Summary
一个基本的协议, 以评估化学品的毒性在模型动物,线虫线虫, 描述。该方法对药品的开发和各种环境污染物的风险评估都具有很好的实用价值。
Abstract
毒理学评价对于了解化学物质对生物科学在基础和应用生物学领域的影响至关重要。哺乳土壤圆形蠕虫,线虫线虫, 是一个有价值的模型生物毒理学研究, 因为它的方便和缺乏动物伦理问题与哺乳动物的动物系统相比。在本议定书中, 详细介绍了在线虫中对化学品进行毒理学评价的过程。一种临床抗癌药物, 依托, 它的目标人类拓扑 II 和抑制 DNA 复制的人癌细胞, 被选为一个模型试验化学。年龄同步的线虫卵被暴露在二甲基亚砜 (亚砜) 或依托, 然后通过立体显微镜观察, 每天4天监测c. 线虫的生长情况。用依托和亚甲基亚砜处理的从线虫中得到的卵总数也用立体显微镜计算。依托治疗显著影响了线虫的生长和繁殖。通过对不同药剂处理期的蚯蚓卵总数的比较, 可以断定, 化学物质对线虫繁殖的生殖毒性是可逆的或不可逆转的。这些协议可能有助于发展各种药物和风险评估的环境毒物。
Introduction
毒理学评价对制药、营养和妆的发展以及各种环境毒素的风险评估都是必不可少的。啮齿类动物模型是其中一个最普遍的在体内实验系统为这毒理学研究;另外, 哺乳有机体, 如C. 线虫也被广泛使用。非哺乳动物毒理学评价模型是有益的, 因为不仅动物伦理问题, 而且它们的方便性和实用性考虑 cost-effectiveness, 可维护性, 速度和重现性1,2 ,3,4。
线虫是一种土壤圆形蠕虫, 在各种基础和应用生物学和化学研究中被作为动物模型来开发。它是一个1毫米长, 透明的线虫, 这是简单地维持在固体或液体线虫生长培养基 (NGM) 喂养的细菌菌株大肠杆菌OP50。c. 线虫的生命周期较短, 野生类型的 N2 c. 线虫约有300只卵。因此, 它很容易被传播到用作实验材料3,4,5。线虫在许多药物和环境污染物的毒理学研究中也得到了广泛的应用6,7,8,9。
由于许多抗癌药物的目标是迅速分裂的癌细胞, 他们也可以损害迅速分裂正常细胞, 如骨髓, 肠上皮, 毛囊细胞。例如, 拓扑抑制抗癌药物靶向癌细胞的 DNA 复制过程;因此, 它们也抑制了快速分裂正常细胞。每一个生物体都有 topoisomerases, 而这些拓扑抑制剂最有可能影响环境生态系统6,10,11。因此, 使用模型动物的药物毒理学评价平台对药品的开发和环境风险评估都是有价值的。
在本文中, 我们描述的详细的协议, 以测试毒性的依托, 这是一个临床抗癌剂的目标拓扑 II, 作为一个模型有毒化学品在线虫。为此, 我们将描述的测量方法的身体大小和总数量的鸡蛋奠定了在线虫处理的依托。
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Protocol
注意: 整个实验必须在20和 #176 保持的干净的隔离实验室中进行; 在蠕虫和细菌处理过程中, 低粉尘和最小污染的 C。为此, 必须在酒精灯的火焰或使用干净的长凳上进行实验.
1. 维护 c. 线虫 和鸡蛋准备化学测试
- 维护 线虫 N2 (var) 在 NGM 琼脂板上喂养的活 大肠杆菌 OP50 在20和 #176; C 12 , 13 .
- 使用漂白剂溶液处理的龄期同步卵 5 或时间蛋铺设方法 6 14 , 15 注: 在准备鸡蛋之前, 用热灭活的 大肠杆菌 OP50 涂依托含 NGM 板, 如下所述。热灭活的 大肠杆菌 OP50 用于将 大肠杆菌 6 、 16 的新陈代谢活动降至最低。
2。制备热灭活的 大肠杆菌 OP50 在毒性试验中, 为饲料中的 线虫
- 准备500毫升的双酵母胰 (戴阳天) 培养基, 如表1所述, 并接种单一菌落的 大肠杆菌 OP50 培养Luria-Bertani (LB) 琼脂平板 5 .
- 孵育 大肠杆菌 OP50 在14小时的震动孵化器中, 37 和 #176; C 和 150 rpm.
- 离心30分钟后在 3220 x g 和 20 #176; C、取出所有上清戴阳天培养基, 并添加混25毫升的 s-缓冲器、250和 #181; 1 米 MgSO 4 , 25 和 #181; 5 毫克/毫升胆固醇 (溶于乙醇)。所有这些解决方案都是无菌的.
- 重细菌并将其转移到50毫升的一次性塑料管中.
- 热失活, 孵育悬浮 大肠杆菌 OP50 在水浴30分钟, 在65和 #176; C.
- 冷却到室温并存储在4和 #176; C 直到使用。这可以存储长达一个月.
3。制备含有1% 二甲基亚砜或750和 #181 的 NGM 板; M 依托
- 准备两个干净的200毫升玻璃瓶。加入0.6 克氯化钠, 0.5 克蛋白胨, 3.4 克琼脂, 195 毫升蒸馏水, 一瓶磁力搅拌器。在另一个空瓶子里加一个磁力搅拌器.
- 将这两个瓶子在121和 #176 上压釜15分钟, 然后在水浴中冷却30分钟, 在55和 #176; c.
- 添加 0.2 mL 1 米 CaCl 2 , 0.2 毫升的5毫克/毫升胆固醇, 0.2 毫升 1 m MgSO 4 , 5 毫升 1 m KPO 4 (所有这些解决方案是无菌), 然后混合他们的磁搅拌在热板上, 在55和 #176; C.
- 将混合 NGM 介质分成两个相同体积的瓶子 (每瓶100毫升)。然后, 将1毫升的亚甲基亚砜添加到一个瓶子中, 再用磁力搅拌再混合。将另一个瓶子放在55和 #176 的水浴里, 直到下一步。分3毫升的含亚砜的培养基, 每 35 x 10 mm 2 培养皿。从这一步可以制成大约33含亚砜的 NGM 板.
- 混合其他瓶子使用磁性搅拌, 添加1毫升的75毫米依托 (股票溶解在二甲基亚砜), 再次混合, 并重复分程序 (步骤 3.4)。从这一步中可以得到大约33依托 (750 和 #181; M)-包含 NGM 板.
注意: 在相关的前一篇文章 6 中, 我们测试了0、250、500和1000和 #181; 依托。根据这一数据, 本文选取了 750 #181; 依托剂量. - 将含有化学成分的 NGM 板冷却至室温, 将其置于室温下约3小时, 并将其存储在4和 #176; C 直到使用.
注意: 在光敏化学品的情况下, 阻挡光, 以尽量减少光分解.
注: 可选, 做一个正常的 NGM 板没有化学品的鸡蛋铺设化验, 可以执行使用两种不同的化学处理条件如下所述. - 添加100和 #181; 热灭活 大肠杆菌 OP50 (如2节所述) 并在每个 NGM 板上传播。允许在20和 #176 的 c 线虫 孵化器中过夜, 用于化学测试.
4。测量 C. 线虫 增长
- 将年龄同步的 线虫 的卵转移到 NGM 板上, 再配以1% 亚砜或750和 #181; 我依托.
- 孵育 c. 线虫 在20和 #176 的孵化器中; c 为4天。用立体显微镜观察蠕虫, 每天拍摄显微图像。通常20X 放大 (1X 物镜, 2X 变焦放大, 和10X 目镜镜头) 是适合的增长观察的 C. 线虫 。还采取显微镜阶段千分尺的显微图像的蠕虫大小校准.
注意: 饥饿影响毒性试验。因此, 饲料有足够的细菌或调整和 #160; 在开始时转移了 C. 线虫 卵数。观察到3天, 排除饥饿的可能性. - 使用 ImageJ 软件在每个时间点测量用亚砜或依托处理的 C. 线虫 的体长.
注: 对于每个样本测量, 50 蠕虫是足够的统计分析。- 在 ImageJ 中, 打开显微镜阶段千分尺图像 (#39; 文件和 #39; #8594; #39; 打开和 #39;).
注: 千分尺图像和蠕虫图像 (步骤 4.2) 必须是相同的放大倍数. - 通过使用和 #39、直线和 #39; 工具, 在千分尺校准图像上拖动1000和 #181;
- 单击和 #39; 分析和 #39; #8594; #39; 设置规模和 #39; 输入1000和 #181; 我进入和 #39; 已知的距离和 #39; 框和 #39; 长度和 #39 的单位; 框, 分别。检查和 #39; 全局和 #39; 单击并 #39; 确定 #39;.
- 打开蠕虫图像 (#39; 文件和 #39; #8594; #39; 打开和 #39;)。使用和 #39; 手绘线和 #39; 工具, 沿每个蠕虫的特征绘制一条线。通过单击和 #39 获取正文长度数据; 分析和 #39; #8594; #39; 测量和 #39;.
- 对50蠕虫重复这些步骤.
- 在 ImageJ 中, 打开显微镜阶段千分尺图像 (#39; 文件和 #39; #8594; #39; 打开和 #39;).
5。 C. 线虫 产卵试验
- 在包含亚甲基亚砜或依托的 NGM 板上孵育年龄同步的卵, 在64小时 (第一次出生之前), 直到20和 #176 的年轻成人阶段; c.
注意: 在生长测量实验中使用蠕虫是可选的。这是方便做的生长测量和鸡蛋铺设化验一起. - 将5只成年蠕虫转移到新的无化学品的 NGM 板 (条件 1, 在一定时间内进行化学处理, 从卵到幼成体阶段) 或新的 NGM 板含有相同的化学预处理 (条件 2, 连续曝光化学品通过整个实验期), 然后孵化为24小时.
注意: 建议每种治疗方法使用 3-5 NGM 板进行复制;这些复制可用于统计分析. - 转移到新的 NGM 板如上所述, 每天计数的鸡蛋数。计数蠕虫爬行, 死亡, 并在内部孵化ed.
- 重复这些步骤, 直到蠕虫不再下蛋, 通常在5天内.
- 计算每个盘中每条蠕虫的产卵数, 并在5天内每天对这些值求和, 以确定产卵的总数量.
注意: 排除从计算中抓取和内部孵化的蠕虫的数量.
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Representative Results
依托 (24-96 h) 的治疗明显延缓了线虫的生长。经过 96 h 的孵化, 依托处理的蠕虫生长到0.86 毫米的体长, 而车辆处理的蠕虫增长到1.04 毫米 (图 1)。在立体显微镜观察下, 生长迟缓也有明显的观察 (图 2)。我们开始在72小时的孵化中看到由汽车处理过的蠕虫的卵。另一方面, 在96小时的依托治疗后观察卵子。从这些数据, 我们推测, 依托治疗推迟了第一次出生时间的C. 线虫。
除了产卵的延迟, 依托治疗大大降低了每个蠕虫产卵的总数量 (图 3)。当年轻的成年蠕虫在存在 (图 3B) 中被培养, 或在连续依托治疗中的缺席 (图 3A) 时, 观察到依托治疗的生殖毒性、总卵数的减少。在两种实验条件下, 控制处理后的蠕虫之间没有明显的差异。在一定时间内处理的蠕虫卵总数 (从卵到幼成虫期) 与连续依托的蠕虫没有显著差异。对于这种比较, 统计分析是由 one-way 分析方差 (方差), 其次是 Tukey 的多重比较试验。
图 1: 用依托处理的C. 线虫的生长测量.年龄同步的线虫卵生长在 NGM 板上, 辅以亚甲基亚砜 (1%、车辆控制) 或依托 (750 µM), 用于 24-96 h. 显微 (如图 2所示) 每天使用, 并且测量车身长度ImageJ 软件。数据被表示为平均±标准偏差 (SD) (n = 50, 每组50蠕虫)。*p和 #60; 0.01, 在每个时间点的车辆控制和依托处理之间存在显著差异。使用学生的t测试进行统计分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 用依托处理的C. 线虫的立体显微镜图像.C. 线虫的处理方法如图 1所述 (缩放条 = 1 mm)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 用依托处理的C. 线虫放置的鸡蛋总数.年龄同步的线虫卵在含有亚甲基亚砜 (1%、车辆控制) 或依托 (750 µM) 的 NGM 板上孵育64小时。接下来, 在缺席 (A) 或存在 (B) 连续化学处理5天的情况下, 观察到的卵总数。蠕虫每天被转移到法线 NGM 板材 (A), 或 NGM 板材补充与同样化学制品: 1% 二甲基亚砜或依托 (750 µM) (B)。蛋的数量被计数了并且除以每天蠕虫总数量计算每个蠕虫产卵的数量。每只虫子的卵数总计5天。这些数据用份实验的平均值表示。*p和 #60; 0.01, 对于车辆控制和依托处理之间的显著差异。使用学生的t测试进行统计分析。请单击此处查看此图的较大版本.
| 正常的 NGM 琼脂培养基–1000毫升的维护, 并没有连续化学处理的蛋铺设试验 |
| 1. 在玻璃瓶中加入2.5 克蛋白胨、3克氯化钠、17克琼脂和975毫升蒸馏水。 |
| 2. 高压釜15分钟在121° c。 |
| 3. 在水浴冷却30分钟在55° c, 然后增加1毫升 1 m CaCl2, 1 毫升5毫克/毫升胆固醇 (溶解在乙醇), 1 毫升 1 m MgSO4, 25 毫升的 KPO4。 |
| 4. 混合磁搅拌, 然后分到培养皿中 (90 x 15 mm 的盘子进行维护; 35 x 10 mm2盘, 用于产卵试验)。 |
| 5. 将 NGM 板存放在4° c 直到使用。 |
| 戴阳天培养基用于培养大肠杆菌OP50-500 毫升 |
| 1. 加入2.5 克氯化钠、5克酵母提取物、8克蛋白胨和485毫升蒸馏水, 放入锥形烧瓶中。 |
| 2. 高压釜15分钟在121° c。 |
| 3. 在室温下降温贮存, 直至使用。 |
| s-缓冲器–1000毫升 |
| 1. 添加5.85 克氯化钠, 6 克2PO4, 1 克 K2HPO4, 以及987毫升蒸馏水放入玻璃瓶中。 |
| 2. 将溶液的 pH 值调整到6.0。 |
| 3. 高压釜15分钟在121° c。 |
| 4. 在室温下降温贮存, 直至使用。 |
表 1: Receipes 文化成长媒体和缓冲区。
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Discussion
在这篇文章中, 我们描述的毒性评价的化学品在线虫, 土壤线虫, 使用依托作为毒物的例子。为此, 我们使用了两个实验条件。在第一个集合中, C. 线虫生长在含有从卵到幼成虫阶段的依托板上, 然后允许蠕虫在正常的 NGM 板上产卵, 而不使用化学物质。在第二个实验组中, 在整个实验期间, 用依托连续处理线虫。通过比较两个实验条件下的卵数, 我们可以确定被测化合物的生殖毒性是否可逆或不可逆转。依托显著降低了在两种实验条件下放置的卵总数 (图 3)。这些数据暗示在早期生长阶段对依托的预处理足以诱发生殖器官的损伤, 包括性腺生殖细胞6;根据这些数据, 我们可以推测, 依托治疗不可逆转地导致生殖毒性在线虫。
除了在本方法文章中描述的线虫实验之外, 其他毒性测试, 如寿命检测14、15、性腺生殖细胞的显微观察6、17,咽部抽吸率的测定和运动分析18,19也可用于在线虫的化学毒性评估。体外培养的人细胞系、原代细胞、干细胞和3D 球体培养物是评价各种化学物质毒性的其他可能选择, 以增强C. 线虫实验的局限性1, 6、20、21。
虽然在线虫中存在着基本基因的进化保护, 但哺乳生物体在蛋白质序列、消化系统和肠道系统、新陈代谢以及缺乏许多基因方面与人类不同。因此, 需要对哺乳动物进行动物实验和临床试验, 以充分评价化学物质的毒性。然而, 考虑到方便和动物伦理问题的优势, 一个线虫毒性测试平台将是一个有用的和实际的解决方案, 对各种化学品的毒理学评价。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了韩国科学和技术研究所校内研究补助金 (2E27513) 和农业、粮食和农村事务部 (315067-03) 资助的高增值食品技术发展方案 (IPET) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
References
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , In Press (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563 (2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
