Ændrede Roller Tube metode for netop lokaliseret og gentagne intermitterende Imaging under langtidskulturer af hjernen skiver i et lukket System
Summary
Præsenteret her er en modificeret roller tube metode til dyrkning og intermitterende høj opløsning billeddannelse af hjernen, gnaver skiver i mange uger med præcise repositionering på photoetched coverslips. Neuronal levedygtighed og skive morfologi er godt vedligeholdt. Anvendelser af denne fuldstændig lukket system ved hjælp af virus til celletype specifikke udtryk er fastsat.
Abstract
Kulturperler gnaver hjernen udsnit er nyttigt for at studere den cellulære og molekylære opførsel af neuroner og glia i et miljø, der har bevaret mange af deres normale i vivo -interaktioner. Udsnit fra en bred vifte af Transgene mus linjer eller brug af virale vektorer for udtryk af fluorescently mærket proteiner eller journalister i vildtype hjernen skiver mulighed for høj opløsning billeddannelse af Fluorescens mikroskopi. Selv om flere metoder er blevet udviklet til billeddannelse hjerne skiver, kombinerer skive kultur med mulighed for at udføre har gentagne høj opløsning billeddannelse af specifikke celler i live skiver over lange perioder stillet problemer. Dette gælder især, når virale vektorer bruges til udtryk af eksogene proteiner, da dette gøres bedst i et lukket system til at beskytte brugere og forhindre krydskontaminering. Simple ændringer til metoden roller tube hjernen skive kultur, der giver mulighed for gentagen høj opløsning billeddannelse af skiver i mange uger i et lukket system er rapporteret. Dyrkning skiver på photoetched coverslips tillader brug af referencepunkter til hurtigt og præcist flytter scenen for at image feltet identisk med tiden før og efter forskellige behandlinger. Eksempler er vist for brug af denne metode, kombineret med specifikke neuronal farvning og udtryk til at observere ændringer i hippocampus skive arkitektur, viral-medieret neuronal udtryk af fluorescerende proteiner og udviklingen af cofilin patologi, der blev tidligere observeret i hippocampus af Alzheimers sygdom (AD) som svar på skive behandling med oligomerer af amyloid-β (Aβ) peptid.
Introduction
Primære kultur af dissocierede neuroner fra regioner i gnavere hjernen er et vigtigt redskab, som forskere for at iagttage Reaktionerne på patologisk impliceret stimuli. Sådanne undersøgelser har dog Ulempen at anskue neuroner i eneste 2D og uden deres glial støttesystem. Desuden, medmindre dyrket under forhold med meget høj tæthed (640 neuroner/mm2 eller ca. 16% af areal) hvor det bliver umuligt at følge den tilfældige udvækst af en dendrit eller axon for mere end en kort afstand fra sin celle organ, hippocampus neuronal levedygtighed forringes over 4 uger betydeligt1, begrænse brugen af dissocierede kulturer til udvidede undersøgelser af aldersbetingede patologier. Dyrkning af skiver forberedt fra gnaver hjerne er en attraktiv mulighed, der overvinder disse begrænsninger ved at opretholde en organiseret celle arkitektur og bæredygtighed uger eller måneder. Betingelserne for opretholdelse af mange forskellige regioner af gnaver hjernen i Skive kultur er blevet beskrevet2.
To store metoder er almindeligt brugt til langtidskulturer af hjernen skiver: dyrkning på membraner på air-liquid grænseflade3 eller dyrkning på coverslips i forseglet rør lov til at rotere i en rulle inkubator at give beluftning4. Skiver kulturperler på membraner kan direkte afbildet med høj opløsning Fluorescens mikroskopi ved hjælp af en opretstående mikroskop og vand fordybelse mål5. Alternativt er skiver kulturperler på membraner blevet overført til glas bund retter at opnå god opløsning af dendritiske spines bruger en inverteret mikroskop6. Begge metoder af imaging skiver dyrkes på membraner er dog åbne systemer, der kræver mellemlang ændringer og ofte bruge svampedræbende og/eller antibiotika til at forebygge eller mindske forurening5,6. Skiver på en membran på grænsefladen luft-medium opretholde fremragende morfologi og overlevelse, men vender tilbage til præcise steder under gentagne imaging på høj forstørrelse er yderst vanskeligt, medmindre eksperimentet følger kun små grupper af celler udtryk for en fluorescerende markør. Selvom skiver dyrkes på membraner har været brugt med viral-medieret udtryk af transgener5,6, kan biosikkerhed protokoller kræve en lukket kultur system anvendes for visse virale vektorer, der bruges til at udtrykke fluorescently markeret proteiner og journalister i celle fysiologi. Derudover kræver fordybelse mål dekontaminering mellem prøver, der vil blive fulgt op i kultur5. En større anvendelse af membran interface kulturer er en kombination af høj opløsning imaging med Elektrofysiologi på én gang point7.
Metoden roller tube med coverslips inde i plastik røret tillader ikke nogen Elektrofysiologi eller lang-dagsorden tænkelig uden at fjerne coverslip. Således, denne metode har oftest udlignet langtidstest hvor efter fiksering observationer foretaget den8. Beskrevet her er en metode, der udnytter roller tube kultur teknik men på boret ud rør med skiver på coverslips, der kan være afbildet gentagne gange så længe som kulturerne vedligeholdes. Det lukkede system kræver ingen ændring af medium til billedbehandling og udnytter photoetched coverslips for at levere referencepunkter, der tillader imaging på høj forstørrelse, efter dage eller uger, felterne præcise tidligere afbildet.
Vi anvender denne metode til at undersøge ændringer i gnavere hippocampus, en større hjerne region involveret i hukommelse og indlæring. Gnaver hippocampus er ofte studeret som en model for patologisk eller aldersrelaterede ændringer observeret under udvikling af kognitiv svækkelse9, såsom dem, der opstår i Annoncen. Vores metode er særligt velegnet til at studere patologiske ændringer, der udvikler sig inden for en enkelt skive over tid reaktion på miljømæssige ændringer, såsom stigninger i Aβ peptider, som er karakteristisk for AD8. En patologi forbundet med menneskelige og gnaver AD hjernen er tilstedeværelsen af cofilin-actin aggregater og stænger, de sidstnævnte indeholdende bundter af filamenter, hvor cofilin og actin er i en 1:1 molar forholdet10,11, 12. stænger er blevet observeret i faste skiver af rotte hippocampus efter Aβ behandling, samt inden for en levende gnavere hjernen skive at udtrykke cofilin-NGL underkastes hypoxi8, og de kan bidrage til den synaptiske dysfunktion set i AD og slagtilfælde. Her bruger vi denne nye dyrkningsbaserede metode for at observere tidsforløb og distribution inden for skiver af udtrykt eksogene kimære fluorescerende proteiner indført af forskellige vira. Vi derefter udnytte den neuronale specifikt udtryk for en cofilin journalist konstruere at følge udviklingen af cofilin stang og samlede patologi i hippocampus skiver i reaktion på behandling med opløselige Aβ oligomerer (Aβo).
Protocol
Representative Results
Discussion
Roller tube metode beskrevet her giver mulighed for langsigtet dyrkning og høj opløsning live imaging af skiveskåret hjernevæv. Et stort problem med skive teknik som anvendt her er i montering og vedligeholdelse af skiver. Coverslip belægninger, der understøtter skive vedhæftning, fremme skive udtynding af styrkelse af udkommet af neurites og migration af celler fra Skive; dermed, vi undgik brug af disse substrater. Indsættelse af amino grupper på glasset ved behandling med 3-aminopropyltriethoxysilane forbedret…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
