Summary
Un protocole de base pour évaluer la toxicité des produits chimiques chez un animal modèle, Caenorhabditis elegans, est décrite. La méthode est pratique et utile pour le développement de produits pharmaceutiques ainsi que pour l’évaluation des risques de divers polluants environnementaux.
Abstract
Évaluation toxicologique est cruciale pour comprendre les effets des produits chimiques sur les organismes vivants dans les domaines des sciences biologiques fondamentales et appliquées. Un sol non-mammifère rond ver, Caenorhabditis elegans, est un organisme modèle précieux pour les études de toxicologie en raison de sa commodité et des questions d’éthique animale par rapport aux systèmes animaux mammifères. Dans ce protocole, une procédure détaillée d’évaluation toxicologique des produits chimiques chez c. elegans est décrite. Un médicament anticancéreux clinique, étoposide, qui cible humaine topoisomérase II et inhibe la réplication de l’ADN des cellules cancéreuses humaines, a été choisi comme un modèle de tests chimiques. Âge-synchronisé c. elegans oeufs ont été exposés le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou étoposide, et ensuite la croissance de c. elegans a été surveillée tous les jours pendant 4 jours par l’observation microscope stéréo. Le nombre total de œufs mis c. elegans traités avec le DMSO ou étoposide a aussi compté en utilisant le microscope stéréo. Etoposide traitement affecté significativement la croissance et la reproduction de c. elegans. En comparaison du nombre total de œufs pondus de worms avec des périodes de traitement différent des produits chimiques, il peut être décidé que la toxicité pour la reproduction des produits chimiques sur la reproduction de c. elegans est réversible ou irréversible. Ces protocoles peuvent être utiles pour l’élaboration de divers médicaments et évaluation des risques des substances toxiques environnementaux.
Introduction
Évaluation toxicologique est essentielle pour le développement de produits pharmaceutiques, nutraceutiques et cosméceutiques, ainsi que l’évaluation des risques des différentes toxines environnementales. Le modèle de rongeur est l’un des systèmes plus populaires en vivo expérimental pour l’étude de toxicologie ; Alternativement, non-mammifère organismes comme c. elegans sont également largement utilisés. Modèles non mammifère évaluation toxicologique sont bénéfiques en raison non seulement des questions éthiques animales, mais aussi leur convenance et utilité étant donné le rapport coût/efficacité, maintenabilité, vitesse et reproductibilité1,2 ,3,4.
C. elegans, un sol rond ver, a été exploitée comme un animal modèle dans diverses recherches de biologie et chimie fondamentale et appliquée. C’est un 1 mm de long, le nématode transparent, qui est simplement maintenue en solide ou liquide nématode croissance Media (NGM) nourri avec la souche bactérienne Escherichia coli OP50. C. elegans a un cycle de vie court et sauvage N2 c. elegans Pond environ 300 œufs. Par conséquent, il se multiplie facilement pour être utilisés comme supports expérimentaux3,4,5. C. elegans a également été largement utilisé dans les études toxicologiques de beaucoup de médicaments et de polluants de l’environnement6,7,8,9.
Car de nombreux médicaments anticancéreux ciblent division rapide des cellules cancéreuses, ils peuvent également endommager les cellules normales comme la moelle osseuse, épithélium intestinal et les cellules du follicule pileux se divisant rapidement. Par exemple, les médicaments anticancéreux inhibiteur de topoisomérase ciblent le processus de réplication de l’ADN des cellules cancéreuses ; donc, ils inhibent aussi les cellules normales se divisant rapidement. Chaque organisme vivant possède les topoisomérases et ces topoisomérase inhibiteurs plus probable impact environnemental écosystèmes6,10,11. Ainsi, une plate-forme d’évaluation toxicologique de drogue utilisant un animal modèle est précieuse pour le développement de produits pharmaceutiques et d’évaluation des risques environnementaux.
Dans cet article, nous décrivons les protocoles détaillés afin de tester la toxicité de l’étoposide, qui est un agent anticancéreux clinique que cibles topoisomérase II, comme un produit chimique toxique de modèle chez c. elegans. Pour cela, nous allons décrire la méthode de mesure de la taille et le nombre total de œufs pondus chez c. elegans , traités avec l’étoposide.
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Protocol
Remarque : l’expérience entière doit être effectuée dans un laboratoire isolé propre maintenu à 20 ° C, avec peu de poussière et minimisation de contamination au cours du ver et manipulation bactérienne. À cette fin, les expériences doivent être effectuées sous la flamme d’une lampe à alcool ou à l’aide d’un banc propre.
1. entretien de c. elegans et oeuf préparation pour le Test chimique
- maintenir N2 de c. elegans (var. Bristol) sur un plat d’agar NGM nourri avec live OP50 e. coli à 20 ° C 12 , 13.
- Prepare synchronisé âge oeufs à l’aide d’eau de Javel solution traitement 5 ou le temps des oeufs portant la méthode 6 , 14 , 15.
Remarque : avant la préparation oeuf, manteau de la plaque NGM contenant de l’étoposide et inactivés par la chaleur OP50 d’e. coli comme indiqué ci-dessous. Inactivés par la chaleur E coli OP50 est utilisée pour réduire au minimum l’activité métabolique des e. coli 6 , 16.
2. Préparation d’inactivés par la chaleur des e. coli OP50 à flux C. elegans pendant l’essai de toxicité
- préparer 500 mL de levure double tryptone (DYT) milieu tel que décrit dans le tableau 1 et ensemencer une seule colonie d’Escherichia coli OP50 cultivés sur une gélose Luria-Bertani (LB) plaque 5.
- Incuber la OP50 d’e. coli dans un incubateur à agitation pendant 14 heures à 37 ° C et à 150 tr/min.
- Après centrifugation pendant 30 min à 3 220 x g et 20 ° C, enlever tout surnageant DYT milieu et ajouter un pré-mélange de 25 mL de tampon de S, 250 µL de 1 M MgSO 4 et 25 µL de cholestérol 5 mg/mL (dissous dans l’éthanol). Toutes ces solutions sont stériles.
- Remettre en suspension les bactéries et les transférer sur un tube de plastique jetable 50 mL.
- Pour inactivation par la chaleur, incuber les remises en suspension OP50 d’e. coli dans un bain-marie pendant 30 min à 65 ° C.
- Refroidir jusqu'à la température ambiante et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. Cela peut être conservée pendant jusqu'à un mois.
3. Préparation de NGM plaques contenant soit 1 % DMSO ou 750 µM Etoposide
- Prepare deux bouteilles en verre propre de 200 mL. Ajouter 0,6 g de NaCl, 0,5 g de peptone, 3,4 g de gélose, 195 mL d’eau distillée et un agitateur magnétique à une bouteille. Ajouter un agitateur magnétique à l’autre bouteille vide.
- Bouteilles autoclave ces deux pendant 15 minutes à 121 ° C, puis refroidir les bouteilles dans un bain-marie pendant 30 min à 55 ° C.
- Ajouter 0,2 mL de 1 M CaCl 2, 0,2 mL de cholestérol 5 mg/mL, 0,2 mL de 1 M MgSO 4 et 5 mL, KPO 1 M 4 (toutes ces solutions sont stériles) et ensuite les mélanger par agitation magnétique sur une plaque de cuisson à 55 ° C.
- Diviser le milieu NGM mixte dans deux bouteilles avec le même volume (100 mL). Ensuite, ajouter 1 mL de DMSO dans une bouteille, mélangez-le à l’aide de l’agitateur magnétique. Conservez l’autre flacon dans un bain d’eau à 55 ° C jusqu’au niveau suivant. Aliquote 3 mL du milieu à chaque 35 x 10 mm 2 boîte de Pétri contenant du DMSO. Cette étape peuvent fabriquer environ 33 plaques contenant du DMSO NGM.
- Mélanger l’autre bouteille à l’aide de l’agitateur magnétique, ajouter 1 mL de 75 mM étoposide (stock dissous dans le DMSO), mélangez à nouveau et répéter l’aliquote (étape 3.4). Environ 33 étoposide (750 µM)-contenant des plaques NGM peut être faite de cette étape.
Remarque : Dans la corrélation de papier précédent 6, nous avons testé 0, 250, 500 et 1 000 µM d’étoposide. D’après ces données, nous avons choisi le 750 µM d’étoposide dose dans cet article. - Cool down les plaques NGM contenant du produit chimique à la température ambiante en les laissant à température ambiante pendant environ 3 h et les stocker à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
Remarque : Dans le cas de produits chimiques sensibles à la lumière en bloquant la lumière pour minimiser la décomposition photo-induits.
Remarque : Vous pouvez également faire une plaque NGM normale sans produits chimiques pour la ponte d’essai qui peut être effectuée à l’aide de deux conditions différentes de traitement chimique, tel que décrit ci-dessous. - Ajouter 100 µL d’inactivés par la chaleur OP50 e. coli (comme décrit dans la section 2) et réparties sur chaque plaque NGM. Laisser sécher pendant la nuit dans un incubateur de c. elegans à 20 ° C pour le test chimique
4. Mesure de la croissance de c. elegans
- transfert l' âge synchronisé c. elegans d’oeufs à la plaque NGM additionnée de 1 % DMSO ou 750 µM étoposide.
- Incuber c. elegans dans un incubateur à 20 ° C pendant 4 jours. Observer les vers à l’aide d’un microscope stéréo et prendre des images microscopiques tous les jours. 20 X grossissement (1 X objectif, un grossissement zoom X 2 et la lentille oculaire 10 X) est généralement appropriée pour l’observation de la croissance de c. elegans. Également prendre une image microscopique du micromètre de microscope pour l’étalonnage de taille de vis sans fin.
Remarque : La famine affecte l’essai de toxicité. Par conséquent, nourrir avec bactéries suffisantes ou ajuster transfert c. elegans oeuf numéros au début. Observer jusqu'à 3 jours d’exclure la possibilité de mourir de faim. - Mesurer la longueur du corps c. elegans traités avec le DMSO ou étoposide à chaque point de temps à l’aide de logiciels ImageJ.
Remarque : Pour chaque mesure de l’échantillon, 50 vers suffisent pour l’analyse statistique.- Dans ImageJ, ouvrez l’image de micromètre de stade microscopique (' File ' → ' ouvrir ').
NOTE : Images de ver (étape 4.2) et de micromètre doivent être le même grossissement. - Faites glisser une ligne de 1 000 µm sur l’image de calibration du micromètre en utilisant ' ligne droite ' outil.
- Click ' Analyze ' → ' échelle définie ' et entrée 1 000 et µm dans le ' la distance connue ' boîte et ' unité de longueur ' box, respectivement. Vérifier ' Global ', puis cliquez sur ' OK '.
- Ouvrez les images de ver (' File ' → ' Open '). Tracer une ligne le long de la caractéristique de chaque ver en utilisant ' ligne à main levée ' outil. Obtenir les données de longueur de corps en cliquant ' analyse ' → ' mesure '.
- Répétez ces étapes pour 50 vers.
- Dans ImageJ, ouvrez l’image de micromètre de stade microscopique (' File ' → ' ouvrir ').
5. Dosage de portant c. elegans oeufs
oeufs- Incuber l’âge synchronisé sur le NGM plaque contenant DMSO ou étoposide pendant 64 h (avant la première naissance) jusqu’au stade jeune adult à 20 ° C.
Remarque : Il est facultatif d’utiliser les vers de l’expériences de mesure de la croissance. Il est commode de faire la mesure de la croissance et de dosage de portant des œufs ensemble. - 5 transfert vers adultes à la NGM nouvel plaques sans produits chimiques (condition 1, traitement chimique dans un certain délai de temps, des oeufs au stade adulte jeune) ou nouvelle plaque NGM contenant le même prétraitement chimique (condition 2, une exposition continue de produits chimiques par le biais de la période d’expérimentation dans l’ensemble) et puis les incuber pendant 24 h.
Remarque : Il est recommandé de faire des répétitions à l’aide de plaques NGM 3-5 pour chaque traitement ; ces répétitions peuvent être utilisées pour l’analyse statistique. - Transfert à la nouvelle plaque de NGM comme décrit ci-dessus et compter le nombre d’oeufs tous les jours. Compter les vers que rampé hors, mort et ont été intérieurement hatchéd.
- Répéter ces étapes jusqu'à ce que les vers pondent pas plus, généralement en 5 jours.
- Calculer le nombre de œufs pondus par ver de chaque plaque et somme de ces valeurs tous les jours pendant 5 jours pour déterminer le nombre total de œufs pondus.
NOTE : Exclut le nombre de vers qui a rampé hors tension et en interne éclos dans le calcul.
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Representative Results
Le traitement de l’étoposide (24-96 h) a considérablement retardé la croissance de c. elegans. Après 96 heures d’incubation, vers imprégnées d’étoposide a grandi à 0,86 mm dans la longueur du corps, tandis que les vers de véhicules traités a augmenté à 1,04 mm (Figure 1). Un retard de croissance a été observé aussi apparemment sous observation microscope stéréo (Figure 2). Nous avons commencé à voir les oeufs vers imprégnées sur le véhicule après 72 h d’incubation. En revanche, les oeufs ont été observés après 96 h de traitement de l’étoposide. Partir de ces données, nous avons supposé que l’étoposide traitement retardé la première fois de la naissance de c. elegans.
En plus du retard de Ponte, étoposide traitement diminue significativement le nombre de œufs pondus par ver (Figure 3). La toxicité pour la reproduction, la diminution du nombre d’oeufs total de traitement de l’étoposide, a été observée lorsque les vers adultes jeunes ont été cultivées en présence (Figure 3 b) ou absence (Figure 3 a) de traitement continu de l’étoposide. Il n’y a aucune différence significative entre les témoins traités vers les deux conditions expérimentales. Le nombre total de œufs de vers traitées pendant une certaine période de temps (des oeufs au stade adulte jeune) n’était pas significativement différent de celui de worms continuellement traités avec l’étoposide. Pour cette comparaison, l’analyse statistique a été réalisée par l’analyse de variance (ANOVA) suivie de test de comparaison multiple de Tukey.
Figure 1 : Mesure de la croissance chez c. elegans traités par etoposide. Âge-synchronisé c. elegans oeufs ont été cultivés sur des plaques NGM additionnés de DMSO (1 %, le contrôle du véhicule) ou étoposide (750 µM) de 24 à 96 h. photomicrographies (voir Figure 2) ont été prises tous les jours, et la longueur du corps a été mesurée à l’aide Logiciels ImageJ. Les données sont exprimées en la moyenne ± écart-type (SD) (n = 50, 50 vers par groupe). p < 0,01, les différences significatives entre le traitement de contrôle et d’étoposide véhicule à chaque instant. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de l’élève t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images de microscope stéréo de c. elegans traitement par etoposide. C. elegans ont été traités comme décrit à la Figure 1 (section Echelle = 1 mm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Nombre Total de œufs mis c. elegans traités par etoposide. Âge-synchronisé c. elegans œufs ont été incubés sur des plaques NGM contenant le DMSO (1 %, le contrôle du véhicule) ou étoposide (750 µM) pendant 64 h. Ensuite, le nombre total de œufs pondus a été observé en l’absence (A) ou la présence (B) de traitements chimiques continus pendant 5 jours. Les vers ont été transférés tous les jours à la normale NGM plaque (A), ou plaque NGM complétée avec les mêmes substances chimiques : 1 % DMSO ou étoposide (750 µM) (B). Le nombre d’oeufs pondus est compté et divisé par le nombre total vers chaque jour pour calculer le nombre de œufs pondus par ver. Tous les nombres de œufs par ver ont été additionnées pour 5 jours. Les données sont exprimées en la moyenne ± écart-type de quatre expériences. p < 0,01, les différences significatives entre le traitement véhicule de contrôle et de l’étoposide. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de l’élève t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Milieux gélosés de NGM normal – 1 000 mL pour entretien et test sans traitement chimique continu de Ponte |
| 1. Ajouter 2,5 g de peptone, 3 g de NaCl, 17 g de gélose et 975 mL d’eau distillée dans une bouteille en verre. |
| 2. stériliser pendant 15 minutes à 121 ° C. |
| 3. refroidir dans un bain d’eau pendant 30 min à 55 ° C et puis ajouter 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de cholestérol 5 mg/mL (dissous dans l’éthanol), 1 mL de 1 M MgSO4, 25 mL de KPO4. |
| 4. mélangez avec agitateur magnétique, puis aliquote de boîtes de Pétri (plats 90 x 15 mm pour l’entretien ; plats2 35 x 10 mm pour le dosage de ponte). |
| 5. conserver les plaques NGM à 4 ° C jusqu'à l’utilisation. |
| Médias DYT pour la culture d’e. coli OP50 – 500 mL |
| 1. ajouter l’extrait de 2,5 g de NaCl, 5 g de levure, 8 g de peptone, et 485 mL d’eau distillée dans une fiole Erlenmeyer. |
| 2. stériliser pendant 15 minutes à 121 ° C. |
| 3. refroidir et conserver à température ambiante avant utilisation. |
| S-tampon – 1 000 mL |
| 1. Ajouter 5,85 g de NaCl, 6 g de KH2PO4, g 1 K2HPO4et 987 mL d’eau distillée dans une bouteille en verre. |
| 2. ajuster le pH de la solution à 6.0. |
| 3. l’autoclave pendant 15 minutes à 121 ° C. |
| 4. refroidir et conserver à température ambiante avant utilisation. |
Tableau 1 : Recettes de milieux de culture de la culture et les tampons.
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Discussion
Dans cet article, nous décrivons l’évaluation de la toxicité des produits chimiques chez c. elegans, un nématode du sol, utilisant l’étoposide comme un exemple de produits toxique. À cette fin, nous avons utilisé deux conditions expérimentales. Dans le premier set, c. elegans ont été cultivées sur étoposide contenant des plaques d’oeufs au stade adulte jeune, et puis les vers étaient autorisées à pondre sur des plaques NGM normales sans produits chimiques. Dans le deuxième set expérimental, c. elegans ont reçu en permanence étoposide tout au long de la période expérimentale ensemble. En comparaison des nombres oeufs entre les deux conditions expérimentales, nous pouvons décider si la toxicité pour la reproduction des composés testés était réversible ou irréversible. Étoposide a considérablement diminué le nombre de œufs pondus dans les deux conditions expérimentales (Figure 3). Ces données implicitement que le prétraitement de l’étoposide durant les premiers stades de croissance est suffisant pour induire des dommages aux organes reproducteurs, y compris des gonades cellules6; Selon ces données, nous pourrions spéculer que l’étoposide traitement induit irréversiblement toxicité pour la reproduction chez c. elegans.
Outre les expériences de c. elegans décrits dans cet article de la méthode, toxicité pour d’autres tests tels que la durée de vie de14,15, observation microscopique des gonades des cellules germinales6,17, dosage mesure du débit de pompage pharyngée et mouvement analyse18,19 peut également servir pour l’évaluation de la toxicité chimique chez c. elegans. In vitro cultivée des lignées cellulaires humaines, cellules primaires, cellules souches et la culture de sphéroïde 3D sont les autres options possibles pour l’évaluation de la toxicité de diverses substances chimiques afin d’augmenter la limite de c. elegans expériences1, 6,20,21.
Bien qu’il y a conservation évolutive des gènes essentiels chez c. elegans, l’organisme non-mammifère est différente de l’homme en termes de séquences protéiques, le digestif et intestinales systèmes, métabolisme, ainsi il n’a pas beaucoup de gènes. Par conséquent, l’expérimentation animale chez les mammifères et les essais cliniques sont nécessaires pour l’évaluation complète de la toxicité des produits chimiques. Toutefois, compte tenu des avantages de la commodité et les questions d’éthique animales, une plate-forme de c. elegans toxicité sera une solution utile et pratique pour l’évaluation toxicologique des divers produits chimiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par la subvention de recherche intra-muros Korea Institute of Science and Technology (2E27513) et la haute valeur ajoutée alimentaire technologie développement programme (IPET) financé par le ministère de l’Agriculture, des aliments et des affaires rurales (315067-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
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