 수 있습니다. 32. 미래에, 그것은 또한 재미 있을 것 이다 다른 자극의 통합 검사, 예를 들어 전단 흐름 및 가변 전기 분야, 또는 전단 흐름 및 가변 기판 강성. 후자의 예가 흥미롭습니다 기계적 자극의 두 종류를 포함 하기 때문에 비록 초기 신호 수신 서로 다를 수 있습니다. 확인 감독된 마이그레이션 유도 모든 자극 같은 신호 전달 네트워크를 공유 하 고 자극을 어떻게 인식에 다 수 복잡 한 환경에서 셀을 탐색 하는 방법 설명할 것 이다. 마지막으로, 우리는 이미 전단 흐름 급성 자극 인간의 neutrophil 같은 셀22의 확산에 지도 시연. 지역화 및 포유류 세포의 기계적 자극으로 신호 변환 및 말라 골격 네트워크의 다양 한 구성의 활성화에 더 미래의 작업 검사 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 부여 R35 GM118177 PND의 국가 학회에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
| KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
| Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
| cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
| Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
| 4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and Equipment | |||
| Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
| 10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
| 35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
| Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
| Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| 50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
| Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
| Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
| UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
| FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
| Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
| Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
| 1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
| 8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
| Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |
References
- Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
- Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
- Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
- Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
- Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
- Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
- Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
- Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
- Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
- Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
- Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
- Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).
- Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
- Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).
- Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
- Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
- Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
- Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
- Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
- Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
- Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
- Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
- Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
- Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
- Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
- Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
- Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
- Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
- Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).
