Summary
بلعم الفخاخ خارج الخلية كيان وصف حديثا. هذه المادة سوف تركز على أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] وكيف أنها تصور في المختبر و في فيفو من عينات الرئة.
Abstract
وسيلة الرئيسية المستخدمة لتحديد وجود العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات) [كنفوكل] مجهرية. وقد قمنا بتعديل أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] ثابتة لتصور بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس). يتم تعريف هذه الفخاخ خارج الخلية بوجود الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك لمكونات أخرى مثل البروتياز الحبيبية وهيستونيس سيتروليناتيد بيبتيديل أرجيناسي ديميناسي (PAD). التعبير عن ميتس عموما يقاس بعد التعرض لحافز ومقارنة عينات تنشيط الأمم المتحدة. عينات مدرجة أيضا للتحكم بالخلفية وايستب. ويتم تحليل الخلايا باستخدام برمجيات التحليل صورة واضحة المعالم. يمكن استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] لتحديد وجود ميتس على حد سواء في المختبر و في فيفو في أنسجة الرئة.
Introduction
ووصفت الفخاخ خارج الخلية العَدلات (شبكات)، أولاً برينكمان et al. 1 يتم إنتاجها في الغالب استجابة للعدوى (خاصة للبكتيريا) ولها دور هام في الدفاع المضيف1،2. قد وصفت أيضا تحدث استجابة للأمراض غير المعدية، بما في ذلك التهاب الأوعية الدموية والذئبه الحمامية الجهازية (SLE)؛ وإلى mitogen phorbol 12-ميريساتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)2،3. وقد اعترف مؤخرا أن أنواع الخلايا الأخرى قد تنتج أيضا الفخاخ خارج الخلية، بما في ذلك الضامة. بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس) ليست بعد كيان محدد جيدا في الأدب4،5. وقد أنشأنا مؤخرا أساليب الكشف عن وجود ميتس في المختبر و في فيفو6،7. في هذه المقالة، سيتم وصف قياس ميتس استخدام الفحص المجهري [كنفوكل].
السمات الرئيسية نيتوسيس التي تميزها عن سائر المسارات الخلوية (مثل المبرمج8) هي النتوء الكروماتين بالاقتران مع: (1) سيترولينيشن هيستونيس (H3Cit)9، (2) التعبير المشارك من البروتياز الحبيبية10 ، ومشاركة بيبتيديل ارجينين ديميناسي (PAD) 4 (3)11،12. الضامة أيضا أن أعرب عن H3Cit، البروتياز الحبيبية، ومنصة، ويمكن استخدام هذه الميزات لتحديد وجود ميتس.
قد يكون ميتس دوراً بالغ أهمية في الرئة، كما بلعم هو المهيمن الخلية الحالية في الحويصلات الهوائية والخطوط الجوية في الرئة والدور الأولى في توجيه الاستجابة المناعية الخلوية للعدوى/التهاب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما الكثير من الرئة مساحة فارغة (مثلاً، داخل الحويصلات الهوائية)، ميتس، يحتمل أن تكون قادرة على التوسع في المساحة المتوفرة، على النقيض من الأجهزة الصلبة.
الأسلوب الأكثر استخداماً لتحديد وجود شبكات بالفحص المجهري [كنفوكل]. لا توجد حتى الآن طريقة محددة بوضوح لقياس ميتس. هذه التقنية لقياس شبكات تم تكييف لقياس وجود ميتس في هذا البروتوكول. المتطلبات الرئيسية لهذا الأسلوب هي الوصول إلى الفحص المجهري [كنفوكل] وبرامج التصوير المناسبة للتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول يتبع التجارب التي تمت الموافقة عليها في: (1) البشر "أخلاقيات اللجنة من موناش الطبي المركز"، والحيوانات (2) لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة ملبورن.
1-الضامة للفيسيولوجيا الغسل (BAL)
- "باستخدام ال" الحصول على الضامة الرئة في: الإنسان (1) مواضيع بالقصبات 6، و (2) الفئران باستخدام الشفط داخل الرغامى 13 .
ملاحظة: يؤدي الحصول الضامة عموما بعض التنشيط لهذه الخلايا. يتم الحصول على الضامة من المرضى الذين يحتاجون القصبات للتحقيق في مشكلة طبية محتملة وليست جميع المواضيع قد تكون مناسبة لتحليل ميتس (هذا سوف تحتاج إلى تحديد لكل مشروع على حدة).- تأخذ الحل بال وتدور إلى أسفل (ز 500 x لمدة 10 دقائق) للنموذج بيليه ويغسل مرتين مع الثقافة المتوسطة (روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) مع مصل العجل الجنين 5% و 1% ل الجلوتامين) في درجة حرارة الغرفة، وثم تضعف الخلايا في 4 مل من الثقافة ميدي أم-
- إذا لزم الأمر، طلب رسميا العد التفاضلية؛ ومعظم الخلايا (عموما > 80%) سوف تكون الضامة 6.
ملاحظة: هذا سوف عموما أن يؤديها خدمة علم الأنسجة سريرية استخدام مظهر مورفولوجك ل أنواع خلايا مختلفة 6- - تنفيذ خلية سنخية قابلة للحياة الاعتماد على الحل بال باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير-
ملاحظة: الحل بال يتم الحصول عليها من البشر والفئران كما هو مذكور في الخطوة 1، 1- - إضافة 1-4 × 10 5 الضامة إلى لوحات 24-جيدا في كوفيرسليبس في 500 ميليلتر للثقافة المتوسطة كل بئر وإجازة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية؛ وسوف تلتزم الخلايا كوفيرسليبس. بالنسبة للعينات البشرية، إضافة المضادات الحيوية (مثل البنسلين وستربتوميسين، 10 4 U/mL) لمنع التلوث البكتيري.
2. الفلورة التالي/مجهرية من "الضامة بال"
ملاحظة: يتم التقيد بها الخلايا على كوفيرسليبس كما هو مذكور أعلاه.
إزالة متوسط الثقافة- وغسل الخلايا مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إصلاح الخلايا في مثبت بارافورمالدهيد/فوق يودات/يسين (حزب العمال التقدمي) 2% للحد الأدنى 10
- يغسل خلايا بإيجاز في برنامج تلفزيوني، وثم بيرميبيليزي في 0.2% 20 توين في برنامج تلفزيوني عن 20 دقيقة
- كتلة الخلايا مع سيرا دجاج 10% في 5% البقري ألبومين المصل (BSA) المخفف في برنامج تلفزيوني عن 30 دقيقة
- إينكوباتي مع مراقبة الابتدائي وايستب الأجسام المضادة ح 1 في درجة حرارة الغرفة بتركيزات 1: 100 (يتم سرد تفاصيل أكثر تحديداً في الجدول للمواد) على 37 درجة مئوية.
ملاحظة: للعينات BAL، علامة محددة من الضامة عادة غير مطلوب. - بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية، تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، وكذلك احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وجبل مع المتوسطة المستندة إلى DAPI المتصاعدة للتصور استخدام مجهر [كنفوكل] (كما ذكر أعلاه) في الليزر الجسيمات 405، 488، 561 و 647 نانومتر و 40 س، غ 1.0 النفط الهدف.
3. عينات أنسجة الرئة
ملاحظة: في فيفو الدراسات أنسجة الرئة، دراسة العينات بعد التعرض ذات الصلة (مثلاً، كما هو مبين في س ' سوليفان et al. 7)-التعرض الأكثر ملاءمة لهذه التجربة هي الكائنات الدقيقة المعدية، خاصة البكتيريا. سلالات الماوس التي يمكن أن تستخدم لهذا الأسلوب من C57BL/6 أو بالب/ج الفئران، 10-12 أسابيع من العمر، والوزن ز 25-30، وذكر-
- يوثانيزي الفئران، عن طريق حقنه داخل الكيتامين (400 مغ/كغ) وإكسيلازيني (40 مغ/كغ). فتح تجويف الصدر وفضح الرئتين والقلب باستخدام الملقط الجراحي والمقص.
- بث برنامج تلفزيوني الحار باستخدام إبرة عيار 21 في البطين الأيمن لتغسل الدم من هذه السفن لمدة 30 ثانية، ثم ضخ 10 مل من 2% حزب العمال التقدمي مثبت لمدة 30 s (في البطين الأيمن).
- استخدام برنامج تلفزيوني الحارة (42 درجة مئوية) للغسل تجويف الصدر مفتوحة. التنبيب القصبة الهوائية بإبرة عيار 21 وقطعة من أنابيب 0.8 ملم قطع بحجم، وحقن 800 ميليلتر من المعالجون مسبقاً (إلى 42 درجة مئوية)، ذوبان منخفضة نقطة 3% [اغروس] الحل.
- التعادل قبالة القصبة الهوائية مع الحرير مجدول (4.0 جامعة جنوب المحيط الهادئ). ضع مؤشر ترابط حول القصبة الهوائية، أسفل نقطة الإدراج من القنية، وضمان الحصول عليها عن طريق تراكم عقده بسيطة. أن يصلب [اغروس]، إدارة برنامج تلفزيوني المثلج حول الرئتين. إزالة الرئتين والقلب ككتلة من تجويف الصدر باستخدام مقص وتشريح كليلة. إزالة الرئة كل على حدة ومن ثم إصلاحها لهم ح 16 في 2% حزب العمال التقدمي أو الفورمالين في 4 ° C.
- تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى تقطيع الأنسجة. وكانت هذه الأساليب للحصول على أنسجة الرئة هو موضح سابقا 13-
- لتحضير أنسجة الرئة نماذج استخدام الخطوات التالية.
- فيكس الرئة الأنسجة (مستأصل في الخطوة 3، 1) الأنسجة في 10% فورمالين الطبيعية معزولة عن 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. نقل إلى الإيثانول 75% ووضع في معالج أنسجة على دورة ح 12، (2.5 ح في 75% EtOH، ح 3 في EtOH المطلق، ح 3.5 في 3B المذيبات، وعن ح 3 في البارافين).
- Embed في البارافين القياسية لإنشاء ثابت من الفورمالين، وجزءاً لا يتجزأ من البارافين كتل (FFPE) التي يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: في هذه المرحلة، عموما مريحة لقطع المقاطع الرئة للشرائح القياسية. - قطع المقاطع الرئة FFPE في 4-5 ميكرون سمك باستخدام مبضع وجبل على المتهمين، المغلفة الشرائح كما تم وصفه سابقا قبل س ' سوليفان et al. 7
- لتحميل الشرائح ووضع 3 قطرات متوسطة المتصاعدة على 60 مم × 24 مم كوفيرسليبس (الحجم 1.5)، وعكس الشريحة ساترة وطرد المتوسطة الزائدة. مغلقة بأحكام ختم مع طلاء الأظافر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة-
4. إعداد/الفحص المجهري "عينات أنسجة الرئة"
- لإزالة الشمع وترطيب بريتريت عينة أنسجة الرئة FFPE مع مستضد استرجاع الحل.
الشرائح فب
- الفرن الجاف لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية. ثم وضع الشرائح في الحل زيلين نفط 30 دقيقة ونقل إلى الحل الإيثانول 70% لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الشطف بماء الصنبور.
- مكان في غلاف بلاستيكي مقاوم للحرارة، ورهنا باسترجاع مستضد هير في طنجرة الضغط لمدة 10 دقائق في 10 m/mol/L تريس، 1 ملمول/يدتا pH 9.0. باردة ل 20 دقيقة أغسل مرتين في مياه الحنفية لمدة 5 دقائق في الروك، ثم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في الروك.
- كتلة مع المصل الدجاج 10% في 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- وصمة عار في الأنسجة.
- لتحديد ميتس في الضامة، إضافة الأجسام المضادة الأولية (MMP-9 و H3Cit و F4/80) في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني عن ح 16 عند 4 درجة مئوية في تمييع 1/100 (يتم سرد تفاصيل محددة عن كميات الضد في الجدول للمواد). أغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الروك. أضداد
- تحقيق كشف فلوري بالحضانة مع الثانوية المقابلة في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الأضداد:: (1) الدجاج المضادة الماوس 488 (الأخضر) والماعز (2) الدجاج لمكافحة 594 (أحمر) والماوس المضادة (3) حمار 647 (الأحمر الآن)-
- يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني وجبل مع تصاعد المحتوية على DAPI المتوسطة لتلطيخ الكروماتين.
- الحصول على الصور الفلورية باستخدام ليزر [كنفوكل] المسح رئيس تعلق مجهر مقلوب.
- تثير الإعداد مع 405، 488، 561، و 647 نانومتر الليزر. التقاط صور بكسل-512 × 512 طائرة واحدة بالنقر فوق خط تسلسلي، والاستواء زر (في المتوسط سطر 2) استخدام 20 X 0.1 الهواء NA و NA 40 × 1.0 النفط الأهداف.
- الحصول على مالا يقل عن عشرة حقول لعرض كل قسم للتحليل والبيانات لكل نتيجة (أي، 10 عالية الطاقة الحقول لعرض (هفوف) لعنصر التحكم، 10 لحفز عينة، إلخ، لكل الماوس)-
ملاحظة: للحصول على عينة تمثيلية من الميدان كله، نظام مصفوفة يمكن استخدامها في الحقل الذي يتم تقسيم إلى أقسام مختلفة و لكل عينة مختلفة تستخدم نفس مصفوفة لتحديد الحقول من طريقة العرض (مثلاً، يمكن تقسيم الحقل إلى 9 أقسام، وتتخذ من المركز وزوايا 4، هفوف اثنين)-
5. التصوير ميتس ثلاثية الأبعاد (3-D)
ملاحظة: كما ميتس هياكل ثلاثية الأبعاد، بأخذ z-المكدس متعددة الصور، والتي يتم تشكيلها، قد تعطي معلومات قيمة-
- المقطع العينات الرئة من كتل البارافين، في 200 ميكرومتر استخدام فيبرتوم في سعة تعيين 1.8 ملم والسرعة من 0.1-0.5 ملم/س.
- كتلة أنسجة الرئة مع 20 ٪ مصل كل منهما (10% مصل العجل الجنين والمصل الدجاج 10 ٪)، وثم بيرميبيليزي في تكملة برنامج تلفزيوني و 3.75% 100 تريتون العاشر ح 7 في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات لطيف.
- وصمة عار المقاطع ح 16 عند 4 درجة مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة (MMP-9 و H3Cit و F4/80) في مجلدات ميليلتر 200 في أنابيب ميكروسينتريفوجي (جسم التركيزات المذكورة في الجدول للمواد)-
- أغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني، 3 مرات لمدة 10 دقيقة قبل تفرخ مع الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة في درجة حرارة الغرفة حاء – 1
- وصمة عار أقسام الرئة ل DAPI (1:5، 000) في الحل لمدة 20 دقيقة، قبل إضافة كشوف غطاء للمجهر الشرائح في برنامج تلفزيوني.
- الحصول على الصور الفلورية استخدام مجهر [كنفوكل] مقلوب ال (40 × 1.3 غ) مجهزة 405 نانومتر، 440 نانومتر، 473 نانومتر، 543 نانومتر، و 635 نانومتر الليزر.
- سجل ثلاثية الأبعاد z-رزمة من 0.54 ميكرون سمك مع تقطيع ض الأمثل لهدف النفط غ 40 × 1.3.
ملاحظة: تتنوع البرمجيات المستخدمة تبعاً للمجهر الفردية. مثال عن كيف يمكن استخدام البرنامج مجهر واحد يرد في التكميلية الملف 1-
6. صورة التحليل
ملاحظة: تحليل العينات يتطلب استخدام برمجيات تحليل التصوير محددة وأمثلة مذكورة في الجدول للمواد. في حين يعتمد على برنامج معين يستخدم تحليل النتائج، النقاط المدرجة أدناه هامة-
- عينات "التحليل بال"
- تعريف عدد الضامة باختيار قناة الأزرق ل DAPI وتعيين حجم الحد أدنى للخلايا (مثلاً، > 18 ميكرومتر في القطر). باستخدام البرمجيات ذات الصلة، وقياس مجموع الضامة كل حقل-
- حساب عدد الخلايا التي تحتوي على ميزات يلتقي بوجود خارج الخلية الكروماتين الكشف عنها بواسطة DAPI مع التعبير المشترك عن علامات أخرى (مثلاً، MMP12، PAD2 و H3Cit)-
ملاحظة: يعتمد عدد العلامات التي يمكن تحليلها على العدد من أجهزة الليزر المتوفرة، ولكن من الناحية المثالية بالإضافة إلى DAPI، اثنين على الأقل من علامات أخرى ينبغي إدراجها. أخرى أقل معلمات محددة للتعبير MET (مثلاً، عدد الخلايا التي تحتوي على الكروماتين خارج الخلية، ونواة موسع) يمكن استخدامها- - لمقارنة التعبير MET في بال تحليل عينات (بين التحكم والدخان، والدخان/الدناز معاملة مجموعات)، الحد ني الضامة ال 100 كل عينة.
- لقياس الأجسام المضادة الثانوية وايستب التحكم في مستويات الأسفار؛ وقياس الحد ني خلايا 100 في كل عينة لهذه الأسفار. قياس مستوى متوسط من الأسفار الخلفية لكل علامة (مثلاً، H3Cit) باستخدام البرامج القياسية.
- إلى تعريف تعبير MET، عد الخلايا مع النمط الظاهري نموذجي (مثلاً، الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك H3Cit و MMP9) وكل MET، لقياس مستوى الأسفار علامات (مثلاً، H3Cit و MMP9). استبعاد الخلايا المنتجة ميتس إذا لم يكن على تلطيخ فوق عنصر التحكم في الخلفية وايستب.
- تحليل للعينات بال البشرية، كحد أدنى من 100 خلية لكل عينة للنسبة مئوية الضامة التي تجعل ميتس. للحصول على نماذج مورين، تحليل الخلايا أصغر وصعوبة تحديد ميتس، عدد أكبر من الخلايا لكل عينة (مثلاً، الضامة 200)-
- تحليل عينات أنسجة الرئة
- لتحديد وجود ميتس في أنسجة الرئة، استخدم علامة بلعم محددة مثل F4/80-
- تحديد وجود ميتس في أنسجة الرئة باستخدام التعريب المشارك F4/80 في الخلايا التي تعبر عن الكروماتين خارج الخلية مع معلمات أخرى كما هو موضح في القسم 6.1.
- تحديد مستويات الخلفية الفلورية في عينات مع الأجسام المضادة الثانوية وعناصر التحكم ايستب. استبعاد ميتس من التحليل أن لا تتجاوز الخلفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تصور ميتس من عينات BAL، في أنسجة الرئة وفي أقسام الرئة أكثر سمكا مع صور ثلاثية الأبعاد. ويرد مثال ميتس تصور في عينة بال في الشكل 1. مورفولوجية ميتس ستختلف وفقا لمرحلة النضج. أول ميزة يمكن كشفها في الفحص المجهري هو حركة نواة إلى الحافة من الخلية. ويعقب هذا الكروماتين خارج الخلية مع الوسطاء أعرب المشترك الأخرى، مثل البروتياز H3Cit والحبيبة. الخلية في المراحل السابقة، لا يزال لديه شكل كروي تقريبا مع فخ خارج الخلية وأعرب عن. في مراحل لاحقة، وتشكيل MET تتميز باستطالة جسم الخلية.
أنسجة الرئة ميتس مبينة في الشكل 2. كما يتم نفخ الرئتين بالسوائل لتعريف بنية الرئة، سيتم دفع ميتس عموما ضد الجدران السنخية. كما ستختلف مورفولوجية ميتس استناداً إلى أي قطع الطائرة الأنسجة في. المقاطع القياسية المستخدمة لعينات أنسجة الرئة هي 4-5 ميكرومتر في السمك. تمكين أكثر ثخانة الأنسجة أقسام صور متعددة اتخاذها وميتس يمكن ثم عرض ثلاثي الأبعاد. فقط سوف تخترق الأجسام المضادة حتى الآن في أنسجة الرئة وسمك المادة 25-50 ميكرون الأمثل. مثال لصورة ثلاثية الأبعاد ويرد في الشكل 3 ، وفي الفيديو 1.
رقم 1: ميتس BAL- ميتس بال البشرية تشكلت بعد التحفيز في مراحل مختلفة من التنمية. تميزت ميتس الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك H3Cit و MMP9. تلوين الكروماتين (أ) H3Cit (ب)، MMP9 (ج) و (د) الصورة المدمجة. يتم إدراج لوحة ايستب عناصر التحكم. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون (15 ميكرون ايستب). مرحلة سابقة MET يظهر في الركن الأيمن العلوي، وقد شكل كروي تقريبا. ويرد MET أكثر نضجاً في وسط الميدان. أخذت الصور باستخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل] وهدف نفط غ 40 × 1.0. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أنسجة الرئة ميتس. مورين ميتس في أنسجة الرئة بعد التحفيز. لقد اتسمت ميتس الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك H3Cit و MMP9 F4/80 (كعلامة بلعم). تظهر لوحة (أ) عرض من حقل نموذجي عالية الطاقة المستخدمة لقياس عدد ميتس؛ تظهر لوحات (ب–و) منطقة مربع منقط تحت تكبير أعلى. تلوين الكروماتين (ب) H3Cit (ج)، MMP9 (د)، (ه) F4/80 و (F) الصورة المدمجة. يتم إدراج لوحة التحكم ايستب. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر (20 ميكرومتر ايستب). عموما يتم الضغط ميتس ضد الجدران السنخية. أخذت الصور باستخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل] وهدف نفط غ 40 × 1.3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: عرض ثلاثي الأبعاد من قسم الرئة. أنسجة الرئة الماوس ثابتة ويقتطع 25-35 ميكرون سميكة المقاطع. كان يحمل علامات ميتس الأنسجة وتصويرها مع الأقسام في 1 ميكرون سمك. الصور كانت جنبا إلى جنب مع z كدسة لخلق صورة ثلاثية الأبعاد 3-تابعين. أخذت الصور باستخدام ليزر المسح مجهر [كنفوكل] وهدف نفط غ 40 × 1.3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1: عرض ثلاثي الأبعاد من قسم الرئة. فيديو يناظر العينات المعروضة في الشكل 3. محور القراد = 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند الأسلوب الموصوفة في هذا الاستعراض على أن تستخدم لتحديد وجود شبكات14. الضامة تعتبر إلى حد بعيد نوع الخلية المهيمنة في عينات بال وهذا الأسلوب من جمع خاصة مناسبة لدراسة ميتس. إذا كانت خلايا الدم الحمراء موجودة في ال، ينبغي تفكيك هذه الخلايا باستخدام كلوريد الأمونيوم. سيتم تنشيط الإجراء BAL عموما الضامة و ولذلك فمن المتوقع أنه سيكون هناك ميتس موجودة في العينات تنشيط الأمم المتحدة. الضامة BAL عادة ملتصقة جداً. عموما لا الضامة BAL ستحتاج إلى علامة معينة كما هذه الخلايا هي نوع الخلية المهيمنة ويمكن تمييزها بالتشكل بهم أيضا. عادة في البال، أكبر من 80% الخلايا الضامة (والعدلات هي أقل من 5%)، وبعد يغسل متعددة، عموما يبقى فقط الكريات البيضاء ملتصقة (أي، الضامة)6. إذا كان هناك شك حول القدرة على تمييز الضامة من العَدلات في البشر، يمكن استخدام علامة العَدلات مثل elastase العَدلات. في أنسجة الرئة، مطلوب علامة بلعم محددة (مثلاً، F4/80) كما الضامة ويصعب التمييز بين أنواع الخلايا الأخرى. الضامة قد السيارات-الأسفار حتى المهم باستخدام عناصر تحكم خلفية وايستب؛ وهذا هو الحال بصفة خاصة مع عينات حفز.
ما زال يتعين تحديد أفضل طريقة لتحديد وجود ميتس. مسارات محددة/العمليات، التي مشتركة بين كل من العَدلات والضامة: البروتياز (1) الحبيبية، (2) سيترولينيشن هيستونيس، ولوحة (3). PAD4 أكثر تحديداً العَدلات، بينما PAD2 أكثر بروزا في حيدات/الضامة. استخدام F4/80 علامة مقبولة تماما الضامة مورين، لكن الضامة البشرية لا تملك مثل هذه علامات محددة تحديداً جيدا وقد يشكل ذلك القضايا عند تقييم أنسجة الرئة البشرية للتعبير MET. تحليل التعبير MET في أنسجة الرئة قد يكون من الأصعب أن هناك العديد من أنواع الخلايا الأخرى وميتس تميل إلى أن تكون دفعت على الجدران السنخية. عند تحليل المقاطع الأنسجة، ميتس هي تصور أفضل عندما تكون شقة في المقطع العرضي؛ إذا ميتس في طائرة مختلفة قد يكون من الصعب تحديد ما إذا كان MET موجود. ويمكن معالجة هذه المسألة إلى حد ما بجعل z-مداخن لتمكين أعمق أنسجة طائرات (ثلاثي الأبعاد) لدراسة ميتس، والقدرة على تصور ميتس في جوانب مختلفة.
لا توجد طريقة مقبولة جيدا لتحديد وجود ميتس في عينات الرئة. الأساليب المذكورة تستند إلى تلك المستخدمة لتصور الشباك. تشو وآخرون ووصف أن mitogen سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها ميتس في خط خلية بلعم، حسب تقييم وجود الكروماتين خارج الخلية15. أظهرت دراسة لاحقة أن بكتريا السل التي يسببها ميتس في المختبر، حسب تعريف وجود الكروماتين خارج الخلية و H3Cit16. أننا أظهرنا في فيفو في نموذج لالتهاب الكلية، أن ميتس موجودة في الكلي كما حددتها الكروماتين وهيستون myeloperoxidase مترجمة شارك7. وأخيراً، قد أثبتنا وجود ميتس في المختبر في بلعم الرئة البشرية بالمزيج من الكروماتين خارج الخلية و MMP126. يمكن استخدام أسلوب لدينا محققون آخرون لبحث هذا الجانب الهام من الاستجابة الالتهابية.
ومن المرجح أن يتم التعرف ميتس يكون لها دور رئيسي في مرض التهاب مزمن. العمليات التي تؤدي إلى نيتسيس لا تزال غير واضحة المعالم. دراسة ميتس قد تقدم أفكاراً هامة في آليات تشكيل فخ. وضع بروتوكولات مع علامات أكثر والدراسات الفنية من ميتس بمواصلة تحديد دور ميتس في المرض.
وهناك الخطوات الحاسمة التي حددناها في هذا البروتوكول. العينات بال البشرية عرضه للتلوث الجرثومي الثانوي واستخدام المضادات الحيوية في الثقافة المتوسطة مهم للحد من التلوث. يمكن أن تختلف الأجسام المضادة الابتدائي والثانوي في هذه الأسفار، حتى مع نفس الشركة المصنعة. وأخيراً، تحليل عينات أنسجة الرئة أكثر تعقيداً من عينات BAL ويتطلب وقتاً لوضع نهج موحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا الكشف جعل فيما يتصل بهذا العمل.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جامعة موناش والصحة الوطنية، ومجلس البحوث الطبية، والرئة موناش ومعهد النوم. الكتاب أود أن أشكر موظفي "المناعة السريرية" في الصحة موناش، جودي كالاهان وأليكس فوشيه، كيرستين الجاس وكامدن لو من موناش الصغرى التصوير (MMI) للحصول على تعليمات مع المجهرية [كنفوكل] التصوير، وتقر الكتاب المرافق MMI جامعة موناش. يعترف الكتاب المرافق، وتقديم المساعدة العلمية والتقنية من "منهاج علم الأنسجة موناش".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
![تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/56459.jpg)
