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Immunology and Infection

visualizing Macrophage Extracellular जाल का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी

Published: October 19, 2017 doi: 10.3791/56459
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 1,2, 1,2
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University

Summary

Macrophage extracellular जाल एक नए वर्णित इकाई हैं । इस अनुच्छेद के फोकल माइक्रोस्कोपी तरीकों पर ध्यान केंद्रित है और कैसे वे विट्रो में और फेफड़े के नमूनों से vivo में कल्पना कर रहे हैं ।

Abstract

न्युट्रोफिल extracellular जाल (नेट) की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया एक प्राथमिक विधि फोकल माइक्रोस्कोपी है । हम macrophage extracellular जाल (मेट्स) कल्पना करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी तरीकों की स्थापना संशोधित किया है । इन extracellular जाल के साथ extracellular क्रोमेटिन की उपस्थिति से परिभाषित कर रहे हैं-इस तरह के granules के रूप में अन्य घटकों की अभिव्यक्ति, lgg histones, और peptidyl arginase deiminase (पैड). मेट्स की अभिव्यक्ति आम तौर पर एक उत्तेजना के लिए जोखिम के बाद मापा जाता है और संयुक्त राष्ट्र की तुलना में प्रेरित नमूनों । नमूने भी पृष्ठभूमि और isotype नियंत्रण के लिए शामिल किए गए हैं । कोशिकाओं अच्छी तरह से परिभाषित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । फोकल माइक्रोस्कोपी दोनों विट्रो में और फेफड़े के ऊतकों में vivo में मेट्स की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल), पहले Brinkmann एट अल द्वारा वर्णित किया गया । 1 वे मुख्य रूप से संक्रमण के जवाब में उत्पादित कर रहे हैं (विशेष रूप से बैक्टीरिया के लिए) और मेजबान रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका है1,2. वे भी वाहिकाशोथ और प्रणालीगत एक प्रकार वृक्ष (SLE) सहित गैर संक्रामक रोग, के जवाब में होने के लिए वर्णित किया गया है; तथा mitogen phorbol १२-myrisate १३-एसीटेट (पमा)२,३। यह हाल ही में मांयता प्राप्त किया गया है कि अंय प्रकार के सेल भी extracellular जाल, मैक्रोफेज सहित उत्पादन कर सकते हैं । Macrophage extracellular जाल (मेट्स) अभी तक साहित्य4,5में एक अच्छी तरह से परिभाषित इकाई नहीं हैं । हम हाल ही में स्थापित तरीकों मेट्स दोनों विट्रो में और vivo में6,7की उपस्थिति का पता लगाने के लिए । इस लेख में, फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मेट्स का माप बताया जाएगा ।

NETosis की मुख्य विशेषताएं जो इसे अन्य सेलुलर रास्ते से अलग (जैसे apoptosis8) के साथ संयोजन के रूप में क्रोमेटिन के बाहर निकालना हैं: (1) citrullination of histones (H3Cit)9, (2) सह-अभिव्यक्ति का granules का टीज़र10 , और (3) peptidyl arginine deiminase (पैड) की भागीदारी 411,12। मैक्रोफेज भी H3Cit, granules, और पैड एक्सप्रेस, और इन सुविधाओं मेट्स की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

मेट्स फेफड़ों में एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती है, के रूप में macrophage alveoli और फेफड़े के एयरवेज में प्रमुख कोशिका मौजूद है और संक्रमण के लिए सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया निर्देशन में प्रारंभिक भूमिका है/ इसके अलावा, जबकि फेफड़ों के ज्यादा खाली जगह है (जैसे, alveoli के भीतर), मेट्स संभावित रूप से उपलब्ध अंतरिक्ष में विस्तार कर रहे हैं, ठोस अंगों के विपरीत ।

सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि जाल की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए फोकल माइक्रोस्कोप से है । मेट्स को मापने का अभी तक कोई स्पष्ट रूप से परिभाषित तरीका नहीं है । जाल की माप के लिए तकनीक इस प्रोटोकॉल में मेट्स की उपस्थिति को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है । इस विधि के लिए मुख्य आवश्यकताओं के विश्लेषण के लिए फोकल माइक्रोस्कोपी और उचित इमेजिंग सॉफ्टवेयर के लिए उपयोग कर रहे हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > इस प्रोटोकॉल में स्वीकृत प्रयोगों का अनुसरण करता है: (१) मोनाश चिकित्सा केन्द्र की आचार समिति द्वारा मनुष्य, और (२) पशु-मेलबोर्न विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा.

< p class = "jove_title" > 1. Bronchoalveolar लेवेज (bal) मैक्रोफेज

  1. फीमेल bal में लंग मैक्रोफेज को प्राप्त करने के लिए: (1) ब्रोंकोस्कोपी < सुप वर्ग द्वारा मानव विषयों = "xref" > 6 , और (2) चूहों का उपयोग करके इंट्रा-सांस आकांक्षा < सुप class = "xref" > 13
    नोट: मैक्रोफेज के अधिग्रहण आम तौर पर इन कोशिकाओं के कुछ सक्रियण कारण बनता है । मैक्रोफेज रोगियों जो एक ब्रोंकोस्कोपी एक संभावित चिकित्सा समस्या की जांच करने के लिए और नहीं सभी विषयों मेट्स के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो सकता है की आवश्यकता से प्राप्त कर रहे है (यह प्रत्येक व्यक्ति परियोजना के लिए निर्धारित की आवश्यकता होगी) ।
    1. बाल समाधान ले और नीचे स्पिन (10 मिनट के लिए ५०० एक्स जी) के लिए एक गोली फार्म, कमरे के तापमान पर संस्कृति मध्यम (रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट मीडियम (RPMI) के साथ 5% भ्रूण बछड़ा सीरम और 1% L-glutamine) के साथ दो बार धो लें, और फिर संस्कृति पॉईंट के 4 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पतला उम.
    2. यदि आवश्यक हो, तो औपचारिक अवकलन गणना का अनुरोध करें; अधिकांश कक्ष (सामान्यत: & #62; ८०%) मैक्रोफेज < सुप वर्ग = "xref" > 6 .
      नोट: यह आमतौर पर एक नैदानिक प्रोटोकॉल सेवा द्वारा विभिंन कोशिकाओं के प्रकार के सुघड़ प्रकटन का उपयोग किया जाएगा < सुप वर्ग = "xref" > ६ .
    3. बाल Trypan नीले अपवर्जन और एक hemocytometer.
      का उपयोग कर समाधान पर एक व्यवहार्य macrophage सेल गिनती प्रदर्शन नोट: चरण १.१ में उल्लिखित बाल समाधान मनुष्यों और चूहों से प्राप्त किया जाता है ।
    4. Add 1-4 x 10 5 मैक्रोफेज पर 24-well प्लेट्स coverslips में ५०० & #181; प्रति कल्चर मीडियम का कुआं और रात भर छोड़ कर ३७ & #176; ग; कोशिकाएं coverslips का पालन करेंगी । मानव नमूनों के लिए, जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं ( जैसे , पेनिसिलिन और streptomycin, 10 4 यू/
< p class = "jove_title" > 2. बाल मैक्रोफेज के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग/

< p class = "jove_content" > नोट: कोशिकाओं का पालन coverslips पर किया जाता है जैसा कि ऊपर बताया गया है ।

  1. संस्कृति माध्यम को हटाने और फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने । 10 min.
    2. के लिए 2% paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) निर्धारण में कक्षों को ठीक करें
  2. धो सेल संक्षेप में पंजाब में, और फिर permeabilize में ०.२% 20 के बीच 20 min.
    3. के लिए पंजाब 30 min. के लिए पंजाब में पतला 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) में 10% चिकन सीरा के साथ
  3. ब्लॉक सेल
  4. के लिए प्राथमिक और isotype नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ मशीन 1:100 सांद्रता पर कमरे के तापमान पर 1 ज (अधिक विशिष्ट विवरण सामग्री के तालिका में सूचीबद्ध हैं) पर ३७ & #176; ग.
    नोट: बाल नमूनों के लिए, मैक्रोफेज के एक विशिष्ट मार्कर आमतौर पर आवश्यक नहीं है ।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी के अलावा
  5. के बाद, पंजाब में कोशिकाओं को धोने, और कमरे के तापमान पर ४० मिनट के लिए इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ आगे की मशीन ।
  6. पंजाब में वर्गों धोने और DAPI के साथ माउंट-दृश्य के लिए मध्यम बढ़ते आधारित एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग (जैसा कि ऊपर उल्लेख किया) लेजर उत्तेजितताओं में ४०५, ४८८, ५६१ और ६४७ एनएम और एक 40X, १.० ना तेल उद्देश्य ।
< p class = "jove_title" > 3. फेफड़ों के ऊतकों के नमूने

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: के लिए vivo अध्ययनों में फेफड़ों के ऊतकों, प्रासंगिक जोखिम के बाद नमूनों का अध्ययन ( जैसे , O & #39 द्वारा वर्णित; सुलिवान एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > ७ ). इस प्रयोग के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक है कि जोखिम संक्रामक सूक्ष्मजीवों, विशेष रूप से बैक्टीरिया हैं । इस विधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि माउस उपभेदों C57BL/6 या बालब/सी चूहों, 10-12 सप्ताह पुराना है, वजन 25-30 जी, और पुरुष ।

  1. Euthanize चूहों, ketamine के एक intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से (४०० मिलीग्राम/किग्रा) और xylazine (४० मिलीग्राम/ वक्ष गुहा खोलें और शल्य संदंश और कैंची का उपयोग फेफड़ों और दिल बेनकाब ।
    1. एक 21 गेज सुई सही निलय में 30 एस के लिए जहाजों से खून धोने के लिए का उपयोग कर गर्म पंजाबियों को भ्रमित है, तो 30 एस के लिए 2% PLP निर्धारण के 10 मिलीलीटर (सही निलय में).
    2. का उपयोग गर्म पंजाबियों (४२ & #176; C) को लेवेज के लिए खुला छाती गुहा । Intubate एक 21 गेज सुई के साथ श्वासनली और आकार करने के लिए ०.८ mm टयूबिंग कट का एक टुकड़ा, और इंजेक्षन ८०० & #181; L पूर्व की उष्ण (to ४२ & #176; C), कम पिघलने बिंदु 3% agarose समाधान.
      3. लट रेशम (४.० खासियत) के साथ श्वासनली से
    3. टाई । श्वासनली के चारों ओर धागा प्लेस, बस प्रवेशनी के संमिलन बिंदु के नीचे है, और यह एक साधारण हाथ गांठ के द्वारा सुरक्षित । agarose को जमना, फेफड़ों के आसपास बर्फ ठंडे पंजाबियों प्रशासन । दोनों कैंची और कुंद विच्छेदन का उपयोग वक्ष गुहा से एक ब्लॉक के रूप में फेफड़ों और दिल निकालें । प्रत्येक फेफड़ों को व्यक्तिगत रूप से निकालें और फिर उन्हें 16 ज में 2% के लिए ठीक करें PLP या formalin पर 4 & #176; C.
    4. 4 पर पंजाब में नमूनों की दुकान & #176; सी जब तक ऊतक खोदी । फेफड़ों के ऊतकों को प्राप्त करने के लिए इन तरीकों को पहले वर्णित किया गया है < सुप class = "xref" > 13 .
  2. फेफड़ों के ऊतकों के नमूने तैयार करने के लिए निम्न चरणों का उपयोग करें ।
    1. ठीक फेफड़े के ऊतकों (चरण ३.१ में प्रतिप्रदाय) ऊतक 10% प्राकृतिक में 24 घंटे के लिए formalin बफर कमरे के तापमान पर । ७५% इथेनॉल के लिए स्थानांतरण और एक ऊतक प्रोसेसर में एक 12 एच चक्र पर डाल दिया, (२.५ ७५% ेतोः में एच, निरपेक्ष ेतोः में 3 ज, विलायक बी में ३.५ एच, और 3 एच के लिए आयल में).
    2. मानक तेल में एंबेड formalin-फिक्स्ड बनाने के लिए, तेल-एंबेडेड (FFPE) ब्लॉक जो कमरे के तापमान पर जमा हो जाती है ।
      नोट: इस स्तर पर, यह आम तौर पर मानक स्लाइड के लिए फेफड़ों के वर्गों को काटने के लिए सुविधाजनक है ।
    3. 4-5 & #181 पर FFPE फेफड़ों के वर्गों में कटौती; एम की मोटाई का उपयोग कर एक microtome और माउंट पर आरोप लगाया, लेपित स्लाइड के रूप में पहले से वर्णित हे & #39; सुलिवान एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > ७
    4. स्लाइड माउंट करने के लिए, बढ़ते मध्यम के 3 बूंदें ६० मिमी x 24 मिमी coverslips (आकार १.५) पर डाल, coverslip पर स्लाइड पलटना और अधिक माध्यम बाहर धक्का. कमरे के तापमान पर नेल पॉलिश और स्टोर के साथ भली सील ।
< p class = "jove_title" > 4. फेफड़े के ऊतकों के नमूनों की तैयारी/

  1. de-मोम, reहाइड्रेट और FFPE फेफड़ों के ऊतक नमूने के साथ प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान के लिए इलाज ।
    1. ओवन शुष्क FFPE स्लाइड ६० मिनट में ६० & #176; सी. तो 30 मिनट और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल समाधान के लिए स्थानांतरण के लिए xylene समाधान में स्लाइड रखो । नल का पानी में कुल्ला.
      2. हीट प्रूफ प्लास्टिक लपेटो में
    2. प्लेस और 10 मिनट के लिए एक दबाव कुकर में HIER-प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए विषय/मॉल/L Tris, 1 mmol/EDTA पीएच ९.० । 20 मिनट के लिए ठंडा एक झूली कुरसी पर 5 मिनट के लिए नल का पानी में दो बार धोने, तो एक बार झूली कुरसी पर पंजाबियों के साथ ।
      3. 5% BSA/ में 10% चिकन सीरम के साथ
    3. ब्लॉक कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ऊतक
  2. दाग ।
    1. को मैक्रोफेज में मेट्स परिभाषित करने के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी (एमएमपी-9, H3Cit और F4/80) में 1% BSA/पंजाब के लिए 16 ज पर 4 & #176; C पर 1/100 कमजोर पड़ने (एंटीबॉडी मात्रा के बारे में विशिष्ट विवरण सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं) । एक झूली कुरसी पर 5 मिनट के लिए पंजाबियों के साथ दो बार धो लो ।
    2. कमरे के तापमान पर ४० मिनट के लिए 1% BSA में इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन द्वारा फ्लोरोसेंट जांच को प्राप्त करने/ एंटीबॉडी हैं: (1) चिकन विरोधी माउस ४८८ (हरा), (2) चिकन विरोधी बकरी ५९४ (लाल), और (3) गधा विरोधी माउस ६४७ (अब तक लाल).
    3. पंजाब में वर्गों धोने और क्रोमेटिन धुंधला के लिए DAPI युक्त बढ़ते माध्यम के साथ माउंट ।
  3. एक व्युत्क्रम माइक्रोस्कोप के साथ संलग्न सिर स्कैनिंग एक फोकल लेजर का उपयोग कर फ्लोरोसेंट छवियों को प्राप्त ।
    1. ४०५, ४८८, ५६१, और ६४७ एनएम पराबैंगनीकिरण के साथ तैयारी उत्तेजित । कैप्चर एकल विमान ५१२ x ५१२-पिक्सेल छवियां लाइन पर क्लिक करके-अनुक्रमिक, बटन लेवलिंग (2 औसत लाइन) का प्रयोग 20X & #160; ०.१ ना हवा आणि 40X & #160; १.० ना तेल उद्देश.
    2. विश्लेषण और प्रत्येक परिणाम के लिए डेटा ( यानी , 10 उच्च शक्ति (HFOV) नियंत्रण के लिए, 10 उत्तेजित नमूना के लिए, आदि , प्रत्येक माउस के लिए) के लिए खंड के प्रति अनुभाग देखने के कम से दस क्षेत्रों प्राप्त करें ।
      नोट: पूरे क्षेत्र का एक प्रतिनिधि नमूना प्राप्त करने के लिए, एक मैट्रिक्स प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है जिसमें क्षेत्र में विभाजित है विभिन्न वर्गों और प्रत्येक अलग नमूना के लिए एक ही मैट्रिक्स दृश्य के क्षेत्रों का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ( जैसे , क्षेत्र 9 वर्गों में विभाजित किया जा सकता है, और केंद्र और 4 कोनों से, दो HFOV लिया जाता है).
< p class = "jove_title" > 5. तीन आयामी (3-डी) मेट्स की इमेजिंग

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: जैसा कि मेट्स 3-डी संरचनाएं हैं, एकाधिक z-स्टैक छवियां, जो पुनर्गठन की गई हैं, बहुमूल्य जानकारी दे सकती हैं ।

  1. धारा आयल ब्लाकों से फेफड़े के नमूनों में २०० & #181; m १.८ mm और 0.1-0.5 mm/s.
    2. की गति पर सेट एक आयाम पर एक vibratome का उपयोग
  2. ब्लॉक संबंधित सीरम के 20% के साथ फेफड़े के ऊतकों (10% भ्रूण बछड़ा सीरम और 10% चिकन सीरम) और फिर पंजाब में permeabilize पूरक और ३.७५% ट्राइटन-X १०० के लिए 7 ज कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर.
  3. दाग वर्गों के लिए 16 ज पर 4 & #176; C के साथ प्रासंगिक प्राथमिक एंटीबॉडी (एमएमपी-9, H3Cit, और F4/२०० में & #181; L मात्रा microcentrifuge ट्यूबों में (एंटीबॉडी सांद्रता तालिका में सूचीबद्ध हैं सामग्री ).
  4. 1 ज.
    5. के लिए कमरे के तापमान पर प्रासंगिक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीनिंग से पहले 10 मिनट के लिए पंजाब, 3 बार में वर्गों धो
  5. 20 मिनट के लिए समाधान में DAPI (1:5000) के लिए फेफड़ों के वर्गों दाग, कवर जोड़ने से पहले पंजाब में माइक्रोस्कोप स्लाइड को पर्ची ।
  6. एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त (40x १.३ NA) ४०५ एनएम, ४४० एनएम, ४७३ एनएम, ५४३ एनएम, और ६३५ एनएम पराबैंगनीकिरण से लैस ।
  7. रर 3-डी जेड के टैक् स ०.५४ & #181; 40x १.३ न तेल उद्देश्य के लिए इष्टतम z-के साथ मीटर मोटाई ।
    नोट: इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर व्यक्तिगत माइक्रोस्कोप के आधार पर भिन्न हो जाएगा. कैसे सॉफ्टवेयर एक खुर्दबीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का एक उदाहरण अनुपूरक फ़ाइल 1 .
    8. में प्रदान की जाती है
< p class = "jove_title" > 6. छवि विश्लेषण

< p class = "jove_content" > नोट: नमूनों के विश्लेषण के लिए विशिष्ट इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर के उपयोग की आवश्यकता है और उदाहरण सामग्री के तालिका में सूचीबद्ध हैं. जबकि परिणामों के विश्लेषण का इस्तेमाल किया विशिष्ट कार्यक्रम पर निर्भर करेगा, नीचे सूचीबद्ध अंक महत्वपूर्ण हैं ।

बाल नमूनों का
  1. विश्लेषण
    1. मैक्रोफेज के लिए नीले चैनल का चयन करके DAPI की संख्या निर्धारित करना और कक्षों के लिए न्यूनतम आकार असाइन करना ( उदा. , & #62; 18 & #181; m व्यास में). प्रासंगिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रति फ़ील्ड मैक्रोफेज की कुल संख्या को मापने.
    2. अंय मार्करों के सह-अभिव्यक्ति के साथ DAPI द्वारा पता लगाया extracellular क्रोमेटिन की उपस्थिति से एक मुलाकात की सुविधाओं है कि कोशिकाओं की संख्या गिनती ( जैसे , MMP12, PAD2, और H3Cit).
      नोट: मार्करों की संख्या है कि विश्लेषण किया जा सकता उपलब्ध पराबैंगनीकिरण की संख्या पर निर्भर करता है, लेकिन आदर्श रूप में DAPI के अलावा, दो से कम अन्य मार्करों शामिल किया जाना चाहिए. मिले अभिव्यक्ति के लिए अंय कम विशिष्ट मापदंडों ( जैसे , extracellular क्रोमेटिन और एक बढ़े हुए नाभिक के साथ कोशिकाओं की संख्या) का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    3. बाल नमूनों में मिले अभिव्यक्ति की तुलना (नियंत्रण, धुआं, और धुआं/DNase उपचार समूहों के बीच), प्रति नमूना १०० बाल मैक्रोफेज की एक ंयूनतम विश्लेषण ।
      4. प्रतिदीप्ति के द्वितीयक एंटीबॉडी और isotype नियंत्रण स्तरों को मापने के लिए
    4. ; प्रत्येक नमूने में उनके प्रतिदीप्ति के लिए ंयूनतम १०० कक्षों को मापने । मानक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक मार्कर ( जैसे , H3Cit) के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के औसत स्तर को मापने.
    5. से मुलाकात की अभिव्यक्ति को परिभाषित करने के लिए, ठेठ phenotype ( जैसे , extracellular और क्रोमेटिन की सह-अभिव्यक्ति के साथ) के साथ कोशिकाओं की गणना और प्रत्येक मुलाकात के लिए, मार्करों के H3Cit के स्तर को मापने (MMP9 जैसे प्रतिदीप्ति, और ) । मेट्स उत्पादन कोशिकाओं को बाहर अगर उनके धुंधला पृष्ठभूमि और isotype नियंत्रण के ऊपर नहीं था ।
      6. मानव बाल नमूनों के लिए
    6. , मेट्स बनाने मैक्रोफेज के प्रतिशत के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एक ंयूनतम १०० कोशिकाओं का विश्लेषण । murine नमूनों के लिए, के रूप में कोशिकाओं को छोटे हैं और मेट्स को परिभाषित करने के लिए कठिन हैं, प्रत्येक नमूने के लिए कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण ( उदा , २०० मैक्रोफेज).
  2. फेफड़ों के ऊतकों के नमूनों का विश्लेषण
    1. फेफड़ों के ऊतकों में मेट्स की उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए, ऐसे F4/macrophage के रूप में विशिष्ट
      2. मार्कर का उपयोग
    2. में मेट्स की उपस्थिति निर्धारित करें F4/80 का सह-स्थानीयकरण का उपयोग करके extracellular क्रोमेटिन एक्सप्रेस के रूप में अनुभाग ६.१ में सूचीबद्ध अंय पैरामीटर्स के साथ कक्ष ।
    3. माध्यमिक एंटीबॉडी और isotype नियंत्रण के साथ नमूनों में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के स्तर का निर्धारण । पृष्ठभूमि से ऊपर नहीं है जो विश्लेषण से मेट्स छोड़ें ।

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Representative Results

मेट्स बाल नमूनों से, फेफड़े के ऊतकों में और 3-डी छवियों के साथ मोटा फेफड़ों वर्गों में कल्पना की जा सकती है । एक बाल नमूने में मेट्स visualized का एक उदाहरण चित्रा 1में दिखाया गया है । मेट्स की आकृति विज्ञान परिपक्वता के अपने चरण के अनुसार भिन्न हो जाएगा. माइक्रोस्कोपी पर पहली जासूसी सुविधा सेल के किनारे करने के लिए नाभिक के आंदोलन है । यह अन्य सह के साथ extracellular क्रोमेटिन द्वारा पीछा किया जाता है, ऐसे H3Cit और granules के रूप में मध्यस्थों व्यक्त की है । पहले के चरणों में, सेल अभी भी व्यक्त extracellular जाल के साथ एक मोटे तौर पर गोलाकार आकार की है । बाद के चरणों में, मुलाकात गठन कोशिका के शरीर के बढ़ाव की विशेषता है ।

फेफड़ों के ऊतक मेट्स चित्रा 2में दिखाए जाते हैं । फेफड़ों की वास्तुकला को परिभाषित करने के लिए तरल पदार्थ के साथ फुलाया जाता है के रूप में, मेट्स आम तौर पर वायुकोशीय दीवारों के खिलाफ धक्का दिया जाएगा । मेट्स की आकृति विज्ञान भी जो विमान ऊतक में कटौती की गई थी के आधार पर भिंन होगा । मानक फेफड़ों ऊतक नमूनों के लिए इस्तेमाल किया वर्गों मोटाई में 4-5 µm हैं । मोटा ऊतक वर्गों कई छवियों को ले जाने के लिए सक्षम है और मेट्स तो 3 डी में देखा जा सकता है । एंटीबॉडी केवल फेफड़ों के ऊतकों और 25-50 µm की एक धारा मोटाई में अब तक घुसना होगा इष्टतम है । 3-डी छवि का एक उदाहरण चित्रा 3 और वीडियो 1में दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्र १: बाळ मेट्स. मानव बाल विकास के विभिंन चरणों में उत्तेजना के बाद गठित मेट्स । मेट्स H3Cit और MMP9 की सह-अभिव्यक्ति के साथ extracellular क्रोमेटिन द्वारा विशेषता थे । (A) क्रोमेटिन, (B) H3Cit, (C) MMP9, और (D) मर्ज की गई छवि के लिए धुंधला करना । पेनल न्या isotype नियंत्रण होते हैं । स्केल बार्स = 10 µm (isotype के लिए 15 µm) । एक पहले से मुलाकात की अवस्था में शीर्ष दाएं कोने में दिखाया गया है और एक मोटे तौर पर गोलाकार आकार है । एक और परिपक्व मुलाकात क्षेत्र के बीच में दिखाया गया है । छवियां एक लेजर फोकल माइक्रोस्कोप और एक 40x १.० न तेल उद्देश्य स्कैनिंग का उपयोग कर लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: फेफड़ों के ऊतकों मेट्स. Murine उत्तेजना के बाद फेफड़ों के ऊतकों में मेट्स । मेट्स H3Cit, MMP9, और F4/80 के सह-अभिव्यक्ति के साथ extracellular क्रोमेटिन द्वारा विशेषता किया गया है (एक macrophage मार्कर के रूप में) । पैनल (ए) मेट्स की संख्या को मापने के लिए इस्तेमाल किया दृश्य के एक ठेठ उच्च शक्ति क्षेत्र से पता चलता है; पैनलों (B-F) उच्च आवर्धन के अंतर्गत डैश्ड वर्ग क्षेत्र दिखाएं । (B) क्रोमेटिन, (C) H3Cit, (D) MMP9, (E) F4/80, और (F) मर्ज की गई छवि के लिए धुंधला करना । पैनल संमिलित करें isotype नियंत्रण है । स्केल बार्स = 20 µm (isotype के लिए 20 µm) । मेट्स आम तौर पर वायुकोशीय दीवारों के खिलाफ धकेल रहे हैं । छवियां एक लेजर फोकल माइक्रोस्कोप और एक 40x १.३ न तेल उद्देश्य स्कैनिंग का उपयोग कर लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: फेफड़े अनुभाग का तीन-आयामी दृश्य. माउस फेफड़े के ऊतकों तय किया गया था और 25-35 µm मोटी वर्गों में कटौती । ऊतक मेट्स के लिए मार्कर के साथ लेबल और 1 µm मोटाई में वर्गों के साथ imaged था । छवियां एक जेड के साथ संयुक्त थे एक मुलाकात के 3 आयामी चित्र बनाने के ढेर । छवियां एक लेजर फोकल माइक्रोस्कोप और एक 40x १.३ न तेल उद्देश्य स्कैनिंग का उपयोग कर लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video 1
वीडियो 1: फेफड़े अनुभाग के तीन आयामी दृश्य. वीडियो चित्रा 3में प्रस्तुत नमूनों से मेल खाती है । अक्ष ticks = 5 µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

विधि इस समीक्षा में वर्णित है कि14जाल की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल पर आधारित है । मैक्रोफेज बाल नमूनों में अब तक प्रमुख कोशिका प्रकार से कर रहे हैं और संग्रह की इस विधि मेट्स अध्ययन के लिए विशेष रूप से अनुकूल है. यदि बाल में लाल रक्त कोशिकाएँ विद्यमान हों तो इन कोशिकाओं को अमोनियम क्लोराइड का उपयोग करके लीजड जाना चाहिए. बाल प्रक्रिया आम तौर पर मैक्रोफेज को सक्रिय करने और इसलिए यह है कि वहां संयुक्त राष्ट्र में मौजूद मेट्स होगा प्रेरित नमूनों की उंमीद है । बाल मैक्रोफेज आमतौर पर बहुत अनुयाई हैं । बाल मैक्रोफेज आम तौर पर एक विशिष्ट मार्कर की जरूरत नहीं के रूप में इन कोशिकाओं को प्रभावी सेल प्रकार के होते है और भी उनकी आकृति विज्ञान द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है । आमतौर पर एक बाल में, कोशिकाओं के ८०% से अधिक मैक्रोफेज है (और न्यूट्रोफिल से कम 5%), और कई धोने के बाद, आम तौर पर केवल अनुयाई ल्यूकोसाइट्स (यानी, मैक्रोफेज) रह6। अगर मनुष्यों में न्यूट्रोफिल से मैक्रोफेज भेद करने की क्षमता के बारे में संदेह है, तो न्युट्रोफिल elastase जैसे एक न्युट्रोफिल मार्कर का इस्तेमाल किया जा सकता है । फेफड़ों के ऊतकों में, एक विशिष्ट macrophage मार्कर (उदा, F4/80) के रूप में आवश्यक है मैक्रोफेज अंय प्रकार के कक्ष से अंतर करना मुश्किल है । मैक्रोफेज ऑटो प्रतिदीप्ति है तो पृष्ठभूमि और isotype नियंत्रण का उपयोग महत्वपूर्ण है; यह विशेष रूप से उत्तेजित नमूनों के साथ मामला है ।

मेट्स की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए सबसे अच्छा तरीका निर्धारित किया जाना रहता है । विशिष्ट मार्ग/प्रक्रियाएँ, जो दोनों न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज के लिए सामान्य हैं: (१) दानेदार को छेड़ने की, (२) citrullination की histones, और (३) पैड. PAD4 न्यूट्रोफिल के लिए अधिक विशिष्ट है, whilst PAD2 monocytes/मैक्रोफेज में अधिक प्रमुख है । F4/80 का उपयोग murine मैक्रोफेज के लिए एक अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है मार्कर है, लेकिन मानव मैक्रोफेज ऐसे अच्छी तरह से परिभाषित मार्करों नहीं है और यह मुद्दों जब मानव फेफड़े के ऊतकों के लिए मुलाकात की अभिव्यक्ति का आकलन कर सकते हैं । फेफड़ों के ऊतकों में मुलाकात की अभिव्यक्ति का विश्लेषण और अधिक मुश्किल हो सकता है के रूप में वहाँ कई अन्य प्रकार के कोशिकाएं हैं और मेट्स वायुकोशीय दीवारों पर धकेल दिया जा करने के लिए करते हैं । ऊतक वर्गों का विश्लेषण करते समय, मेट्स सबसे अच्छा visualized कर रहे हैं जब वे पार अनुभाग में फ्लैट हैं; यदि मेट्स एक अलग विमान में है यह निर्धारित करने के लिए अगर एक मुलाकात मौजूद है मुश्किल हो सकता है । इस समस्या को मेट्स की जांच के लिए गहरे ऊतक (3-डी) विमानों को सक्षम करने के लिए और विभिंन पहलुओं में मेट्स कल्पना करने की क्षमता को जेड-स्टैक बनाकर कुछ हद तक संबोधित किया जा सकता है ।

वहां फेफड़ों के नमूनों में मेट्स की उपस्थिति को परिभाषित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है विधि नहीं है । वर्णित विधियों के जाल visualizing के लिए इस्तेमाल किया उन पर आधारित हैं । चाउ एट अल । वर्णन किया गया है कि mitogen पमा प्रेरित मेट्स एक macrophage सेल लाइन में, के रूप में extracellular क्रोमेटिन की उपस्थिति द्वारा मूल्यांकन15। एक बाद के अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि माइकोबैक्टीरियम तपेदिक प्रेरित मेट्स इन विट्रो, के रूप में extracellular क्रोमेटिन और H3Cit16की उपस्थिति द्वारा परिभाषित । हम स्तवकवृक्कशोथ के एक मॉडल में vivo में दिखाया गया है, कि मेट्स गुर्दे में मौजूद हैं के रूप में सह स्थानीयकृत क्रोमेटिन, citrullinated, और myeloperoxidase7द्वारा परिभाषित. अंत में, हम extracellular क्रोमेटिन और MMP126के संयोजन के द्वारा मानव फेफड़ों macrophage में इन विट्रो में मेट्स की उपस्थिति का प्रदर्शन किया है । हमारे विधि अंय जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है भड़काऊ प्रतिक्रिया के इस महत्वपूर्ण पहलू अनुसंधान ।

यह संभावना है कि मेट्स पुरानी सूजन की बीमारी में एक प्रमुख भूमिका है पहचाना जाएगा । प्रक्रियाओं है कि NETosis के लिए नेतृत्व अभी भी अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे हैं । मेट्स के अध्ययन जाल गठन के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । अधिक मार्करों और मेट्स के कार्यात्मक अध्ययन के साथ प्रोटोकॉल के विकास और रोग में मेट्स की भूमिका को परिभाषित करेगा ।

वहां महत्वपूर्ण कदम है कि हम इस प्रोटोकॉल में पहचान की है । मानव बाल नमूनों को माध्यमिक जीवाणु संदूषण की संभावना है और संस्कृति माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग के संक्रमण को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी उनके प्रतिदीप्ति में भिंन हो सकते हैं, यहां तक कि एक ही निर्माता के साथ । अंत में, फेफड़ों के ऊतकों के नमूनों के विश्लेषण बाल नमूनों की तुलना में अधिक जटिल है और एक मानकीकृत दृष्टिकोण विकसित करने के लिए समय की आवश्यकता है ।

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Disclosures

लेखकों ने इस काम के संबंध में बनाने के लिए कोई खुलासे नहीं किए हैं.

Acknowledgments

इस काम मोनाश विश्वविद्यालय, राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, और मोनाश फेफड़े और सो संस्थान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखक मोनाश स्वास्थ्य, लगा हुआ Callaghan, एलेक्स Fulcher, Kirstin Elgass, और Camden माइक्रो इमेजिंग (मोनाश) के इम्यूनोलॉजी पर क्लिनिकल के कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ मदद के लिए, और लेखक MMI सुविधाएं स्वीकार मोनाश विश्वविद्यालय के. लेखकों की सुविधाओं को स्वीकार करते हैं, और मोनाश प्रोटोकॉल मंच के वैज्ञानिक और तकनीकी सहायता ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12 Novus Biological NB110-57214 1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9 Novus Biological AB119906 1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2 Abcam AB16478 7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE LifeSpan Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Name Company Catalog Number Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9 Abcam AF909 10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80 In-house (hybridoma) In house 20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE Sapphire Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Super-frost plus slides Menzel S41104A
Dapi-prolong gold Molecular probes P36931
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 85111
Ammonium chloride Sigma-Aldrich E9434
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/ Life technologies A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594 Life technologies A-21442
Chicken anti-goat AF 594 Life technologies a-21468
Chicken anti-mouse AF488 Life technologies A-21200
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11018
Chicken anti-mouse AF 647 Life technologies A-21463
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11016
Isotype control
Rabbit IgG In house
Rabbit IgG In house
Mouse IgG1 BD Bioscience 550878
Rabbit IgG In house
Mouse IgG2a BioLegend 400201
Sheep IgG In house
Name Company Catalog Number Comments
Software Programs
Imaris Bitplane
Image J NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name Company Catalog Number Comments
Media
RPMI Sigma-Aldrich r8758
Fetal calf serum Sigma-Aldrich F0926
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
Sudan black Sigma-Aldrich 199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative Sigma-Aldrich 27387
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Natural formalin Sigma-Aldrich 42904
Paraffin Sigma-Aldrich 327204
Agarose Sigma-Aldrich A2576
Solvent 3B Hi-Chem 2026
Coverslips 12 ml Sigma-Aldrich S1815
Coverslips 60 x 24 ml Sigma-Aldrich C6875
Name Company Catalog Number Comments
Mice
c57 black 6 Monash animal research platform (MARP)
BALB/c MARP

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १२८ Macrophage extracellular जाल फोकल माइक्रोस्कोपी फेफड़े मानव murine
visualizing Macrophage Extracellular जाल का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी
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Sharma, R., O'Sullivan, K. M.,… More

Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56459, doi:10.3791/56459 (2017).

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