Summary
Основной протокол для оценки токсичности химических веществ в модель животного, Caenorhabditis elegans, описан. Метод является удобным и полезным для развития фармацевтических препаратов, а также для оценки риска различных загрязнителей окружающей среды.
Abstract
Токсикологические оценки имеет решающее значение для понимания воздействия химических веществ на живые организмы в фундаментальных и прикладных биологических наук. Не млекопитающих почвы круглый червь, Caenorhabditis elegans, является ценным модельный организм для токсикологических исследований из-за его удобства и отсутствие животных этики вопросов по сравнению с системами, млекопитающих животных. В этом протоколе описывается подробная процедура токсикологической оценке химических веществ в C. elegans . Противоопухолевых лекарств, этопозид, который предназначен для человека топоизомеразы II и подавляет репликацию ДНК человеческих раковых клеток, был выбран в качестве модели тестирования химической. Возраст синхронизированы C. elegans яйца были подвержены диметилсульфоксида (ДМСО) или этопозид, а затем рост C. elegans контролируется каждый день в течение 4 дней наблюдения стерео Микроскоп. Общее количество яиц проложен от C. elegans относились с ДМСО или этопозид также учитываются с помощью стерео Микроскоп. Этопозид лечения существенно повлияло на рост и воспроизводство C. elegans. Для сравнения из общего числа яиц от червей с периодами лечения различных химических веществ, может решил, что репродуктивная токсичность химических веществ на воспроизведение C. elegans является обратимым или необратимым. Эти протоколы могут быть полезны для разработки различных наркотиков и оценки риска экологических токсикантов.
Introduction
Токсикологическая оценка имеет важное значение для развития фармацевтических препаратов, пищевых добавок, и космецевтики, а также оценке риска различных экологических токсинов. Грызун модель является одним из самых популярных в естественных условиях экспериментальных систем для этого исследования токсикологии; Кроме того также широко используются организмов не млекопитающих, таких как C. elegans . Non млекопитающих токсикологической оценке модели являются полезными ввиду не только животных этические вопросы, но и их удобство и полезность рассмотрения эффективности затрат, ремонтопригодность, скорость и воспроизводимость1,2 ,3,4.
C. elegans, почвы круглый червь, была использована как модель животных в различных фундаментальные и прикладные исследования по биологии и химии. Это 1 мм длиной, прозрачный нематода, который просто ведется в твердом или жидком нематода роста СМИ (НГМ) кормили с бактериальный штамм кишечной палочки ОР50. C. elegans имеет короткий жизненный цикл, и одичал тип N2 C. elegans откладывает примерно 300 яиц. Таким образом он легко размножается использоваться как экспериментальные материалы3,4,5. C. elegans также широко используется в токсикологических исследованиях многих лекарств и загрязняющих окружающую среду6,,78,9.
Потому что многие противораковые препараты целевых быстро делящиеся раковые клетки, они также могут повредить быстро делящихся нормальные клетки костного мозга, кишечного эпителия и клеток волосяного фолликула. Например тормозящий противораковые препараты топоизомеразы целевой процесс репликации ДНК раковых клеток; Таким образом они также тормозят, быстро делящихся нормальные клетки. Каждый живой организм имеет топоизомеразы и эти топоизомеразы ингибиторы скорее воздействия окружающей среды экосистем6,10,11. Таким образом платформа токсикологической оценке наркотиков, используя модель животного является ценным для развития фармацевтики и оценки экологических рисков.
В этой статье мы опишем подробные протоколы для проверки на токсичность этопозид, которая является клинической противораковый агент что цели топоизомеразы II, как модель токсичных химических веществ в C. elegans. Для этой цели мы будем описывать метод измерения размеров тела и общее количество яиц в C. elegans относились с Этопозид.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: всего эксперимента должны быть выполнены в чистой изолированной лаборатории на уровне 20 ° C с низкой пыли и минимизации загрязнения во время червь и бактериальная обработка. Для этой цели, должны быть выполнены эксперименты под пламя лампы алкоголя или с помощью чистой скамейке.
1. поддержание C. elegans и яйцо подготовки химические испытания
- поддерживать C. elegans N2 (var. Бристоль) на плите агар NGM кормили с живой E. coli ОР50 при 20 ° C 12 , 13.
- Подготовка возраст синхронизированы яйца с помощью отбеливателя решение лечения 5 или время яйцо укладка метод 6 , , 14- 15.
Примечание: перед приготовлением яйцо, пальто, этопозид содержащих NGM пластины с тепло инактивированная E. coli ОР50 как описано ниже. Тепло инактивированная E coli ОР50 используется для сведения к минимуму метаболическую активность E. coli 6 , 16.
2. Подготовка тепло инактивированная E. coli ОР50 кормить C. elegans во время токсичности тест
- подготовить 500 мл двойной дрожжи Триптон (ПКР) среды, как описано в таблице 1 и прививать единую колонию ОР50 E. coli, культивируемых на Лурия-Бертани (LB) агар пластина 5.
- Инкубировать E. coli ОР50 в тряску инкубатор для 14 ч при 37 ° C и 150 об/мин.
- После центрифугирования для 30 мин при 3220 x g и 20 ° C, удалите все супернатанта ПКР среднего и добавить предварительно смесь 25 мл S-буфера, 250 мкл 1 М MgSO 4 и 25 мкл холестерина 5 мг/мл (растворимые в этиловом спирте). Все эти решения являются стерильными.
- Ресуспензируйте бактерии и перенести их в одноразовые пластиковые трубки 50-мл.
- Для тепло инактивации, инкубировать ресуспензированы E. coli ОР50 на водяной бане 30 мин на 65 ° C.
- Остыть до комнатной температуры и хранить при 4 ° C до использования. Это может храниться до одного месяца.
3. Подготовка NGM пластины содержащие либо 1% ДМСО или 750 мкм этопозид
- подготовить два чистых 200 мл стеклянных бутылок. Добавление 0,6 г NaCl, 0,5 г Пептон, 3.4 g агар и 195 мл дистиллированной воды и магнитной мешалкой для одной бутылки. Добавление пустой бутылки магнитной мешалкой.
- Автоклав эти две бутылки для 15 мин при температуре 121 ° C, а затем остывают бутылки на водяной бане 30 мин на 55 ° C.
- Добавления 0,2 мл CaCl 1 М 2, 0,2 мл холестерин 5 мг/мл, 0,2 мл 1 М MgSO 4 и 5 мл 1 M КПО 4 (все эти решения являются стерильными) и затем смешивать их, магнитные перемешивания на горячей плите на 55 ° C.
- Смешанные среды NGM делят на две бутылки с такой же объем (100 мл). Далее добавить 1 мл ДМСО в одной бутылке, смешать его снова с помощью магнитная перемешивании. Храните другие бутылки в водяной бане при температуре 55 ° C до следующего шага. Аликвота 3 мл ДМСО содержащих среды для каждого 35 x 10 мм 2 Петри. Примерно 33 ДМСО содержащих NGM пластины могут быть сделаны из этого шага.
- Смешать другие бутылки с помощью магнитная перемешивании, добавляют 1 мл 75 мм этопозид (сток растворенных в ДМСО), смесь снова и повторить аликвота (шаг 3.4). Примерно 33 этопозид (750 мкм)-содержащих NGM пластины могут быть сделаны из этого шага.
Примечание: В взаимосвязанные предыдущих бумаги 6, мы проверили, 0, 250, 500 и 1000 мкм Этопозид. Основываясь на этих данных, мы выбрали 750 мкм этопозид дозы в этом документе. - Круто вниз химико содержащих NGM пластины до комнатной температуры, оставляя их при комнатной температуре примерно 3 часа и хранить их при температуре 4 ° C до использования.
Примечание: В случае свет чувствительных химических веществ, блокировать свет, чтобы свести к минимуму разложение света индуцированной.
Примечание: При необходимости, сделать нормальный NGM плита без химикатов для откладки яиц анализа, которые могут быть выполнены с использованием двух разных химической обработки условия, как описано ниже.
Добавить 100 мкл - тепло инактивированная E. coli ОР50 (как описано в разделе 2) и распространилась на каждой табличке NGM. Разрешить для высыхания на ночь в C. elegans инкубатора при 20 ° C для химического test.
4. Измерение роста C. elegans
- передачи синхронизированы возраст C. elegans яйца NGM пластины с 1% ДМСО или 750 мкм Этопозид.
- C. elegans инкубировать в инкубаторе при 20 ° C в течение 4 дней. Соблюдать червей с помощью стерео микроскоп и микроскопических изображений каждый день. Обычно увеличение 20 X (1 X объектив, 2 X зум увеличение и 10 X окуляр объектив) подходит для наблюдения роста C. elegans. Также принять микроскопических изображений микрометра Этап микроскопа для калибровки размер червя.
Примечание: Голод влияет на токсичность тест. Таким образом, кормить с достаточной бактерий или скорректировать передаваемых C. elegans яйцо цифры в начале. Соблюдать до 3 дней, чтобы исключить возможность использования голода. - Измерить длину тела C. elegans относились с ДМСО или этопозид в каждый момент времени, с помощью программного обеспечения ImageJ.
Примечание: Для каждого измерения образца, 50 черви являются достаточными для статистического анализа.- В ImageJ, откройте изображение микрометра Этап микроскопа (' файл ' → ' открыть ').
Примечание: Изображение микрометра и червь изображения (шаг 4.2) должны быть же масштаб. - Перетащите линию 1000 мкм на Микрометр калибровки изображения с помощью ' прямой линии ' инструмент.
- Нажмите ' анализ ' → ' задайте шкала ' и ввод 1000 и мкм в ' известно расстояние ' коробки и ' единица длины ' поле, соответственно. Проверить ' глобального ' и нажмите ' ОК '.
- Открыть изображения червь (' файл ' → ' открытые '). Нарисуйте линию вдоль особенность каждого червя, используя ' Freehand Line ' инструмент. Получение данных длина тела, нажав ' анализ ' → ' мера '.
- Повторите эти шаги для 50 червей.
- В ImageJ, откройте изображение микрометра Этап микроскопа (' файл ' → ' открыть ').
5. C. elegans яйцо укладки Assay
- инкубировать возраст синхронизированы яйца на NGM пластины содержащих ДМСО или этопозид для 64 h (до рождения первого ребенка) до стадии молодых взрослых в 20 ° C.
Примечание: Это необязательно использовать червей из экспериментов измерения роста. Это удобно делать измерения роста и вместе яйцо укладка пробирного. - Передачи 5 взрослых червей для новой NGM пластин без химикатов (условие 1, химической обработки в течение определенного периода времени, от яйца до молодых взрослой стадии) или новых NGM пластины, содержащие же химической предварительной обработки (условие 2, непрерывное воздействие химических веществ в целом экспериментальный период), а затем инкубировать их за 24 ч.
Примечание: Рекомендуется, чтобы реплицировать с помощью 3-5 NGM пластины для каждого лечения; Эти репликация может использоваться для статистического анализа. - Передача новой пластинкой NGM как описано выше и подсчитать количество яиц каждый день. Граф червей, которые обход выкл, умер и были внутренне люкиздание
- Повторить эти шаги до тех пор, пока черви заложить не больше яиц, обычно в течение 5 дней.
- Вычислить количество яиц на червя от каждой плиты и суммировать эти значения каждый день в течение 5 дней, чтобы определить общее количество яиц.
Примечание: Исключить количество червей, обход которых off и внутренне вылупились из расчета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лечение этопозид (24-96 h) значительно замедляется рост C. elegans. После 96 ч инкубации этопозид лечение глистов вырос до 0,86 мм длина тела, в то время как транспортное средство лечение глистов вырос до 1,04 мм (рис. 1). Замедление темпов экономического роста наблюдалось также очевидно под наблюдением стерео микроскоп (рис. 2). Мы начали видеть яйца от автомобиля лечение глистов в 72 ч инкубации. С другой стороны после 96 h этопозид лечения наблюдались яйца. Из этих данных мы предположили, что этопозид лечения задержки впервые рождения C. elegans.
Помимо задержки откладки яиц этопозид лечения значительно уменьшилось общее количество яиц в червь (рис. 3). Репродуктивная токсичность, уменьшение числа общей яйцо на лечение этопозид, было отмечено, когда молодых взрослых червей были культивировали в присутствии (рис. 3B) или отсутствие (Рисунок 3А) непрерывной этопозид лечения. Там были статистически значимых различий между управления лечение червей в обеих экспериментальных условиях. Общее количество яиц от червей, лечение для определенного периода времени (от яйца до стадии молодых взрослых) не был значительно отличается от червей, постоянно получавших Этопозид. Для сравнения статистического анализа была исполнена односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) следуют Тьюки множественные сравнения теста.
Рисунок 1: Измерение роста в C. elegans относились с Этопозид. Возраст синхронизированы C. elegans яйца были выращены на тарелках NGM дополнена ДМСО (1%, управления транспортным средством) или этопозид (750 мкм) для 24-96 h. микрофотографиями, (показано на рисунке 2) были сделаны каждый день, и длина тела была измерена с помощью ImageJ программное обеспечение. Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение (SD) (n = 50, 50 червей на группу). p < 0.01, существенные различия между режимом управления и этопозид транспортного средства в каждый момент времени. Статистический анализ проводился с помощью студента t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Стерео Микроскоп изображения C. elegans относились с Этопозид. C. elegans рассматривались как описано на рисунке 1 (шкала бар = 1 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Общее количество яиц проложен от C. elegans относились с Этопозид. Возраст синхронизированы C. elegans яиц инкубировали на NGM пластины, содержащие ДМСО (1%, управления транспортным средством) или этопозид (750 мкм) для 64 h. Далее было отмечено общее количество яиц в отсутствие (A) или наличие (B) непрерывного химической обработки на 5 дней. Глисты были переданы каждый день нормальной NGM плиты (A), или NGM плиты дополнена же химические вещества: 1% ДМСО или этопозид (750 мкм) (B). Количество яиц было подсчитано и делится на общее количество глистов каждый день чтобы вычислить количество яиц на червя. Все числа яиц на червя были подведены на 5 дней. Данные выражаются как среднее ± SD из quadruplicate экспериментов. p < 0.01, существенные различия между режимом управления и этопозид транспортного средства. Статистический анализ проводился с помощью студента t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Нормальный NGM агар СМИ – 1000 мл для обслуживания и откладки яиц пробирного без непрерывного химической обработки |
| 1. Добавьте 2.5 g Пептон, 3 g NaCl, 17 g агар и 975 мл дистиллированной воды в стеклянной бутылке. |
| 2. автоклав для 15 мин при температуре 121 ° C. |
| 3. охладить вниз на водяной бане 30 мин при температуре 55 ° C, а затем добавьте 1 мл CaCl 1 M2, 1 мл 5 мг/мл холестерин (растворимые в этиловом спирте), 1 мл 1 М MgSO4, 25 мл КПО4. |
| 4. Смешайте с магнитной перемешивания, а затем Алиготе в Петри (90 x 15 мм блюда для поддержания; 35 x 10 мм2 блюда для откладки яиц пробирного). |
| 5. Храните NGM пластины на 4 ° C до использования. |
| ДЯТ СМИ для выращивания E. coli ОР50 – 500 мл |
| 1. Добавьте 2,5 г NaCl, 5 г дрожжей экстракт, 8 g Пептон, и 485 мл дистиллированной воды в колбу Эрленмейера. |
| 2. автоклав для 15 мин при температуре 121 ° C. |
| 3. охладить и хранить при комнатной температуре до использования. |
| S-буфера – 1000 мл |
| 1. Добавьте 5.85 г NaCl, 6 g KH2PO4, 1 g K2HPO4и 987 мл дистиллированной воды в стеклянной бутылке. |
| 2. Отрегулируйте рН раствора до 6.0. |
| 3. автоклав для 15 мин при температуре 121 ° C. |
| 4. охладить и хранить при комнатной температуре до использования. |
Таблица 1: Рецептурами средства роста культуры и буферов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы опишем оценки токсичности химических веществ в C. elegans, почвенных нематод, используя этопозид токсиканта примером. Для этой цели мы использовали два экспериментальных условиях. В первом наборе C. elegans были выращены на этопозид, содержащие пластины от яйца до стадии молодых взрослых, и затем червей было разрешено откладывают яйца на обычных NGM пластин без химических веществ. В наборе второй экспериментальный C. elegans постоянно обращаются с этопозид весь экспериментальный период. Для сравнения чисел яйцо между двух экспериментальных условиях, мы можем решить, был ли репродуктивная токсичность проверенных соединений обратимым или необратимым. Этопозид значительно уменьшилось общее количество яиц в обеих экспериментальных условиях (рис. 3). Эти данные подразумевается, что предварительная обработка этопозид на ранней стадии роста было достаточно, чтобы вызвать повреждения репродуктивных органов, включая Гонада зародышевых клеток6; Основываясь на этих данных, мы могли бы предположить, что этопозид лечения необратимо индуцированной репродуктивной токсичности в C. elegans.
В дополнение к C. elegans эксперименты, описанные в данной статье метода другие токсичности тесты, такие, как продолжительность жизни проба14,15, микроскопические наблюдения Гонада клетки семенозачатка6,17, измерение глоточные насосных скорость и движение анализа18,19 может также использоваться для оценки токсичности химических в C. elegans. В vitro культивированный линий клеток человека, Главные ячейки, стволовых клеток и 3D сфероида культуры являются другие возможные варианты для оценки токсичности химических веществ, различных увеличить ограничение C. elegans экспериментов1, 6,,2021.
Хотя есть эволюционные сохранения важно генов у нематоды Caenorhabditis elegans, организм не млекопитающих отличается от людей с точки зрения последовательности белка, пищеварительной и кишечной систем, обмена веществ, а также он не хватает многих генов. Таким образом у млекопитающих эксперименты на животных и клинические испытания необходимы для полной оценки токсичности химических веществ. Однако учитывая преимущества удобства и животных этические вопросы, C. elegans токсичность тестирования платформы будет полезным и практичным решением для токсикологические оценки различных химических веществ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано интрамуральных исследовательский грант Корейский институт науки и технологии (2E27513) и высокую добавленную стоимость продовольственной технологии развития программы (IPET) финансируется министерством сельского хозяйства, продовольствия и сельских дел (315067-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
References
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , In Press (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563 (2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
