Summary
Um protocolo básico para avaliar a toxicidade de produtos químicos em um animal modelo, Caenorhabditis elegans, é descrito. O método é conveniente e útil para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos, bem como para a avaliação de risco de diversos poluentes ambientais.
Abstract
Avaliação toxicológica é crucial para entender os efeitos das substâncias químicas sobre organismos vivos nos campos da ciência biológica básica e aplicada. Um solo não-mamíferos redondo verme Caenorhabditis elegans, é um organismo modelo valioso para estudos de toxicologia, devido à sua conveniência e a falta de questões de ética animal, em comparação com sistemas de animais mamíferos. Neste protocolo, é descrito um procedimento detalhado de avaliação toxicológica de substâncias químicas em c. elegans . Uma droga anticancerígena clínica, etoposide, quais destinos humano topoisomerase II e inibe a replicação do DNA de células cancerosas humanas, foi selecionada como um modelo de testes químicos. Idade-sincronizado c. elegans ovos foram expostos a dimetilsulfóxido (DMSO) ou etoposide, e então o crescimento de c. elegans foi monitorado diariamente por 4 dias pela observação de microscópio estéreo. O número total de ovos assente de c. elegans , tratados com DMSO ou etoposide foi também contada usando o microscópio estéreo. Tratamento de Etoposide afetado significativamente o crescimento e a reprodução de c. elegans. Por comparação do número total de ovos de vermes com períodos de tratamento diferentes de produtos químicos, pode decidir-se que a toxicidade reprodutiva de produtos químicos na reprodução de c. elegans é reversível ou irreversível. Estes protocolos podem ser úteis para tanto no desenvolvimento de várias drogas e avaliação de riscos de tóxicos ambientais.
Introduction
Avaliação toxicológica é essencial para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos, nutracêuticos e cosmecêuticos, bem como a avaliação de risco de várias toxinas ambientais. O modelo de roedor é um dos mais populares na vivo sistemas experimentais para o estudo de toxicologia; Alternativamente, organismos não-mamíferos, tais como c. elegans são também amplamente utilizados. Modelos de avaliação toxicológica mamiferas são benéficos devido não só animais questões éticas, mas também sua conveniência e utilidade, considerando a relação custo-eficácia, facilidade de manutenção, velocidade e reprodutibilidade1,2 ,3,4.
C. elegans, um solo redonda worm, tem sido explorada como um animal modelo em várias pesquisas básicas e aplicadas biologia e química. É um 1 mm de comprimento, o nematódeo transparente, que é simplesmente mantido em sólido ou líquido nematódeo crescimento Media (NGM) alimentados com a estirpe bacteriana Escherichia coli OP50. C. elegans tem um ciclo de vida curto, e o selvagem-tipo N2 c. elegans põe aproximadamente 300 ovos. Portanto, ela é facilmente propagada para serem utilizados como materiais experimentais3,4,5. C. elegans também tem sido amplamente utilizada nos estudos toxicológicos de muitas drogas e poluentes ambientais6,7,8,9.
Porque muitas drogas anticâncer alvo rapidamente dividindo as células cancerosas, podem também danificar dividindo rapidamente as células normais como as células do folículo piloso, epitélio intestinal e medula óssea. Por exemplo, drogas anticâncer inibidores de topoisomerase alvo o processo de replicação do DNA de células cancerosas; Portanto, eles também inibem dividindo rapidamente as células normais. Todos os organismos vivos tem topoisomerases e estes topoisomerase inibidores mais provável impacto ambiental de ecossistemas6,10,11. Assim, uma plataforma de avaliação toxicológica de drogas usando um animal modelo é valiosa para tanto no desenvolvimento de fármacos e avaliação dos riscos ambientais.
Neste artigo, descrevemos os protocolos detalhados para testar a toxicidade de etoposide, que é um agente anticâncer clínico que alvos topoisomerase II, como um produto químico tóxico de modelo em c. elegans. Para este fim, descreveremos o método de medição do tamanho do corpo e o número total de ovos postos em c. elegans , tratados com etoposide.
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Protocol
Nota: todo o experimento deve ser realizado em um laboratório isolado limpo a 20 ° C, com a poeira baixa e com a minimização da contaminação durante o worm e manipulação bacteriana. Para essa finalidade, devem ser realizados experimentos sob a chama de uma lâmpada de álcool ou usando uma bancada limpa.
1. manutenção de c. elegans e ovo de preparação para o teste químico
- manutenção c. elegans N2 (var. Bristol) sobre uma placa de ágar NGM alimentada com live Escherichia coli OP50 a 20 ° C 12 , 13.
- Preparar ovos de idade-sincronizado usando um alvejante solução tratamento 5 ou o tempo de ovo postura método 6 , 14 , 15.
Nota: antes de preparação do ovo, casaco placa contendo etoposido NGM com calor-inativado Escherichia coli OP50 conforme descrito abaixo. Inactivados por calor E coli OP50 é usado para minimizar a atividade metabólica de Escherichia coli 6 , 16.
2. Preparação de calor-inativado Escherichia coli OP50 feed C. elegans durante o ensaio de toxicidade
- preparar 500 mL de meio de duplo levedura triptona (DYT) conforme descrito na tabela 1 e inocular uma única colônia de Escherichia coli OP50 cultivadas na um ágar Luria-Bertani (LB) placa 5.
- Incubar a Escherichia coli OP50 numa incubadora tremendo para 14 h a 37 ° C e 150 rpm.
- Após a centrifugação por 30 min no 3.220 x g e 20 ° C, retire todo o sobrenadante médio DYT e adicionar uma pré-mistura de 25 mL de tampão-S e 250 µ l de 1m MgSO 4 25 µ l de colesterol de 5 mg/mL (dissolvido em etanol). Todas essas soluções são estéreis.
- Ressuspender as bactérias e transfira para um tubo de plástico descartável de 50 mL.
- Para a calor-inactivação, incubar a ressuspensão OP50 de Escherichia coli em banho-maria por 30 min no 65 ° C.
- Esfriar até a temperatura ambiente e loja a 4 ° C até o uso. Isso pode ser armazenado por até um mês.
3. Preparação de NGM placas contendo ou 1% DMSO ou 750 µM Etoposide
- Prepare duas garrafas de vidro de 200ml limpa. Adicione 0,6 g de NaCl, 0,5 g de peptona, 3,4 g de ágar-ágar, 195 mL de água destilada e um agitador magnético para uma garrafa. Adicionar um agitador magnético para a outra garrafa vazia.
- Garrafas de autoclave estes dois por 15 min a 121 ° C e em seguida esfriar os frascos em banho-maria por 30 min a 55 ° C.
- Adicionar 0,2 mL de 1 M CaCl 2, 0,2 mL de colesterol de 5 mg/mL, 0,2 mL de 1 M MgSO 4 e 5 mL de 1 M KPO 4 (todas essas soluções são estéreis) e em seguida, misturá-los por agitação magnética, um prato quente em 55 ° C.
- Dividir o meio NGM misto em duas garrafas com o mesmo volume (100 mL cada uma). Em seguida, adicionar 1 mL de DMSO para uma garrafa, misture-o novamente usando a agitação magnética. Armazene o outro frasco num banho de água a 55 ° C até o próximo passo. Alíquota 3 mL do meio a cada 35 x 10 mm 2 placa de Petri contendo DMSO. Aproximadamente 33 placas contendo DMSO NGM podem ser feitas desta etapa.
- Misturar o outro frasco usando a agitação magnética, adicionar 1 mL de 75mm etoposide (estoque dissolvido em DMSO), misturar novamente e repita o procedimento de alíquota (passo 3.4). Aproximadamente 33 etoposide (750 µM)-com NGM chapas pode ser feita desta etapa.
Nota: No correlata anterior papel 6, nós testamos 0, 250, 500 e 1.000 µM de etoposide. Com base nos dados do, escolhemos a 750 µM de etoposide dose neste trabalho. - Cool para baixo as placas NGM que contenham produtos químicos à temperatura ambiente por deixá-los em temperatura ambiente por cerca de 3 h e armazená-los em 4 ° C até o uso.
Nota: No caso de produtos químicos sensíveis à luz, bloqueie a luz para minimizar a decomposição induzida por luz.
Nota: Opcionalmente, fazer uma placa NGM normal sem produtos químicos para o ensaio, que pode ser realizado usando duas condições diferentes de tratamento químico, conforme descrito abaixo de postura de ovos. - Adicione 100 µ l de calor-inativada Escherichia coli OP50 (como descrito na seção 2) e espalhe sobre cada placa NGM. Deixe secar durante a noite em uma incubadora de c. elegans, a 20 ° C para o teste de química
4. Medição do crescimento de c. elegans
- transferência a idade-sincronizado c. elegans ovos à placa NGM suplementada com 1% DMSO ou 750 µM etoposide.
- Incubar c. elegans em uma incubadora a 20 ° C por 4 dias. Observem os vermes, usando um microscópio estéreo e tomar imagens microscópicas todos os dias. Geralmente, ampliação de 20 X (1 X objectiva, ampliação de zoom X 2 e 10 X ocular lente) é apropriado para a observação do crescimento de c. elegans. Também levar uma imagem microscópica de micrômetro de palco o microscópio para a calibração de tamanho worm.
Nota: A fome afeta o ensaio de toxicidade. Portanto, alimentar com bactérias suficientes ou ajustar o transferidos c. elegans números no início de ovo. Observar até 3 dias para excluir a possibilidade de fome. - Medir o comprimento de corpo de c. elegans, tratados com DMSO ou etoposide em cada ponto de tempo usando software ImageJ.
Nota: Para cada medição de amostra, 50 vermes são suficientes para a análise estatística.- No ImageJ, abra a imagem de micrômetro de palco de microscópio (' arquivo ' → ' abrir ').
Nota: A imagem de micrômetro e imagens de worm (etapa 4.2) devem ser a mesma ampliação. - Arrastar uma linha de 1.000 µm na imagem de calibração de micrômetro usando ' linha reta ' ferramenta.
- Clique ' Analyze ' → ' definir escala de ' e entrada de 1.000 e µm para a ' conhecida a distância ' caixa e ' unidade de comprimento ' caixa, respectivamente. Verificar ' Global ' e clique em ' Okey '.
- Abrir as imagens de worm (' arquivo ' → ' Open '). Desenhar uma linha ao longo da característica de cada worm usando ' Freehand linha ' ferramenta. Obter os dados de comprimento de corpo clicando ' Analyze ' → ' medida '.
- Repita essas etapas para 50 vermes.
- No ImageJ, abra a imagem de micrômetro de palco de microscópio (' arquivo ' → ' abrir ').
5. C. elegans ovo deitado ensaio
- incubar a idade-sincronizado ovos sobre a NGM placa contendo DMSO ou etoposide para 64 h (antes do nascimento de primeiro) até a fase adulta jovem em 20 ° C.
Nota: É opcional usar os vermes das experiências de medição de crescimento. É conveniente fazer a medição de crescimento e postura ensaio de ovo juntos.
Placas de - transferir 5 vermes adultos para a nova NGM sem produtos químicos (condição 1, tratamento químico dentro de um determinado período de tempo, de ovos para fase adulta jovem) ou nova placa NGM, contendo o mesmo pré-tratamento químico (condição 2, a exposição contínua de produtos químicos durante o período experimental em geral) e então eles incubar por 24 h.
Nota: É aconselhável fazer réplicas usando placas NGM de 3-5 para cada tratamento; Estas repetições podem ser usadas para análise estatística. - Transferir para a nova chapa NGM como descrito acima e contar o número de ovos todos os dias. Contar os vermes que rastejou fora, morreram e foram internamente escotilhaEd.
- Repita estes passos até os vermes ovos sem mais, geralmente em 5 dias.
- Calcular o número de ovos postos por worm de cada prato e somar esses valores todos os dias durante 5 dias determinar o número total de ovos postos.
Nota: Excluir o número de minhocas que rastejou fora e internamente eclodiram no cálculo de.
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Representative Results
O tratamento de etoposide (24-96 h) retardado significativamente o crescimento de c. elegans. Após 96 horas de incubação, vermes etoposide-tratados cresceram 0,86 mm de comprimento, enquanto os vermes de veículo-tratados cresceram a 1,04 mm (Figura 1). Retardo de crescimento também aparentemente foi observado sob observação microscópio estéreo (Figura 2). Começamos a ver os ovos do veículo-tratados vermes a 72 h de incubação. Por outro lado, os ovos foram observados após 96 h de tratamento etoposide. A partir destes dados, nós especulamos que etoposide tratamento atrasado a primeira vez de nascimento de c. elegans.
Além do atraso de postura de ovos, etoposide tratamento diminuiu significativamente o número total de ovos postos por worm (Figura 3). A toxicidade para a reprodução, a diminuição do número total de ovo pelo tratamento de etoposide, observou-se quando os vermes adultos jovens foram cultivados na presença (Figura 3B) ou ausência (Figura 3A) de tratamento contínuo etoposide. Lá não houve diferenças significativas entre os vermes controle-Tratado em ambas as condições experimentais. O número total de ovos de vermes, tratadas por um determinado período de tempo (a partir de ovos para o estágio adulto jovem) não foi significativamente diferente dos vermes continuamente tratados com etoposide. Para comparação, a análise estatística foi realizada por ida análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey.
Figura 1: A medição do crescimento em c. elegans tratados com etoposide. Idade-sincronizado c. elegans ovos foram cultivados em placas NGM suplementadas com DMSO (1%, o controle do veículo) ou etoposide (750 µM) para 24-96 h fotomicrografias (mostradas na Figura 2) foram tomadas todos os dias, e o comprimento de corpo foi medido usando Software ImageJ. Os dados são expressos como o média ± desvio-padrão (SD) (n = 50, 50 vermes por grupo). p < 0,01, para diferenças significativas entre o tratamento de controle e etoposide do veículo em cada ponto de tempo. Análise estatística foi realizada utilizando o Student t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens do microscópio estéreo de c. elegans tratadocom com etoposide. C. elegans foram tratados conforme descrito na Figura 1 (barra de escala = 1 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Número Total de ovos apresentado da c. elegans , tratados com etoposide. Idade-sincronizado c. elegans ovos foram incubados em placas NGM contendo DMSO (1%, o controle do veículo) ou etoposide (750 µM) para 64 h. Em seguida, observou-se o número total de ovos postos na ausência (A) ou presença (B) de tratamento químico contínuo por 5 dias. Minhocas foram transferidas todos os dias para o normal NGM placa (A), ou a placa NGM suplementado com os mesmos produtos químicos: 1% DMSO ou etoposide (750 µM) (B). O número de ovos postos foi contado e dividido pelo número total de worms todos os dias, para calcular o número de ovos postos por worm. Todos os números de ovos por worm foram resumidos por 5 dias. Os dados são expressos como a média ± DP de experiências quadruplicate. p < 0,01, para diferenças significativas entre o tratamento de controle e etoposide do veículo. Análise estatística foi realizada utilizando o Student t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Media de ágar normal NGM – 1.000 mL para manutenção e ensaio sem tratamento químico contínuo de postura de ovos |
| 1. adicionar 2,5 g de peptona, 3 g de NaCl, 17 g de ágar-ágar e 975 mL de água destilada em uma garrafa de vidro. |
| 2. autoclave por 15 min a 121 ° C. |
| 3. esfriar em banho-maria por 30 min a 55 ° C e, em seguida, adicione 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de colesterol de 5 mg/mL (dissolvido em etanol), 1 mL de 1 M MgSO4, 25 mL de KPO4. |
| 4. misture com agitação magnética e, em seguida, alíquota em placas de Petri (pratos de 90 x 15 mm para a manutenção; pratos de2 35 x 10 mm para o ensaio de postura de ovos). |
| 5. Guarde as placas NGM a 4 ° C até o uso. |
| Mídia DYT para o cultivo de e. coli OP50 – 500 mL |
| 1. Adicione o extrato de 2,5 g de NaCl, 5 g de fermento, 8g de peptona, e 485 mL de água destilada em um Erlenmeyer. |
| 2. autoclave por 15 min a 121 ° C. |
| 3. esfriar e armazenar em temperatura ambiente até o uso. |
| S-tampão – 1.000 mL |
| 1. adicionar 5,85 g de NaCl, 6 g de KH2PO4, 1 g de K2HPO4e 987 mL de água destilada em uma garrafa de vidro. |
| 2. Ajuste o pH da solução a 6.0. |
| 3. autoclave por 15 min a 121 ° C. |
| 4. esfriar e armazenar em temperatura ambiente até o uso. |
Tabela 1: Receipes de meios de crescimento de cultura e buffers.
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Discussion
Neste artigo, descrevemos a avaliação da toxicidade de produtos químicos em c. elegans, um nematódeo de solo, usando etoposide como um exemplo tóxica. Para este fim, usamos duas condições experimentais. No primeiro set, c. elegans foram cultivadas na etoposide contendo placas de ovos para a fase de adulta jovem, e então os vermes foram autorizados a colocar ovos em placas NGM normais sem produtos químicos. No segundo conjunto experimental, c. elegans continuamente foram tratados com etoposide durante todo o período experimental toda. Pela comparação dos números de ovo entre as duas condições experimentais, podemos decidir se a toxicidade reprodutiva dos compostos testados foi reversível ou irreversível. Etoposide diminuiu significativamente o número total de ovos colocados em ambas as condições experimentais (Figura 3). Estes dados implícito que pré-tratamento de etoposide durante a fase inicial de crescimento foi suficiente para induzir os danos aos órgãos reprodutivos, incluindo germe gonad células6; com base nestes dados, podemos especular que tratamento etoposide irreversivelmente induziu toxicidade reprodutiva em c. elegans.
Os c. elegans experimentos descritos neste artigo método, além de testes de toxicidade outra tais como a expectativa de vida do ensaio14,15, observação microscópica de células germinativas de gônada6,17, medição da taxa de bombeamento da faringe e análise de movimento18,19 também pode ser utilizada para avaliação da toxicidade química no c. elegans. Em vitro cultivadas linhas de células humanas, as células primárias, células-tronco e cultura esferoide 3D são outras opções possíveis para avaliar a toxicidade de vários produtos químicos para aumentar a limitação de c. elegans experimentos1, 6,20,21.
Embora não haja conservação evolutiva de genes essenciais em c. elegans, o organismo não-mamíferos é diferente de seres humanos em termos de sequências de proteínas, o digestivo e sistemas intestinal, metabolismo, bem como carece de muitos genes. Portanto, as experiências com animais mamíferos e ensaios clínicos são necessários para a completa avaliação da toxicidade de produtos químicos. No entanto, considerando as vantagens da conveniência e questões de ética animais, uma toxicidade de c. elegans , plataforma de teste será uma solução prática e útil para a avaliação toxicológica de vários produtos químicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado pela bolsa de investigação intramural Instituto de Coreia da ciência e tecnologia (2E27513) e o elevado valor acrescentado alimentos tecnologia desenvolvimento programa (IPET) financiado pelo Ministério de agricultura, alimentação e Assuntos rurais (315067-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
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