Summary
In dit protocol, we beschrijven van technieken voor de juiste dissectie van Arabidopsis bloemen en siliques, sommige fundamentele clearing-technieken, en geselecteerd kleuring van procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.
Abstract
Als gevolg van zijn geweldige hulpmiddelen voor moleculaire genetische studies is Arabidopsis thaliana een van de meest prominente model soort plantenbiologie en, vooral, reproductieve biologie van de plant. Echter, plant morfologische, anatomische en ultrastructurele analyses traditioneel betrekken tijdrovende insluiten en segmenteren van de procedures voor heldere veld, scannen en elektronenmicroscopie. Recente vooruitgang in confocale fluorescentie microscopie, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopische analyses en de continue verfijning van moleculaire technieken om te worden gebruikt op minimaal verwerkte geheel-mount monsters, heeft geleid tot een toegenomen vraag naar de ontwikkeling van efficiënte en minimal steekproef verwerkingstechnieken. In dit protocol, beschrijven we technieken voor goed ontrafeling van Arabidopsis bloemen en siliques, fundamentele technieken, clearing en sommige kleuring procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.
Introduction
Bloemen zijn een van de belangrijkste organen van bedektzadigen definiëren. Bloeiende planten ongeveer 90-130 miljoen jaar geleden verscheen1, en gediversifieerde zo snel dat hun snelle verschijning werd beschreven als een "verschrikkelijke verborgenheid" door Charles Darwin2. De belangen van plant onderzoekers in Bloemontwikkeling zijn divers. Wat onderzoek heeft zich gericht op het begrijpen van de evolutionaire oorsprong van de bloem als geheel, of de ontwikkeling van specifieke anatomische, structurele en functionele eigenschappen van bloemen3,4,5,6 . De hoge variatie in floral vorm en structuur, evenals de vervoermiddelen seksuele en ongeslachtelijke voortplanting beroep op hen, maken de bloem een zeer complexe structuur. Dit heeft geleid tot diverse inspanningen te karakteriseren van de anatomie en de structurele kenmerken van floral organen, met behulp van licht en elektron microscopische technieken die kunnen worden gecombineerd met genetische en moleculaire onderzoeken7. Bovendien, als de bron van vruchten en zaden, zijn bloemen van het allergrootste belang voor de voeding van mens en dier. Dus, de karakterisatie van bloem en fruit ontwikkeling heeft veel gevolgen voor toegepast onderzoek, met inbegrip van de veiligstelling van de voedselvoorziening voor een toenemende menselijke bevolking en de strategieën van de ecologische behoud onder een veranderende omgeving8 , 9 , 10.
Bloemontwikkeling Arabidopsis begint met bloem inductie en de transformatie van de vegetatieve meristeem aan een meristeem bloeiwijze (groep van bloemen). Bloem primordia zijn lateraal gestart op de flank van de bloeiwijze meristeem11. De bloemen orgel primordia vormen geleidelijk in concentrische slierten van buiten naar het midden van de bloem, en zich uiteindelijk ontwikkelen tot kelkbladen, bloemblaadjes, meeldraden en carpellen7. Deze bloemen organen vervullen verschillende voedend, beschermende en functionele (bijvoorbeeldpollinator attractie) rollen in verschillende plantensoorten, met het ondersteunen van de ontwikkeling van mannelijke en vrouwelijke gametofyten, respectievelijk12 geslachtsorganen , 13. de gametofyten, op zijn beurt, elk onderscheiden een paar van mannelijke (sperma) en vrouwelijke gameten (ei en centrale cel), die verenigen op dubbele bevruchting tot het vormen van de volgende generatie, de zygote en de primaire endosperm, een terminal weefsel, ter ondersteuning van de ontwikkeling van het embryo14,15. Vruchten en zaden ontwikkeling steunen de groei, rijping en bewaring van het embryo en, uiteindelijk, de versnippering. Uitgebreid onderzoek heeft verricht om het karakteriseren van bloem en embryo-ontwikkeling in diverse plantensoorten, vooral in de model soorten Arabidopsis7,16,17.
Vroege microscopische analyses van de bloemontwikkeling waren gebaseerd op tijdrovende monster verwerking en observatie technieken, zoals paraffine of hars inbedding en segmenteren, in combinatie met licht of elektronenmicroscopie. Deze traditionele microscopische technieken werden vaak gebruikt in combinatie met moleculaire genetische onderzoeken, zoals microscopische analyses van mutanten, de lokalisatie van RNA door in situ hybridisatie, of de immuno-detectie van eiwitten. Recente vooruitgang in breed-gebied en confocal fluorescentie microscopie, in de state-of-the-art 3-D computer-aided beeld analyses, en de continue verfijning van moleculaire methoden die kunnen worden gebruikt op minimaal verwerkte geheel-mount monsters, heeft geleid tot een behoefte aan efficiënte en minimal steekproef verwerkingstechnieken die bij voorkeur zich lenen voor kwantitatieve analyses. In de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van clearing technieken op geheel-mount dierlijke exemplaar. Zij maken het monster transparant door gebruik te maken van waterige ureum of suiker gebaseerde reagentia (bijvoorbeeld, schaal, SeeDB, CUBIC)18,19,20, of door het selectief verwijderen van lipiden (met het detergent SDS) na monsters te Embedding in stabiele hydrogels; de verwijdering van lipiden kan worden bereikt door passieve diffusie (b.v.gewijzigd duidelijkheid protocol21, PACT-PARS-velgen22) of actief door elektroforese (oorspronkelijke duidelijkheid protocol23 en ACT-PRESTO-24). Aangemoedigd door deze snelle vooruitgang, enkele afgeleide technieken zijn ook in opkomst voor gebruik in planten.
In deze paper methoden gericht op het model Arabidopsis, beschrijven we de procedure voor de juiste dissectie van de bloemknoppen, bloemen, en jonge siliques en het opruimen van geheel-mount monsters voor uiteenlopende kleuring en observatie procedures met klassieke of een recente SDS gebaseerde clearing methode. Voorbeelden voor zetmeel, callose en chromatine kleuring worden gegeven. Hoewel deze procedures verdere wellicht verbeteringen en aanpassingen bij gebruik in combinatie met andere soorten, we hopen dat ze zal het decor voor verder onderzoek op deze eenvoudige maar kritische methoden die het startpunt van vele onderzoeksprojecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bloem en Hauw fixatie
- Oogst bloemen en siliques uit planten gesynchroniseerd bij de opening van de eerste bloem.
Opmerking: Onder de experimentele omstandigheden hier gebruikt, starten planten bloeien ongeveer 21 dagen na de transplantatie van Murashige en Skoog (MS) platen voor de bodem. Zaden zijn gelaagde voor 3-4 dagen bij 4 ° C en ontkiemd/geteeld op MS platen bij 22 ° C/16 h licht en 18 ° C/8 uur donker voor 8 tot 10 dagen, vóór het transplanteren van de zaailingen op voedselrijke bodem in potten bewaard onder dezelfde voorwaarden (Figuur 1). Het aantal replicatieonderzoeken hangt af van het specifieke onderzoek doel, maar een minimum van 5 bloeiwijzen (uit 5 afzonderlijke fabrieken) voor elke behandeling wordt aanbevolen. Als de bloemen zijn de experimentele eenheid, wordt een minimum van 10 bloemen per repliceren aanbevolen. - Knip bloeiwijzen of bloemen (figuur 1E-H) met behulp van kleine schaar (b.v., nagelschaartje) en plaats ze onmiddellijk in een microcentrifuge buis (voor de enkelvoudige bloeiwijze/bloem fixatie) of een conische buis (voor de collectieve vastleggingen) bevattende vers gemaakt van Carnoy, methanol/azijnzuur of FPA50 fixatives (afhankelijk van de toepassing, zie hieronder) op het ijs.
Opmerking: Monsters moeten volledig worden ondergedompeld in het fixeer. - Laat het weefsel binnen de fixeerspray voor 4 uur naar girale bij 4 ° C.
Opmerking: Vacuüm infiltratie kan worden gebruikt voor het versnellen van de penetratie van de fixeerspray in het weefsel, maar dit schadelijk kan zijn voor het behoud van de structuur van het weefsel. De auteurs voeren niet vacuüm infiltratie. - Het fixeer verwijderen, toevoegen van genoeg 70% ethanol ter dekking van de monsters en terugsturen tot 4 ° C gedurende ten minste 24 uur; monsters kunnen blijven voor onbepaalde tijd in deze oplossing. Na het verwijderen van ethanol, ga onmiddellijk naar de volgende stap; dissectie of SDS clearing.
2. dissectie onder de stereomicroscoop
- Zet vers gemaakte 70% ethanol in van de maker van een horloge glas geplaatst op een kleine petrischaal voor steun.
-
Plaats de bloeiwijze/bloem/Hauw op dit vers gemaakt fixeer en ontleden onder de stereomicroscoop met pincet en een injectiespuit met een naald.
- Gebruik van de maker van een horloge glas of soortgelijk apparaat waarmee de monsters te worden volledig bedekt met ethanol (aanbevolen) voor de dissectie van bloeiwijzen en verscheurt floral organen van volwassen bloemen (kelkbladen, bloemblaadjes en meeldraad kan worden ontleed in dit stadium ) om te voorkomen dat het risico van monsters uitdrogen.
-
Ontleden siliques en kleine bloemknoppen op een dia, zoals hieronder beschreven.
- Van de maker van het horloge glas met voorbewerkte monsters opzij zetten, en gebruik van een normale dia voor de definitieve dissectie.
- Het monster van belang naar de dia en voeg 10 µL van verse 70% ethanol. Werk snel op de laatste dissectie en voeg 10 µL van ethanol, indien nodig, het monster om vochtig te houden zonder buitensporige vloeistof.
- Voor het vrijgeven van stuifmeel korrels van meeldraden, zie stap 5.1. Voor ontrafeling van de carpellen en de zaadknoppen, volgt u de procedure die is beschreven in Figuur 2. Deze procedure is van toepassing op alle stadia van de ontwikkeling van de carpel, met inbegrip van de fase van de ontwikkeling van groene siliques.
Opmerking: Voeg geen ethanol, als er voldoende ethanol "Carry-over" van de verhuizing van de monsters; Ontrafeling van zeer kleine steekproeven is veel gemakkelijker in een minimale hoeveelheid vloeistof. Houd altijd alleen de organen van belang (kelkbladen, bloemblaadjes, meeldraden, carpellen, zaadknoppen, zaden of stuifmeel korrels) op de dia. Deze procedure zorgt voor een uniforme dikte tussen de dia en dekglaasje aan, overeenkomt met de dikte van het orgaan onderzochte, wat resulteert in een hogere homogeniteit, en dus efficiëntie voor microscopisch onderzoek (hoger aantal exemplaren van het doel in het zelfde brandvlak).
- Gebruik een klein stuk Vloeipapier te absorberen en verwijder zoveel ethanol mogelijk. Snel overgaan naar de volgende stap (sectie 3, 4 of 6) voordat de monster droogt uit.
3. Chloraalhydraat gebaseerde Clearing en gecombineerde Clearing-kleuring
Opmerking: Beste resultaten voor de clearing Chloraalhydraat gebaseerde worden verkregen met FPA50 vast materiaal.
- Plaats 20 µL van clearing oplossing (Chloraalhydraat/glycerol, gewijzigd Hoyer van medium, Herr's 4½ of Herr's IKI-4½ oplossingen) op de dia specimen dragende. Met behulp van een paar spuiten met hypoderme naalden, positie van de specimens desgewenst door het verminderen van de ruimte tussen hen, en flipping degenen waar het orgel van belang gezichten naar beneden. Verwijder eventuele resterende luchtbel met behulp van de naald.
- Verlagen van een dekglaasje aan zijwaarts voorzichtig plaats, heel voorzichtig op te drukken en wachten tot de oplossing van de clearing de ruimte tussen vult. Voeg minimaal clearing oplossing, indien nodig, de hele ruimte onder het dekglaasje aan te vullen.
- Plaats van de dia op een dia houder en laat deze onder de zuurkast. Ga naar microscopische opmerkingen na ten minste 4 uur en gedurende de volgende 4 – 5 dagen.
4. gecombineerd Alexander kleuring en Herr's 4½ Clearing van helmknoppen
Opmerking: De originele Alexander-protocol is gebaseerd op het vrijgeven van stuifmeel korrels op de dia vóór kleuring. Een efficiënte en informatiever, gemodificeerde Alexander kleuring en het opschonen van de procedure is de kleuring van volwassen stuifmeel korrels binnen de helmknoppen van volwassen maar niet-dehiscent.
- Kies vers geoogste bloemknoppen die zijn bezig met openen met niet-dehiscent helmknoppen.
Opmerking: Neem geen jongere bloemknoppen omdat Alexander kleuring is bedoeld voor volwassen stuifmeel korrels en doet geen efficiënt onvolwassen stuifmeel korrels vlekken. Een minimum van 5 bloemen per behandeling van verschillende planten en bloeiwijzen geoogst wordt aanbevolen. - Een 96-wells-plaat met genoeg Alexanders oplossing te dompelen een bloem bud voor te bereiden. De helmknoppen bloot doordat de kelkbladen en bloemblaadjes en hen onder te dompelen in Alexanders oplossing. Houd de monsters onder de zuurkast voor 1 – 3 h.
- Alexanders oplossing vervangen door Herr's 4½ oplossing en plaats de multi goed plaat terug onder de zuurkast voor een overnachting incubatie.
- Met behulp van Tang, zachtjes gaan de gewiste bloemknoppen op een nieuwe dia Aangezien sommige "Carry-over" van Alexanders oplossing optreden kan, kunt een vloeipapier verwijderen zoveel clearing-oplossing mogelijk.
- Ontleden van de meeldraden en verwijder alle andere weefsels. Volg de stappen in sectie 3 met behulp van Herr's 4½ oplossing.
5. het verwijderen van de Exine van stuifmeel korrels
Opmerking: Raden We de Carnoy fixatief voor de DAPI kleuring.
- Volg de fixatie en dissectie procedures beschreven in de punten 1 en 2. Onderhand, moet men een te veel meeldraden op de dia binnen een minimumbedrag van 70% ethanol.
- Gebruik een vloeipapier verwijderen overtollige ethanol en voeg 5-10 µL van DAPI oplossing. Met een paar spuiten met naalden, laat de stuifmeel korrels binnen die kleine hoeveelheid oplossing (bijvoorbeeldgebruik van een spuit te immobiliseren van de meeldraad en anderzijds om de stuifmeel korrels). Voeg een andere 5 µL van DAPI als de oplossing droogt uit.
- Het verwijderen van alle vuil van de meeldraad is een cruciale stap, zodat alleen stuifmeel korrels zitten tussen de dia en het dekglaasje aan.
- Plaats van een dekglaasje aan op de specimen dragende dia door het verlagen van het zijwaarts en voeg de minimale hoeveelheid DAPI oplossing nodig om de ruimte te vullen. Plaats een wijsvinger op het dekglaasje aan, en zonder het te pletten veel maken een snelle, stevige en korte glijdende beweging.
Opmerking: Om te peilen de nodige kracht en de amplitude van de glijdende beweging, deze stap moet beoefend worden meerdere malen, controleren de resultaten telkens onder de Microscoop. - DAPI oplossing Voeg indien nodig en plaats de dia in een vochtige vak in het donker bij 4 ° C gedurende 15 min. tot 1 h. treed toe tot het nemen van monsters onder breed-gebied fluorescentie- of confocale microscopie binnen 24 h. probeert te combineren deze procedure met SDS wissen om te controleren of verder verbeteren menten kan worden verkregen.
6. natrium Dodecyl Sulfaat (SDS) wissen
Opmerking: Afhankelijk van de bloemen orgel te analyseren, en van de onderzoeker vaardigheden te ontleden zeer zacht en kleine exemplaren, de SDS behandeling kan worden uitgevoerd voordat (voor ervaren onderzoekers) of nadat de dissectie stap (voor minder ervaren onderzoekers) op methanol-azijnzuur vaste materiaal.
- Gebruik van de maker van een horloge glas, een holle dia of een microcentrifuge buis aan ontleed of niet-ontleed monsters in 1% SDS en 0,2 N NaOH oplossing 's nachts bij kamertemperatuur incuberen.
- Voorzichtig behandelen omdat het monster zeer zacht is en een transparante uitstraling heeft. Spoel verschillende malen met water.
Opmerking: Restanten van de SDS-oplossing kunnen leiden tot neerslag bij het toevoegen van de kleurstofoplossing bv, aniline blauw. - Voor niet-ontleed monsters, volg de dissectie-procedure die wordt beschreven in sectie 2, met behulp van water in plaats van 70% ethanol. Na de ontrafeling van het gewenste weefsel, Verwijder eventuele resten en puin, en overtollig water met een vloeipapier, dan toevoegen van 20 – 40 µL van kleurstofoplossing en ga verder met stap 6.5.
- Voor ontleed monsters, zorgvuldig Verplaats het monster uit de oplossing wassen en plaatst u deze op een schone dia en toevoegen van 20 – 40 µL van kleurstofoplossing.
- Zachtjes Breng een dekglaasje aan op de dia door zijwaarts verlagen. Wees voorzichtig niet te pletten van de voorbereiding. Als het weefsel te zacht is, verlaten plaats om het even welk scheidingsteken in tussen de dia en het dekglaasje aan op de hoeken (b.v., tape of een gebroken dekglaasje aan), dunne een kamer-achtige ruimte tussen dia en dekglaasje aan, zodanig dat het dekglaasje aan het model niet verpletteren.
- Plaats alle dia's in een vochtige doos, bedekken met aluminiumfolie en plaats deze bij 4 ° C gedurende ten minste 1 h. treed toe tot het observeren van het model met behulp van widefield fluorescentie- of confocale microscopie binnen de 24u.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arabidopsis behoort tot de familie van Brassicacea, rekening houdend met bloeiwijzen met biseksuele bloemen gerangschikt in een corymb (Figuur 1). Elke bloem heeft vier kelkbladen, vier bloemblaadjes, zes meeldraden (vier lange en twee korte) en een syncarpous vruchtbeginsel bestaande uit twee congenitaal gesmolten carpellen (figuur 1F-H) gerangschikt in vier concentrische slierten25,26. Arabidopsis heeft tenuinucellate, anatropous zaadknoppen gerangschikt in de pariëtale placentation in twee rijen (12-20 zaadknoppen in elke rij) binnen elk van de twee locules van het ovarium (een totaal van 45-80 zaadknoppen) (niet-gepubliceerde gegevens, en verwijzingen27, 28 , 29 , 30). om er te robuust vergelijkende analyses van bloem en embryo-ontwikkeling binnen een afzonderlijke plant of tussen verschillende planten (als replicatieonderzoeken of behandelingen), is het raadzaam om de eerste open bloem gebruiken als een verwijzing (figuur 1b). in dit stadium heeft de bloeiwijze (figuur 1E) meestal tussen 20 en 30 bloemknoppen verspreid over alle stadia van de bloemontwikkeling, en in ruwweg gelijkaardig stadia van andere personen (niet-gepubliceerde gegevens). Meer bloem meristems (vorming van tussen 5 en 20 bloemen) zal worden ingeleid door het meristeem bloeiwijze, nadat de eerste bloem geopend. De eerste twee bloemen vruchtbaarheid gebreken kunnen vertonen en, vandaar, niet moeten worden opgenomen in de analyse.
Arabidopsis bloemen en bloemen organen met Chloraalhydraat gebaseerde wissen wordt wissen oplossingen31,32, met inbegrip van Herr's 4½ clearing oplossing33, meestal uitgevoerd voor differentiële interferentie contrast ( DIC) microscopische analyses van bloem, Hauw en embryo-ontwikkeling (figuur 3A-J). De 4½ oplossing is speciaal aanbevolen voor het analyseren van de meeldraad ontwikkeling, en voor organen die sterker clearing capaciteit vereisen. Sommige Chloraalhydraat gebaseerde oplossingen worden gebruikt voor het dubbele doel van clearing en kleuring tegelijkertijd; Dit is het geval voor de oorspronkelijke Alexanders34 en Herr's IKI-4½35,36 oplossingen. Alexander kleuring wordt het wijd gebruikt in Arabidopsis ter beoordeling van stuifmeel abortus. Een gewijzigd en meer informatieve Alexander kleuring procedure37 is om hele helmknoppen met volwassen stuifmeel korrels vlek. Deze procedure moet een posterieure verrekening van de helmknoppen die met behulp van Herr's 4½ oplossing (Figuur 3 K-L). Andere kleuring technieken die worden gebruikt in verschillende plantensoorten biedt wellicht een betere schatting van stuifmeel levensvatbaarheid (b.v.de fluorochromatic reactie met behulp van fluoresce¨ une DIACETAAT, kleuring voor callose, zetmeel, DNA, RNA en enzymatische tests met redox kleurstoffen)38,39,40. Echter, de meeste van deze technieken beoordelen een specifiek aspect van de stuifmeel-graan dat niet per se met stuifmeel levensvatbaarheid en, belangrijker, stuifmeel vruchtbaarheid correleren misschien. Een evaluatie van stuifmeel kiemkracht vermogen, en haar vermogen om het effect van bevruchting en instellen van zaden wellicht nauwkeuriger38--40. Een veel minder gebruikte clearing-kleuring procedure is Herr's IKI-4½, die verrekeningsovereenkomsten en zetmeel-kleuring oplossingen combineert. Naast kleuring voor zetmeel (Figuur 4), kan deze procedure worden gebruikt voor algemene clearing doeleinden, wanneer hoger contrast nodig (bijvoorbeeld figuur 3A, E).
Een combinatie van auramine en calcofluor wordt gebruikt in veel plant soorten41 om gelijktijdig vlek het stuifmeel exine en intine (figuur 5A). De meeste van deze en andere chemische kleurstoffen doen geen vlekken één cellulaire component en, vandaar, moeten worden gebruikt in combinatie met directere labeling technieken zoals GUS of fluorescently-tagged marker-lijnen, antilichamen of in situ hybridisatie. Ze tonen ook misschien meerdere excitatie en emissie spectra. DAPI, daarentegen, is specifieker, en wordt meestal gebruikt om vlek chromatine en chromosoom spreads42 tijdens meiose en te volgen van stuifmeel ontwikkeling43, afgezien van haar veelvuldige toepassingen als een counterstain voor de kern. Hier, laten we zien hoe de kleuring intensiteit kan worden verhoogd om het verkrijgen van een meer gedetailleerde weergave van de chromatine van sperma en vegetatief kernen door het mechanisch verwijderen van de exine (figuur 5B-C). Hoewel deze techniek zeer nuttig voor diegenen die geïnteresseerd zijn is in het uitvoeren van gedetailleerde analyses van de chromatine, chromosomen, en nucleaire structuur, de mechanische verwijdering van de exine invloed kan zijn op de organisatie van het stuifmeel graan, zodanig dat de resultaten moeten zijn met zorg worden geïnterpreteerd.
De meeste van deze fluorescente kleurstoffen worden gebruikt zonder voorafgaande clearing van het weefsel; maar in sommige gevallen zijn ze compatibel met recentere Chloraalhydraat gebaseerde wissen op de dia44. SDS clearing onlangs is gebruikt als reagens in de veterinaire en fytosanitaire onderzoek clearing en heeft aangetoond dat compatibel is met verschillende kleuring procedures voor widefield fluorescentie en confocale microscopie (mPS-PI45 in planten en duidelijkheid23, PACT22 of ACT-PRESTO24 in dieren). Met behulp van een SDS-NaOH wissen vóór aniline blauwe vlekken (figuur 5D-H), kunnen we bereiken hogere toegankelijkheid van interne weefsels, alsmede een beter kleuring voor callose binnen floral weefsels (figuur 5I-L). Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor calcofluor (gegevens niet worden weergegeven).
Figuur 1: Foto's van Arabidopsis planten en bloemen. (A-D) Arabidopsis planten in verschillende stadia van de levenscyclus: rozet voor buil (A), op de eerste bloem opening (B), met een primaire en een paar secundaire bloeiwijzen (C) en aan het einde van de bloei (D). (E) de typische corymb van een Arabidopsis bloeiwijze met bloemen op verschillende ontwikkelingsstadia, acropetally rijpen. (F-H) Een Arabidopsis bloem op anthesis, illustreren zelfbestuiving (meeldraad aanraken van het stigma en het vrijgeven van stuifmeel korrels). Cijfers E-H zijn focus stapels van 36, 53, 42 en 32 foto's, respectievelijk, geassembleerd met behulp van een softwaretool (bijvoorbeeldHelicon Focus). F-H vertegenwoordigen de dezelfde bloem waar een kelk, twee bloemblaadjes en een korte stam in Hwerden verwijderd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: hoe om te ontleden een vruchtbeginsel en zaadknoppen. (1-3) plaats het vruchtbeginsel op een dia met een minimale hoeveelheid van 70% ethanol en positie handen zoals afgebeeld in de tekening. Make snijdt 1-3 na de richtingen door de rode pijlen aangegeven. Gebruik de naald met de opening geconfronteerd met omhoog en weg van de zaadknoppen voor bezuinigingen 2-3. (4-6) de carpel 180 graden draaien zoals en snoeien 4-6, zoals de eerste drie bezuinigingen. (7) het verwijderen van de kleppen: gebruik de naald met de opening naar beneden, plaats deze onder de zaadknoppen en schuif de naald snel naar rechts langs de marge van de klep. Voor grotere carpellen (anthesis en verder), of met de deskundigheid van sommige dissectie, een deze stap herhaalt u stap 2 en 5 aan de andere kant van de carpel kunt vervangen. (8-9) het stigma-stijl en de peduncle met sharp snijdt met behulp van de naald met de opening zijwaarts en weg van de zaadknoppen verwijderen. (10) maken een klein scherp gesneden op het verzendende weefsel niveau één van de twee uitersten. (11) de verlostang en de naald gebruiken om te scheuren van de twee helften. (12) met behulp van de verlostang en de naald, zachtjes flip zaadknoppen te verkrijgen van twee parallelle rijen één rij. Uitwijkmogelijkheid, plaatst u de twee rijen verticaal met de replum liggen boven en duw zachtjes naar beneden langs de replum te verspreiden van de twee zaadknop rijen aan beide zijden. Twee afgevlakt, maar nog steeds gehecht rijen van zaadknoppen nadat clearing en kleuring met Herr's IKI-4½ oplossing worden weergegeven als een illustratie van het resultaat van de dissectie. Schaal bars = 80 µm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Chloraalhydraat gebaseerde clearing met of zonder kleuring tijdens Bloemontwikkeling. (A) A jonge bloem bud. (B-E) Meeldraad ontwikkeling met microspore moeder cellen in cytokinese (B), tetrads van microspores (C), stuifmeel mitose ik (D), en tricellular stuifmeel korrels (E). (F-J) Vruchtbeginsel met zaadknoppen met megaspore moeder cellen (pijl) voorafgaand aan de meiose (F en G) en tijdens Meiotische profase I (H), met een binuclear embryo sac (pijl), (ik), en bij de bevruchting (J). Opmerking het spoor van een stuifmeel buis (pijl) binnen de micropylar regio van de zaadknop in J. (K-L) Gemodificeerde Alexander de verkleuring van de helmknoppen met volledige (K) of verminderde stuifmeel levensvatbaarheid als gevolg van hittestress (L). Noteer de lege cytoplasma en onregelmatige vormen van afgebroken stuifmeel korrels binnen de locules van de helmknop in L. Arabidopsis wild-type Col-0 toetreding. Ontruimen of kleuring: Herr's 4½ voor B-D en F-J, Herr's IKI-4½ voor A en E, en Alexander kleuring voor K-Lbewerkt. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: zetmeel dynamiek tijdens bloem en vroeg zaad ontwikkeling. Representatieve resultaten illustreren de dynamische zetmeel omzet tijdens de bloemontwikkeling van de. (A-C) De derde golf van zetmeel amylogenesis/amylolysis tijdens de laatste stadia van ontwikkeling van de stam zo onlangs beschreven39. (D-G) Representatieve resultaten van de unieke zetmeel Golf in het stuifmeel graan met een piek van amylogenesis in het bicellular stadium. (H-N) Representatieve resultaten van zetmeel dynamiek in zaadknoppen stadium megaspore moeder cel (H), bij de ontwikkeling van de vrouwelijke gametofyten (-K), en tijdens de vroege ontwikkeling van het zaad (net na de bevruchting in L, binucleate endosperm in M , en octant embryo etappe in N). Arabidopsis wild-type Col-0 toetreding. Schaal bars = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: sommige klassieke kleuring van procedures voor fluorescentie microscopie en het effect van SDS-clearing. (A) Calcofluor-Auramine kleuring tijdens de rijping van de pollen waar de intine blauwe is gekleurd (calcofluor) en de intens groene exine (Auramine). (B-C) Mechanische verwijdering van exine en DAPI kleuring van tricellular stuifmeel korrels. (D-H) Representatieve foto's van een bloeiwijze vóór (D, zoals verhaald fixeerspray) en na SDS wissen (E-H). Opmerking de transparantie van het weefsel waarmee de waarneming van de therapieën binnen de steel van de bloeiwijze (G) en de bloem bud peduncle (H). (Ik-J) Aniline blauw kleuring voor callose in microspores in het stadium van de tetrad binnen de meeldraad. Vergelijken van de helderheid en de intensiteit van de kleuring tussen de niet-SDS gewist helmknop (ik) en de SDS-gewist helmknop (J). (K) een SDS-gewist en aniline blauw gekleurd helmknop met microspores tijdens stuifmeel mitose I. merk de synchrony van veel stuifmeel korrels in dit stadium van deze twee locules. (L) een SDS-gewist en aniline blauw gekleurd zaadknop na de bevruchting. Opmerking callose vlekken in de overblijfselen van het stuifmeel buis en in de vacht van het zaad. Arabidopsis wild-type Col-0 toetreding. Schaal bar = 20 µm (A-C,-L); 1 mm (D-H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bestaan van vele bloemknoppen binnen een enkele bloeiwijze van Arabidopsis, verspreid over alle ontwikkelingsstadia van de bloem, biedt een unieke gelegenheid voor studies gericht op de karakterisering van een effect van een behandeling of een ontwikkelingstoxiciteit functie gelijktijdig in de verschillende stadia van Bloemontwikkeling. Een goede referentiepunt tussen verschillende individuele planten is de opening van de eerste bloem van de belangrijkste bloeiwijze. Planten worden behandeld op een zodanige wijze dat de bloei is gesynchroniseerd zo veel als mogelijk (bijvoorbeeld3 – 4 dagen stratificatie bij 4 ° C maximaliseert synchrone zaad ontkieming en vandaar gelijkmatiger bloei) en alleen planten die hun eerste bloem op dezelfde dag worden geopend zijn Als een partij genomen te verdelen tussen behandelingen en replicaten; batches klaar op opeenvolgende dagen kunnen worden gebruikt om te repliceren het experiment. Na deze procedure, meer robuuste vergelijkende analyses, controle voor milieu en ontwikkelingsproblemen variaties binnen en tussen planten, kan worden uitgevoerd.
Combineren Lugoljodium vlek met Herr's clearing oplossing konden we niet alleen om het contrast in gewiste monsters in vergelijking met klassieke clearing oplossingen, maar ook te karakteriseren zetmeel dynamiek tijdens de bloem en embryo-ontwikkeling, zoals onlangs gemeld voor Arabidopsis 46. met behulp van deze eenvoudige procedure, konden we aan het ontrafelen van het bestaan van een nieuwe golf van zetmeel amylogenesis-amylolysis tijdens de ontwikkeling van de helmknop en te correleren zetmeel dynamiek met mondiale veranderingen in de expressie van genen die coderen eiwitten betrokken in suiker en zetmeel metabolisme. Deze analyse toonde aan dat GPT6 de translocator van suiker-fosfaat uit het cytosol te amyloplasts voor zetmeel synthese is. De gedetailleerde resultaten op de dynamiek van het zetmeel in verschillende weefsels opent de mogelijkheid voor het karakteriseren van andere belangrijke genen in zetmeel metabolisme en inspelen op onopgeloste vraagstukken met betrekking tot minder bestudeerde maar belangrijke fasen van de ontwikkeling van planten. Jodium gebaseerde zetmeel kleuring is geen kwantitatieve, en moet worden aangevuld met andere methoden46.
Onderzoek op zoek naar verbeterd clearing procedures die compatibel met fluorescentie microscopie zijn heeft de laatste jaren, vooral op het gebied van dierlijke geïntensiveerd. Hoewel het onderzoeksveld plant achterloopt, en clearing grotendeels afhankelijk van traditionele clearing oplossingen voor DIC analyse (bijvoorbeeld, Chloraalhydraat gebaseerde oplossingen, benzyl benzoate, dibutylftalaat en methyl salicylaat)31 ,33,47,48, aangemoedigd door de snelle vooruitgang geboekt op het gebied van dieren, sommige soortgelijke technieken ontstaan met ureum - (b.v., ClearSee49 en anderen50), en 2, 2'-thiodiëthanol-gebaseerde procedures51,52wissen. Hier, laten we zien dat het gebruik van het detergent SDS in combinatie met NaOH het weefsel transparant maakt en verbetert sommige klassieke fluorescentie kleuring van procedures, zoals aniline blauw voor callose en calcofluor voor cellulose. Gebaseerd op deze veelbelovende resultaten, kan vergelijkbare vooruitgang in de SDS gebaseerde selectieve verwijdering van lipiden worden verwacht op het gebied van de plant in de nabije toekomst. Aangezien plantencellen hebben rigide celwand die afwezig zijn in dierlijke cellen, de voorafgaande insluiten in hydrogels macht niet zitten noodzakelijk, zoals het geval voor dierlijke weefsels. Andere fluorescente kleurstoffen en fluorophores gebruikt in genetische marker-lijnen kan worden bepaald met behulp van deze clearingprocedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Zürich, een IEF Marie Curie Grant (toekennen neen. TransEpigen-254797 naar A.H.), een Advanced Grant van de European Research Council (verlenen neen. Medea-250358 naar U.G.), en een onderzoek en technologische ontwikkeling project (grant MecanX aan U.G.) van SystemsX.ch, het Zwitserse initiatief in de systeembiologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Gum arabic | Fluka | 51198 | |
| Lactic acid | Fluka | 69773 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution) |
| Clove oil | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| Iodine | Fluka | 57665 | |
| Potassium iodide | Merck | 5043 | |
| Malachite Green | Fluka | 63160 | |
| Fuchsin acid | Fluka | 84600 | |
| Orange G | Sigma | 7252 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate | Applichem | A1047,1000 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluorescent brightener 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Aniline blue | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Nutrient-rich substrate | Einheitserde | ED73 | |
| Watch maker's glass | No specific brand | ||
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Syringe | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Preparation needle | BD | BD Microlance 304000 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Humid box | A plastic box with damp paper towel and slide supports inside | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Fixatives | |||
| Carnoy's (Farmer's) fixative | Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml) | ||
| Methanol/acetic acid fixative | 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water | ||
| FPA50 fixative | Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Clearing solutions | |||
| Chloral hydrate/glycerol | Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Herr's 4½ clearing fluid | Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| SDS/NaOH solution | Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution. | ||
| SDS stock solution | 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water. | ||
| NaOH stock solution | 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water | ||
| Combined clearing and staining solutions | |||
| Herr's IKI-4½ | To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis. | ||
| Alexander staining | Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material. | ||
| Staining solutions | |||
| Calcofluor solution | Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution. | ||
| Auramine solution | Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution | ||
| Calcofluor-Auramine mixture | Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine. | ||
| DAPI solution | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm. | ||
| Sodium phosphate buffer (0.1 M) | Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7) | ||
| Aniline blue solution | 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining. |
References
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
- Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
- Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D.
- Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
- Alvarez-Buylla, E. R., et al.
- Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
- Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
- Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
- Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
- Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
- Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M.
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Roeder, A. H., Yanofsky, M. F.
- Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
- Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
- Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
- Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
- Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
- Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
- Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
- Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
- Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
- Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
- Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
- Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
- Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
- Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
- Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
- Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
- Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
- Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
- Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
- Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
- Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
- Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
- Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
- Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).
