Summary
Macrophage ekstracellulære feller er en nylig beskrevet enhet. Denne artikkelen vil konsentrere seg om AC confocal mikroskopi metoder og hvordan de er visualisert i vitro og vivo fra lunge prøver.
Abstract
En primære metoden brukes til å definere tilstedeværelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (nett) er AC confocal mikroskopi. Vi har endret etablerte AC confocal mikroskopi metoder for å visualisere macrophage ekstracellulære feller (METs). Disse ekstracellulære feller er definert ved tilstedeværelse av ekstracellulære chromatin med co uttrykk for andre komponenter som granule proteaser, citrullinated histones og peptidyl arginase deiminase (PAD). Uttrykk for METs er vanligvis målt etter eksponering for en stimulans og forhold til FN stimulert prøver. Eksempler er også inkludert for bakgrunnen og isotype. Celler analyseres ved hjelp av veldefinerte analyseprogramvare. AC confocal mikroskopi kan brukes til å definere tilstedeværelsen av METs både i vitro og vivo i lungevev.
Introduction
Nøytrofile ekstracellulære feller (nett), ble først beskrevet av Brinkmann et al. 1 de er hovedsakelig produsert i respons på infeksjon (spesielt til bakterier) og har en viktig rolle i vert forsvar1,2. De har også blitt beskrevet i svar på ikke-smittsomme sykdommer, inkludert vaskulitt og systemisk lupus erythematosus (SLE); og den mitogen phorbol 12-myrisate 13-acetate (PMA)2,3. Det har nylig blitt anerkjent at andre celletyper kan produsere ekstracellulære feller, inkludert makrofager. Macrophage ekstracellulære feller (METs) er ennå ikke en veldefinert enhet i litteratur4,5. Vi har nylig etablert metoder for å oppdage tilstedeværelsen av METs både i vitro og vivo6,7. I denne artikkelen beskrives måling av METs bruker AC confocal mikroskopi.
Nøkkel vise egenskaper av NETosis som skiller den fra andre cellulære veier (for eksempel apoptose8) er byggesystemer i chromatin i forbindelse med: (1) citrullination histones (H3Cit)9, (2) co uttrykk for granule proteaser10 , og (3) involvering av peptidyl arginine deiminase (PAD) 411,12. Makrofager uttrykker også H3Cit og granule proteaser PAD, og disse funksjonene kan brukes til å definere tilstedeværelsen av METs.
METs kan ha en spesielt viktig rolle i lungene, som macrophage er dominerende cellen i alveoler og luftveiene i lungene og har innledende rolle i regissere mobilnettet immunforsvaret til infeksjon/betennelse. Dessuten, mens mye av lungene er tom plass (f.eksi alveoler), er METs potensielt kunne utvide til plass, i motsetning til solide organer.
Den mest brukte metoden til å definere tilstedeværelsen av garn er AC confocal mikroskopi. Det er ikke ennå en klart definert måte å måle METs. Teknikk for måling av garn er tilpasset å måle tilstedeværelsen av METs i denne protokollen. Det hovedavdeling behov for denne metoden er tilgang til AC confocal mikroskopi og riktig programvare for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
denne protokollen følger eksperimenter godkjent: (1) mennesker etisk komité av Monash Medical Center og (2) dyr av den etiske komiteen av University of Melbourne.
1. Bronchoalveolar Lavage (BAL) makrofager
- Bruk BAL å få lungekreft makrofager i: (1) menneskets fag ved bronkoskopi 6, og (2) mus ved hjelp av intra-tracheal aspirasjon 13 .
Merk: Oppkjøp av makrofager vanligvis fører noen aktivering av disse cellene. Makrofager er innhentet fra pasienter som krever en bronchoscopy å undersøke et medisinsk problem, og ikke alle fag kan være passende for analyse av METs (dette må fastslås for hvert prosjekt).- Ta BAL løsningen og rotere ned (500 x g i 10 min) til skjemaet pellets, vaske to ganger med kultur medium (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) med 5% fosterets kalv serum og 1% L-glutamin) i romtemperatur, og deretter fortynne celler i 4 mL kultur medi UM.
- Om nødvendig, be om en formell differensial teller, de fleste av cellene (vanligvis > 80%) blir makrofager 6.
Merk: Dette vil vanligvis bli utført av en klinisk histology tjeneste med morfologiske utseende av andre celler typer 6. - Utføre en levedyktig macrophage celle stole på BAL løsningen bruker Trypan blå eksklusjon og en hemocytometer.
Merk: BAL løsning er Hentet fra mennesker og mus som nevnt i trinn 1.1. - Legg til 1-4 x 10 5 makrofager til 24-vel plater på coverslips i 500 µL av kultur medium per godt og la overnatting på 37 ° C; cellene vil følge coverslips. For menneskelige prøver, legge antibiotika (f.eks, penicillin og streptomycin, 10 4 U/mL) å hindre bakteriell forurensning.
2. Immunofluorescence merking/mikroskopi av BAL makrofager
Merk: celler følges på coverslips som nevnt ovenfor.
- Fjerne kultur medium og vask cellene gang med fosfat bufret saltvann (PBS). Fastsette celler i 2% paraformaldehyde/periodate/lysin (PLP) bindemiddel for 10 min.
- Vask celler kort i PBS, og deretter permeabilize i 0,2% mellom 20 i PBS i 20 min.
- Blokk celler med 10% kylling sera i 5% bovin serum albumin (BSA) fortynnet i PBS for 30 min.
- Incubate med primær og isotype antistoffer 1t ved romtemperatur ved 1: 100 konsentrasjoner (mer spesifikk informasjon er oppført i Tabellen for materiale) på 37 ° C.
Merk: For BAL utvalgene, en spesifikk markør for makrofager kreves vanligvis ikke. - Etter tillegg av primære antistoffer, vaske cellene i PBS, og ytterligere ruge med tilsvarende sekundære antistoffer for 40 min ved romtemperatur.
- Vask avsnittene i PBS og montere med DAPI-baserte montering medium for visualisering bruke AC confocal mikroskop (som nevnt ovenfor) laser excitations 405, 488, 561 og 647 nm og en 40 X, 1.0 NA olje målet.
3. Lunge vevsprøver
Merk: For i vivo studier av lungevev, studerer du eksemplene etter relevante eksponering (f.eks som beskrevet av O ' Sullivan et al. 7). eksponering som er mest relevant for dette eksperimentet er smittsomme mikroorganismer, spesielt bakterier. Musen stammer som kan brukes for denne metoden er C57BL/6 eller BALB/c mus, 10-12 ukens gamle, vekt 25-30 g og hann.
- Euthanize mus, via en intraperitoneal injeksjon av ketamin (400 mg/kg) og xylazine (40 mg/kg). Åpne bryst hulrom og utsette lungene og hjertet med kirurgisk tang og saks.
- Sette mot varme PBS bruker en 21-gauge nål i høyre ventrikkel bleke blodet fra skipene i 30 s, deretter sette mot 10 mL av 2% PLP bindemiddel for 30 s (i høyre ventrikkel).
- Bruke varm PBS (42 ° C) til lavage åpne brystet hulrom. Intubate luftrøret med en 21-gauge nål og en 0,8 mm rør snitt til størrelse, og injisere 800 µL av forvarmes (til 42 ° C), lav-smeltende punkt 3% agarose løsning.
- Tie av luftrøret med flettet silke (4.0 USP). Tråden rundt luftrøret, like nedenfor innsettingspunktet på kanyle, og sikre det via en enkel halvstikk knot. Administrere iskald PBS rundt lungene for å stivne i agarose. Fjern lungene og hjertet som en blokk fra bryst hulrom hjelp saks og sløv disseksjon. Fjerne hver lunge individuelt og deretter ordne dem 16 h i 2% PLP eller formell på 4 ° C.
- Lagrer de i PBS på 4 ° C til vev snitting. Disse metodene for å få lungevev har vært beskrevet tidligere 13.
- For å forberede lungevev prøver Bruk fremgangsmåten nedenfor.
- Fastsette lunge vev (resected i trinn 3.1) vev i 10% naturlig-bufret formalin 24 h ved romtemperatur. Overføre til 75% etanol og satt i en vevsprosessor på en 12 h syklus, (2,5 t i 75% EtOH, 3 h i absolutt EtOH, 3,5 h løsemiddel 3B og 3 h i parafin).
- Embed i standard parafinen lage formalin-fast, parafin-embedded (FFPE)-blokker som lagres ved romtemperatur.
Merk: På dette stadiet, er det generelt praktisk å kutte delene lunge for standard lysbilder. - Kutte delene FFPE lunge på 4-5 µm tykkelse ved hjelp av en mikrotom og montere på ladet, belagt lysbilder som tidligere beskrevet av O ' Sullivan et al. 7
- å montere lysbilder, sette 3 dråper montering medium på 60 x 24 mm coverslips (Str. 1,5), invertere lysbildet på dekkglassvæske og presse ut overflødig medium. Hermetisk tetning med neglelakk og lagre ved romtemperatur.
4. Forberedelse/mikroskopi av lunge
- de voks, rehydrate og pretreat FFPE lunge vev prøven med antigen henting løsning.
- Ovn tørr på FFPE lysbilder for 60 min på 60 ° C. Deretter satt lysbilder i xylen løsning for 30 min og overføre til 70% etanol løsning 5 min ved romtemperatur. Skyll i springvann.
- Sted i varme-proof plast brytes med HIER-antigen henting i en trykkoker for 10 min i 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. Kult for 20 min. vask to ganger i vann fra springen i 5 min på en rocker, så en gang med PBS på rocker.
- Blokk med 10% kylling serum på 5% BSA/PBS i 30 min ved romtemperatur.
- Stain vevet.
- å definere METs i makrofager, legger til primære antistoffer (MMP-9, H3Cit og F4/80) i 1% BSA/PBS 16 h på 4 ° C på 1/100 fortynning (spesifikke detaljer om antistoff beløpene er oppført i Tabellen for materiale). Vask to ganger med PBS i 5 min på en rocker.
- Oppnå fluorescerende oppdagelsen av inkubasjon med tilsvarende sekundær antistoffer i 1% BSA/PBS for 40 min ved romtemperatur. Antistoffer er: (1) kylling anti-mus 488 (grønn), (2) kylling anti-geit 594 (rød) og (3) esel anti-musen 647 (langt rød).
- Vask avsnittene i PBS og montere med DAPI inneholder montering medium til chromatin farging.
- Få fluorescerende bilder ved hjelp av en AC confocal laserskanning hode festet til en invertert mikroskop.
- Excite utarbeidelse med 405, 488, 561 og 647 nm lasere. Ta enkelt flyet 512 x 512 bildepunkter bilder ved å klikke på linje-sekvensiell, utjevning knappen (2 linje snitt) med 20 X 0,1 NA luft og 40 X 1,0 NA olje mål.
- Få minst ti synsfelt per inndeling for analyse og data for hvert resultat (dvs. 10 høyeffekts synsfelt (HFOV) for kontrollen, 10 for stimulert utvalg, etc., for hver mus).
Merk: For å få et representativt utvalg av hele feltet,-en matrix-systemet, kan brukes i som feltet er delt inn i seksjoner og hver annen prøve samme matrisen brukes til å velge synsfelt (f.eks feltet kan deles inn i 9 deler og fra sentrum og de 4 hjørnene, to HFOV er tatt).
5. Tredimensjonale (3D) Imaging av METs
Merk: som METs er 3-D strukturer, ved å ta flere z stabel bilder, som er rekonstruert, kan gi verdifull informasjon.
- Delen lunge prøver fra parafin blokker på 200 µm ved hjelp av en vibratome på en amplituden satt til 1,8 mm og hastighet på 0,1-0,5 mm/s.
- Blokkere lungevev med 20% av respektive serum (10% fosterets kalv serum og 10% kylling serum) og deretter permeabilize i PBS supplert og 3,75% Triton-X 100 7 h ved romtemperatur under mild agitasjon.
- Stain avsnittene for 16 timer på 4 ° C med relevante primære antistoffer (MMP-9, H3Cit og F4/80) i 200 µL volumer i microcentrifuge rør (antistoff konsentrasjoner er oppført i Tabellen over materialer).
- Vask avsnittene i PBS, 3 ganger i 10 min før rugende med relevante sekundære antistoffer ved romtemperatur for 1 h.
- Stain delene lunge for DAPI (1:5, 000) i løsning for 20 min, før legge cover papirlapper til mikroskopet lysbilder i PBS.
- Få fluorescens bilder ved hjelp av en invertert AC confocal mikroskop (40 x 1.3 NA) utstyrt med 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm og 635 nm lasere.
- Registrere 3D z-stabler av 0.54 µm tykkelse beste z-snittestillingen for 40 x 1.3 NA olje målsettingen.
Merk: Programvaren som brukes, varierer etter personlige mikroskopet. Et eksempel på hvordan programvaren kan brukes for en mikroskopet leveres i supplerende fil 1.
6. Bildeanalyse
Merk: analyse av prøver krever bruk av bestemte bildebehandlingsprogramvare analyse og eksempler er oppført i Tabellen for materiale. Mens analyse av resultatene avhenger av spesifikke programmet som ble brukt, oppført punktene nedenfor er viktige.
- Analyse av BAL prøver
- definere antall makrofager ved å velge den blå kanalen for DAPI og tilordne en minimum størrelse for cellene (f.eks > 18 µm i diameter). Bruke relevant programvare, måle antall makrofager per felt.
- Teller antall celler som har funksjoner i en MET av tilstedeværelsen av ekstracellulære chromatin oppdaget av DAPI med co uttrykk for andre indikatorer (f.eks, MMP12, PAD2 og H3Cit).
Merk: Antall indikatorer som kan analyseres er avhengig av antall lasere tilgjengelig, men ideelt i tillegg til DAPI, minst to andre markører burde være inkludert. Andre mindre spesifikk parameterene for MET uttrykk (f.eks, antall celler med ekstracellulære chromatin og en forstørret kjernen) kan brukes. - Sammenligne MET uttrykket i BAL prøver (mellom kontroll, røyk og røyk/DNase behandlet grupper), analysere minimum 100 BAL makrofager per prøve.
- å måle sekundære antistoff og isotype kontrollere nivåer av fluorescens; måle minimum 100 celler i hver prøve til deres fluorescens. Måle gjennomsnittlige nivået av bakgrunnen fluorescens for hver indikator (f.eks H3Cit) standard programmvre.
- Til å definere MET uttrykk, telle celler med typiske fenotypen (f.eks, ekstracellulære chromatin med co uttrykk for H3Cit og MMP9) og for hver MET, måle nivået av fluorescens for (eksempel, H3Cit og MMP9). Utelater celler produserer METs hvis deres flekker ikke var over bakgrunnen og isotype.
- For menneskelig BAL prøver, analysere minimum 100 celler for hvert utvalg for andelen makrofager som gjør METs. For murine prøver, som cellene er mindre og METs er vanskeligere å definere, analysere et større antall celler for hvert utvalg (f.eks, 200 makrofager).
- Analyse av lunge
- for å fastslå tilstedeværelsen av METs i lungevev, bruke bestemte macrophage markøren som F4/80.
- Definerer tilstedeværelsen av METs i lungevev ved hjelp av den co lokaliseringen av F4/80 i celler som uttrykker ekstracellulære chromatin med andre parametere som er oppført i delen 6.1.
- Bestemmer nivåer av bakgrunnen fluorescens i prøver med sekundær antistoff og isotype kontrollene. Utelate METs fra analyse som ikke er over bakgrunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
METs kan visualiseres fra BAL prøver, i lungevev og tykkere lunge seksjoner med 3D-bilder. Et eksempel på METs visualisert i en BAL prøve er vist i figur 1. Morfologi av METs vil variere deres scenen for modning. Funksjonen for første synlig på mikroskopi er flytting av kjernen til kanten av cellen. Dette etterfølges av ekstracellulære chromatin med andre co uttrykt meglere, som H3Cit og granule proteaser. I de tidligere stadiene har cellen fortsatt en omtrent sfærisk form med ekstracellulære fellen uttrykt. Ved senere stadier, er MET dannelsen preget av forlengelse av kroppen av cellen.
Lungevev METs er vist i figur 2. Som lungene er fylt med væske til å definere lunge arkitektur, vil METs vanligvis bli skjøvet mot alveolar veggene. Morfologi av METs varierer også avhengig av hvilket fly vevet ble kuttet i. Standard delene som brukes for lunge vevsprøver er 4-5 µm tykkelse. Tykkere vev deler aktiverer flere bilder tas og METs deretter kan vises i 3D. Antistoffer vil bare trenge så langt inn i lungevev og en snittykkelse på 25-50 µm er optimal. Et eksempel på et 3D-bilde vises i Figur 3 og Video 1.
Figur 1: BAL METs. Menneskelige BAL METs dannet etter stimulering på ulike stadier av utviklingen. METs var preget av ekstracellulære chromatin med co uttrykk for H3Cit og MMP9. Farging for (A) chromatin, (B) H3Cit, (C) MMP9 og (D) det sammenslåtte bildet. Panelet setter er isotype kontroller. Skalere barer = 10 µm (15 µm for isotype). Et tidligere stadium MET vises i øvre høyre hjørne, og har en omtrent sfærisk form. En mer moden MET vises i feltet. Bildene ble tatt med en laserskanning AC confocal mikroskop og en 40 x 1,0 NA oljeobjektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: lungevev METs. Murine METs i lungevev etter stimulering. METs har vært preget av ekstracellulære chromatin med co uttrykk for H3Cit, MMP9 og F4/80 (som en macrophage markør). Panelet (A) viser en typisk høyeffekts synsfelt brukes til å måle antall METs; Paneler (B-F) viser stiplede kvadrat området under høyere forstørrelse. Flekker (B) chromatin, (C) H3Cit, (D) MMP9, (E) F4/80, og (F) det sammenslåtte bildet. Sett inn panel er kontrollen isotype. Skalere barer = 20 µm (20 µm for isotype). METs generelt skyves mot alveolar veggene. Bildene ble tatt med en laserskanning AC confocal mikroskop og en 40 x 1.3 NA oljeobjektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: tredimensjonal visning av lunge delen. Musen lungevev var fast og skjær i 25-35 µm tykke snitt. Vev var merket med indikatorer for METs og fotografert med deler på 1 µm tykkelse. Bildene ble kombinert med en z-stabel for å opprette en 3-dimensjonal bilde av en MET. Bildene ble tatt med en laserskanning AC confocal mikroskop og en 40 x 1.3 NA oljeobjektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: tredimensjonal visning av lunge delen. Video tilsvarer eksemplene som vises i Figur 3. Aksen flått = 5 µm. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet i denne anmeldelsen er basert på som brukes til å definere tilstedeværelsen av garn14. Makrofager er langt den dominerende celle typen i BAL prøver denne metoden av samlingen er spesielt egnet for å studere METs. Hvis røde blod celler finnes i BAL, skal disse cellene bli lysed ved hjelp av salmiakk. BAL prosedyren vil vanligvis aktivere makrofager og derfor er det forventet at det vil være METs i un stimulert prøver. BAL makrofager er vanligvis svært tilhenger. BAL makrofager generelt trenger ikke et bestemt merke disse cellene er den dominerende cellen og kan også være preget av deres morfologi. Vanligvis i en BAL, større enn 80% av cellene er makrofager (og nøytrofile er mindre enn 5%), og etter flere vasker, vanligvis forblir bare de tilhenger leukocytter (dvs., makrofager)6. Hvis det er tvil om muligheten for å skille makrofager fra nøytrofile hos mennesker, kan merketråd nøytrofile som nøytrofile elastase brukes. I lungevev kreves en bestemt macrophage markør (f.eksF4/80) som makrofager er vanskelig å skille fra andre celletyper. Makrofager har auto-fluorescens så bruk av bakgrunnen og isotype er viktig. Dette er spesielt tilfelle med stimulert prøver.
Den beste måten å definere tilstedeværelsen av METs gjenstår for å fastsettes. Bestemte stier/prosesser, som er felles for både nøytrofile og makrofager er: (1) detaljert proteaser, (2) citrullination histones, og (3) PAD. PAD4 er mer spesifikke for nøytrofile, mens PAD2 er mer fremtredende i monocytter/makrofager. Bruk av F4/80 er en godt akseptert for murine makrofager, men menneskelig makrofager har ikke slike veldefinerte markører og dette kan utgjøre problemer når vurdere menneskelige lungevev MET uttrykk. Kan være vanskeligere å analysere MET uttrykk i lungevev som det er mange andre celletyper og METs skyves til alveolar veggene. Når du analyserer vev deler, er METs best visualisere når de er i tverrsnitt; Hvis METs er i et annet fly kan det være vanskelig å avgjøre om en MET finnes. Dette problemet kan rettes til dels ved z-stabler aktivere dypere vev (3D) fly for å undersøke METs og potensial til å visualisere METs i ulike aspekter.
Det er ikke en godt akseptert metode for å definere tilstedeværelsen av METs i lunge prøver. Metodene beskrevet er basert på de som brukes for å visualisere garn. Chow et al. beskrevet at mitogen PMA indusert METs i en macrophage cellen linje, som vurdert av tilstedeværelsen av ekstracellulære chromatin15. En senere studie vist at Mycobacterium tuberculosis indusert METs i vitro, som definert av ekstracellulære chromatin og H3Cit16. Vi har vist i vivo i en modell av glomerulonefritt, at METs finnes i nyrene som definert av samlokalisert chromatin og histone myeloperoxidase7. Endelig har vi vist tilstedeværelsen av METs i vitro i menneskelig lunge macrophage av kombinasjonen av ekstracellulære chromatin og MMP126. Vår metode kan brukes av andre etterforskere forskning denne viktig fasett av inflammatorisk respons.
Det er sannsynlig at METs gjenkjennes å ha en stor rolle i kronisk inflammatorisk sykdom. Prosessene som fører til NETosis er fortsatt ikke godt definert. Studiet av METs kan gi betydelig innsikt i mekanismer for felle formasjon. Utviklingen av protokoller med flere indikatorer og funksjonelle studier av METs ytterligere definerer rollen METs sykdom.
Det er avgjørende skritt som vi har identifisert i denne protokollen. Menneskelige BAL prøvene er sannsynlig å ha sekundær bakteriell forurensning og bruk av antibiotika inne kultur medium er viktig for å begrense forurensning. Primære og sekundære antistoffer kan variere i sin fluorescens, selv med samme produsent. Endelig analyse av lunge er mer kompleks enn BAL prøver og krever tid å utvikle en standardisert tilnærming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer å gjøre i forhold til dette arbeidet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra Monash University, National Health og Medical Research Council, og Monash lunge og sove Institute. Forfatterne ønsker å takke ansatte i klinisk immunologi ved Monash helse, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass og Camden Lo av Monash mikro Imaging (MMI) for hjelp med AC confocal mikroskopi imaging, og forfatterne erkjenner MMI fasiliteter Monash University. Forfatterne bekrefter fasiliteter, og vitenskapelig og teknisk assistanse av Monash Histology plattformen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
