Summary
Macrophage vallen extracellulaire een nieuw beschreven entiteit. Dit artikel zal zich concentreren op confocale microscopie methodes en hoe ze zijn gevisualiseerd in vitro en in vivo van longkanker monsters.
Abstract
Een primaire methode gebruikt om te definiëren van de aanwezigheid van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) is confocale microscopie. Wij hebben gevestigde confocale microscopie methodes om te visualiseren macrofaag extracellulaire vallen (METs) bewerkt. Deze extracellulaire traps worden gedefinieerd door de aanwezigheid van extracellulaire chromatine met co uitdrukking van andere onderdelen zoals de submodule proteasen, citrullinated histonen en peptide arginase deiminase (PAD). De expressie van METs is over het algemeen gemeten na blootstelling aan een stimulans en vergeleken met un-gestimuleerd monsters. Monsters zijn ook opgenomen voor achtergrond en isotype controle. Cellen worden geanalyseerd met behulp van welomschreven afbeelding analysesoftware. Confocale microscopie kan worden gebruikt om te definiëren van de aanwezigheid van METs zowel in vitro als in vivo in longweefsel.
Introduction
Neutrofiele extracellulaire vallen (netten), werden voor het eerst beschreven door Brinkmann et al. 1 ze zijn overwegend geproduceerd in reactie op de infectie (vooral voor bacteriën) en hebben een belangrijke rol in host defense1,2. Ze zijn ook beschreven moet worden uitgevoerd in reactie op niet-besmettelijke ziekte, met inbegrip van vasculitis en systemische lupus erythematosus (SLE); en naar de mitogeen phorbol 12-myrisate 13-acetaat (PMA)2,3. Het is onlangs erkend dat andere celtypes extracellulaire vallen, met inbegrip van de macrofagen, ook kunnen produceren. Macrophage extracellulaire vallen (METs) zijn nog niet een goed gedefinieerde entiteit in de literatuur4,5. We hebben onlangs gevestigde methoden voor het detecteren van de aanwezigheid van METs zowel in vitro als in vivo6,7. In dit artikel, zal de meting van METs met behulp van de confocal microscopie worden beschreven.
Zeer belangrijke eigenschappen van NETosis die zich van andere cellulaire routes (zoals apoptosis8 onderscheidt) zijn de extrusie van de chromatine in combinatie met: (1) Citrullinatie van histones (H3Cit)9, (2) mede uiting van de submodule proteasen10 , en (3) betrokkenheid van peptide arginine deiminase (PAD) 411,12. Macrofagen express ook H3Cit, submodule proteasen en PAD en deze functies kunnen worden gebruikt voor het definiëren van de aanwezigheid van METs.
METs hebben soms een bijzonder belangrijke rol in de longen, de macrofaag is de dominante cel aanwezig in de longblaasjes en de luchtwegen van de longen en heeft de eerste rol in de leiding van de cellulaire immuunrespons infectie/ontsteking. Bovendien, terwijl een groot deel van de Long is de lege ruimte (bijvoorbeeldbinnen de longblaasjes), kunnen de METs potentieel uit te breiden in de ruimte beschikbaar is, in tegenstelling tot solide organen.
De meest gebruikte methode om te definiëren van de aanwezigheid van netten is door confocale microscopie. Er is nog niet een duidelijk omschreven manier om te meten METs. De techniek voor de meting van de netten is aangepast voor het meten van de aanwezigheid van METs in dit protocol zijn. De belangrijkste vereisten voor deze methode zijn toegang tot confocale microscopie en passende denkbaar software voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dit protocol volgt experimenten goedgekeurd: (1) mensen door de ethische commissie van Monash medisch centrum, en (2) dieren door de ethische commissie van de Universiteit van Melbourne.
1. Bronchoalveolar Lavage (BAL) macrofagen
- gebruik BAL te verkrijgen van longkanker macrofagen in: (1) mens onderwerpen door bronchoscopie 6, en (2) muizen met behulp van intra-tracheale aspiratie 13 .
Opmerking: Overname van de macrofagen in het algemeen veroorzaakt een activering van deze cellen. Macrofagen zijn verkregen van patiënten die behoefte hebben aan een bronchoscopie te onderzoeken van een potentiële medisch probleem en niet alle onderwerpen mogelijk geschikt voor analyse van METs (dit zal moeten worden bepaald voor elk afzonderlijk project).- De BAL oplossing en de spin naar beneden (500 x g gedurende 10 minuten) naar formulier een pellet, wassen tweemaal met kweekmedium (Roswell Park Memorial Instituut Medium (RPMI) met foetaal kalfsserum van 5% en 1% L-glutamine) bij kamertemperatuur, en vervolgens verdund cellen in 4 mL cultuur medi Umm.
- Indien nodig, verzoeken een formele differentiële telling; allermeest naar de cellen (in het algemeen > 80%) zullen macrofagen 6.
Opmerking: Dit zal over het algemeen worden uitgevoerd door een service van de klinische histologie met behulp van de morfologische uiterlijk van de verschillende cellen typen 6. - Uitvoeren een levensvatbare macrofaag cel rekenen op de oplossing van de BAL met Trypan blauwe uitsluiting en een hemocytometer.
Opmerking: BAL oplossing wordt verkregen uit mensen en muizen zoals vermeld in stap 1.1. - Toevoegen 1-4 x 10 5 macrofagen aan 24-Wells-platen op coverslips in 500 µL cultuurmedium per goed en laat 's nachts bij 37 ° C; de cellen zal voldoen aan de coverslips. Voor menselijke specimens, het toevoegen van antibiotica (b.v., penicilline en streptomycine, 10 4 U/mL) ter voorkoming van bacteriële besmetting.
2. Immunofluorescentie labelen/microscopie van BAL macrofagen
Opmerking: cellen worden nageleefd op coverslips zoals hierboven vermeld.
- Verwijderen van het kweekmedium en wassen van de cellen een keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Repareren van cellen in 2% paraformaldehyde/Perjodaat/lysine (PLP) fixatief voor 10 min.
- Wassen van cellen kort in PBS, en vervolgens permeabilize in 0,2% Tween 20 in PBS voor 20 min.
- Blok cellen met 10% kip sera in 5% bovien serumalbumine (BSA) zijn verdund in PBS voor 30 min.
- Incubate met primaire en isotype controle antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur bij 1:100 concentraties (meer bijzonderheden staan in Tabel van materialen) op 37 ° C.
Opmerking: Voor de monsters van de BAL, een specifieke marker van macrofagen is meestal niet vereist. - Na de toevoeging van primaire antilichamen, wassen van de cellen in PBS en verder met de bijbehorende secundaire antilichamen voor 40 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Wassen van de secties in PBS en mount met montage DAPI gebaseerde medium voor visualisatie gebruik een confocal microscoop (zoals hierboven vermeld) laser excitaties 405, 488, 561 en 647 nm en een 40 X, 1.0 nb olie doelstelling.
3. Long weefselsteekproeven
Opmerking: voor in vivo studies van longweefsel, bestuderen de monsters na de relevante blootstelling (bv zoals beschreven door O ' Sullivan et al. 7). de blootstelling die meest relevant is voor dit experiment zijn infectieuze micro-organismen, met name bacteriën. Muis-stammen die kunnen worden gebruikt voor deze methode zijn C57BL/6 of BALB/c muizen, 10-12 weken oud, dikte 25-30 g en mannetje.
- Euthanaseren muizen, via een intraperitoneale injectie van ketamine (400 mg/kg) en xylazine (40 mg/kg). Open de borstholte en bloot de longen en het hart met behulp van chirurgische Tang en schaar.
- Infusie van warme PBS met behulp van een 21-gauge naald in het rechterventrikel te wassen uit het bloed van de vaartuigen voor 30 s, vervolgens de infusie van 10 mL 2% PLP fixeerspray voor 30 s (in de rechter ventrikel).
- Kunt de open borstholte lavage warme PBS (42 ° C). Intubate van de luchtpijp met een 21-gauge-naald en een stuk van 0,8 mm buis op maat, gesneden en injecteren 800 µL voorverwarmde (tot 42 ° C), laag-smelten punt 3% agarose oplossing.
- Tie uitgeschakeld de luchtpijp met gevlochten zijde (4.0 USP). Plaats de draad rond de luchtpijp, net onder de invoegpositie van de canule, en veilig via een eenvoudige bovenhands knoop. Beheren om te stollen de agarose, ijskoude PBS rond de longen. Verwijder de longen en het hart als een blok van de borstholte met behulp van zowel de schaar en de botte dissectie. Elke Long afzonderlijk verwijderen en deze vervolgens oplossen voor 16 h in 2% PLP of formaline bij 4 ° C.
- Bewaren de exemplaren in PBS bij 4 ° C tot het weefsel segmenteren. Deze methoden voor het verkrijgen van longweefsel zijn eerder beschreven 13.
- Ter voorbereiding van het longweefsel monsters gebruiken de volgende stappen uit.
- Fix longweefsel weefsels (gereseceerd in stap 3.1) in 10% natuurlijke gebufferde formaline gedurende 24 uur bij kamertemperatuur. Transfer naar 75% ethanol en zet in een weefsel processor op een cyclus van 12 h, (2,5 h in 75% EtOH, 3 h in absolute EtOH, 3,5 h in oplosmiddelen 3B en 3 h in paraffine).
- Insluiten in standaard paraffine maken van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE)-blokken die zijn opgeslagen op kamertemperatuur.
Opmerking: In dit stadium is het meestal handig om snijden van de Long-secties voor standaard dia's. - De FFPE Long secties bij 4-5 µm dikte gebruikend microtome knippen en monteren op opgeladen, gecoate dia's zoals eerder beschreven door O ' Sullivan et al. 7
- te monteren van dia's, doe 3 druppels van montage medium op 60 x 24 mm coverslips (grootte 1.5), omkeren van de dia op het dekglaasje aan overtollige medium uitduwen. Hermetisch verzegelen met nagellak en bewaren bij kamertemperatuur.
4. Voorbereiding/microscopie van weefselmonsters Lung
- -wax, hydrateren en voorbehandeling van het monster FFPE Long weefsel met de oplossing van de gegevensherwinning van antigeen.
- Oven droog de FFPE dia's gedurende 60 minuten op 60 ° C. Zet dan de dia's in xyleen oplossing voor 30 min en overdracht aan 70% ethanol oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Spoelen in leidingwater.
- Plaats in warmte-proof plastic omslag en onder voorbehoud van de HIER-antigeen ophalen in een snelkookpan voor 10 min in 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. Cool voor 20 min. Wash tweemaal in leidingwater voor 5 min op een rocker, dan één keer met PBS op rocker.
- Blok met 10% kip serum in 5% BSA/PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Vlek van het weefsel.
- Definiëren METs in macrofagen, toevoegen van primaire antilichamen (MMP-9, H3Cit en F4/80) in 1% BSA/PBS gedurende 16 uur bij 4 ° C bij verdunning van 1/100 (specifieke details over antilichaam bedragen zijn vermeld in Tabel van materialen). Wassen twee keer met PBS gedurende 5 minuten op een rocker.
- Bereiken fluorescerende detectie door incubatie met bijbehorende secundaire antilichamen in 1% BSA/PBS voor 40 minuten bij kamertemperatuur. Antilichamen zijn: (1) kip-antimuis 488 (groen), kip (2) anti-geit 594 (rood) en (3) ezel-antimuis 647 (veel rode).
- Wassen van de secties in PBS en zware montering met DAPI-bevattende montage medium voor de kleuring van de chromatine.
- Verkrijgen van fluorescerende beelden met behulp van een confocale laser scanning hoofd gekoppeld aan een omgekeerde Microscoop.
- Excite de voorbereiding met 405, 488, 561 en 647 nm lasers. Enkel vliegtuig 512 x 512-pixel beelden vastleggen door te klikken op de lijn-sequentiële, herverdeling van de knop (2 lijn gemiddeld) met behulp van 20 X 0.1 nb lucht en 40 X 1.0 nb olie doelstellingen.
- Verkrijgen ten minste tien gezichtsveld per sectie voor analyse en gegevens voor elk resultaat (dat wil zeggen, 10 high-power gezichtsveld (HFOV) voor het besturingselement, 10 voor de gestimuleerd monster, etc., voor elke muis).
Opmerking: Voor het verkrijgen van een representatief monster van het hele veld, een matrix systeem kan worden gebruikt in waarin het veld is verdeeld in verschillende secties en voor elk ander monster dezelfde matrix wordt gebruikt om de weergave van de velden te selecteren (bijvoorbeeld het veld kan worden onderverdeeld in 9 secties, en van het centrum en de 4 hoeken, de twee HFOV worden genomen).
5. Driedimensionale (3-D) Imaging van METs
Opmerking: METs zijn 3D-structuren, door het nemen van meerdere z-stack beelden, die zijn aangemaakt, waardevolle informatie kunnen geven.
- Sectie van de specimens van de longkanker van paraffineblokken, op 200 µm met een vibratome bij een amplitude ingesteld op 1,8 mm en snelheid van 0,1-0,5 mm/s.
- Blokkeren van longweefsel met 20% van de respectieve serum (foetaal kalfsserum van 10% en 10% kip serum) en vervolgens in PBS aangevuld en 3,75% permeabilize Triton-X 100 gedurende 7 uur bij kamertemperatuur onder zachte agitatie.
- Vlek de secties gedurende 16 uur bij 4 ° C met de relevante primaire antilichamen (MMP-9, H3Cit en F4/80) in 200 µL volumes in microcentrifuge buizen (antilichaam concentraties zijn vermeld in Tabel of Materials).
- De secties in PBS, 3 keer voor 10 minuten vóór het incuberen met relevante secundaire antilichamen bij kamertemperatuur voor 1 h. wassen
- Vlek van de Long-secties voor DAPI (1:5, 000) in oplossing voor 20 min, voordat dia's toevoegen van de cover glijdt naar de Microscoop in PBS.
- Verkrijgen van fluorescentie beelden met behulp van een omgekeerde confocal microscoop (40 x 1.3 nvt) voorzien van 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm, en 635 nm lasers.
- 3D-z-stapels van 0,54 µm dikte met optimale z-segmenteren voor de 40 x 1.3 nb olie doelstelling opnemen.
Opmerking: De software die wordt gebruikt zal variëren afhankelijk van de individuele Microscoop. Een voorbeeld van hoe de software kan worden gebruikt voor een microscoop is voorzien in aanvullende bestand 1.
6. Analyse van het beeld
Opmerking: de analyse van monsters vereist het gebruik van specifieke beeldvorming analysesoftware en voorbeelden staan in Tabel van materialen. Hoewel de analyse van de resultaten zullen afhankelijk van het specifieke programma gebruikt, de hieronder vermelde punten zijn belangrijk.
- Analyse van de BAL monsters
- definiëren het aantal macrofagen door het blauwe kanaal selecteren voor DAPI en het toewijzen van een minimale grootte van de cellen (bijvoorbeeld, > 18 µm in diameter). Met behulp van de desbetreffende software, het meten van het totale aantal macrofagen per veld.
- Het aantal cellen die de kenmerken van een BMO door de aanwezigheid van extracellulaire chromatine gedetecteerd door DAPI met co uitdrukking van andere markeringen (bijvoorbeeld, MMP12, PAD2 en H3Cit hebben).
Opmerking: Het aantal markeringen die kan worden geanalyseerd is afhankelijk van het aantal lasers beschikbaar, maar idealiter naast DAPI, ten minste twee andere markeringen moeten worden opgenomen. Andere minder specifieke parameters voor BMO expressie (bijvoorbeeld, het aantal cellen met extracellulaire chromatine en een uitgebreide kern) kan worden gebruikt. - Vergelijken de BMO-expressie in BAL analyseren monsters (tussen de controle, rook, en rook/DNase behandelde groepen), een minimum van 100 BAL macrofagen per monster.
- Voor het meten van secundair antilichaam en isotype gehalte van fluorescentie; meten van minimaal 100 cellen in elk monster voor hun fluorescentie. Meten van het gemiddelde niveau van achtergrond fluorescentie voor iedere markeerdraad (bijvoorbeeld H3Cit) met behulp van standaardsoftware.
- Te definiëren MET de expressie, tellen de cellen met de typische fenotype (b.v., extracellulaire chromatine met co uitdrukking van H3Cit en MMP9) en voor elke BMO, het meten van het niveau van de fluorescentie van merkers (bijv, H3Cit en MMP9). Uitsluiten van cellen produceren METs als hun kleuring niet boven achtergrond en isotype besturingselement was.
- Voor menselijke specimens van de BAL, het analyseren van een minimum van 100 cellen voor elk monster voor het percentage van de macrofagen die METs maken. Voor lymfkliertest monsters, zoals de cellen kleiner zijn en METs moeilijker zijn te definiëren, analyseren een groter aantal cellen voor elk monster (b.v., 200 macrofagen).
- Analyse van longkanker weefselsteekproeven
- gebruiken om te bepalen van de aanwezigheid van METs in longweefsel, specifieke macrofaag marker zoals F4/80.
- De aanwezigheid van METs in longweefsel te definiëren met behulp van de co lokalisatie van F4/80 in cellen die uitdrukken van extracellulaire chromatine met andere parameters, zoals vermeld in sectie 6.1.
- Bepalen de niveaus van achtergrond fluorescentie in monsters met een secundair antilichaam en de isotype-besturingselementen. METs uitsluiten analyse die niet boven achtergrond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
METs kunnen worden gevisualiseerd van BAL monsters, in longweefsel en dikker Long secties met 3D-beelden. Een voorbeeld van METs gevisualiseerd in een monster van de BAL is weergegeven in Figuur 1. De morfologie van de METs hangt af van hun fase van rijping. De eerste detecteerbare functie op microscopie is het verkeer van de kern tot aan de rand van de cel. Dit wordt gevolgd door extracellulaire chromatine met andere mede uitgedrukt bemiddelaars, zoals H3Cit en submodule proteasen. In de vroegere stadia heeft de cel nog steeds een ruwweg bolvormig vorm met de extracellulaire val uitgedrukt. In latere stadia, wordt de vorming van BMO gekenmerkt door rek van het lichaam van de cel.
Longweefsel METs zijn afgebeeld in Figuur 2. Zoals de longen worden opgeblazen met vloeistof om te definiëren van de Long architectuur, zal de METs in het algemeen tegen de alveolaire wanden worden geduwd. De morfologie van de METs zal ook variëren afhankelijk van welke vliegtuig het weefsel werd gesneden in. De standaard secties gebruikt voor Long weefselsteekproeven zijn 4-5 µm in dikte. Dikkere weefselsecties inschakelen meerdere beelden te nemen en de METs kunnen vervolgens worden weergegeven met 3D-opmaak. De antilichamen alleen tot nu toe zal doordringen in het longweefsel en een dikte van de afdeling van 25-50 µm is optimaal. Een voorbeeld van een 3D-beeld is afgebeeld in Figuur 3 en in Video 1.
Figuur 1: BAL METs. Menselijke BAL METs gevormd na stimulatie in de verschillende stadia van ontwikkeling. METs werden gekenmerkt door extracellulaire chromatine met co uitdrukking van H3Cit en MMP9. Kleuring voor chromatine van (A), (B) H3Cit, (C) MMP9 en (D) de samengevoegde afbeelding. Deelvenster inserts zijn isotype besturingselementen. Schaal bars = 10 µm (15 µm voor isotype). Een eerder stadium MET wordt weergegeven in de hoogste juiste hoek en heeft een ruwweg bolvormig vorm. Een meer volwassen BMO wordt weergegeven in het midden van het veld. Beelden werden genomen met behulp van een laser scannen confocal microscoop en een 40 x 1.0 nb olie doelstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: longweefsel METs. Lymfkliertest METs in longweefsel na stimulatie. De METs gekenmerkt door extracellulaire chromatine met mede uiting van H3Cit, MMP9 en F4/80 (als een macrofaag marker). Deelvenster (A) toont een typische high-power gezichtsveld gebruikt voor het meten van het aantal METs; Panelen (B--F) Toon de gestreepte vierkante gebied onder hogere vergroting. Kleuring voor chromatine (B), (C) H3Cit, (D) MMP9, (E) F4/80 en (F) de samengevoegde afbeelding. Paneel Invoegen is de isotype-controle. Schaal bars = 20 µm (20 µm voor isotype). METs zijn over het algemeen duwde tegen de alveolaire wanden. Beelden werden genomen met behulp van een laser scannen confocal microscoop en een 40 x 1.3 nb olie doelstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: driedimensionale weergave van longkanker sectie. Muis longweefsel was vastgesteld en snijd in 25-35 µm dik secties. Weefsel was gelabeld met markeringen voor METs en beeld met secties bij 1 µm dikte. Afbeeldingen werden gecombineerd met een z-stapel om een 3-dimensionale beeld van een BMO. Beelden werden genomen met behulp van een laser scannen confocal microscoop en een 40 x 1.3 nb olie doelstelling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1: driedimensionale weergave van longkanker sectie. Video komt overeen met monsters gepresenteerd in Figuur 3. As teken = 5 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode die is beschreven in deze review is gebaseerd op die gebruikt voor het definiëren van de aanwezigheid van netten14. Macrofagen zijn veruit de dominante celtype in BAL monsters en deze methode van collectie is bijzonder geschikt voor de studie van METs. Als de rode bloedcellen in de BAL aanwezig zijn, moeten deze cellen worden lysed met behulp van ammoniumchloride. De BAL procedure zal in het algemeen het activeren van de macrofagen en daarom naar verwachting zullen er METs aanwezig in un-gestimuleerd monsters. De BAL macrofagen zijn meestal zeer aanhangend. De macrofagen BAL over het algemeen nodig niet een specifieke marker als deze cellen de dominante celtype zijn en kunnen ook worden onderscheiden door hun morfologie. Meestal in een BAL, groter is dan 80% van de cellen macrofagen zijn (en neutrofielen minder dan 5 zijn %), en na meerdere wasbeurten, over het algemeen blijven alleen de aanhangend leukocyten (dat wil zeggen, de macrofagen)6. Als er twijfel bestaat over het vermogen om te onderscheiden van macrofagen van neutrofielen bij de mens, mogen een neutrofiele marker zoals neutrophil elastase worden gebruikt. In longweefsel is een specifieke macrofaag marker (bijvoorbeeldF4/80) vereist, zoals macrofagen moeilijk zijn te onderscheiden van andere celtypes. Macrofagen hebben auto-fluorescentie dus het gebruik van besturingselementen voor achtergrond en isotype belangrijk is; Dit is met name het geval met gestimuleerd monsters.
De beste manier om te definiëren van de aanwezigheid van METs moet nog worden bepaald. Specifieke trajecten/processen, die voor zowel neutrofielen en macrofagen gelden zijn: (1) granulaire proteasen, (2) Citrullinatie van histones, en (3) PAD. PAD4 is meer specifiek voor neutrofielen, terwijl PAD2 meer prominent in de monocyten/macrofagen is. Het gebruik van F4/80 is een goed aanvaard marker voor lymfkliertest macrofagen, maar menselijke macrofagen hebben geen dergelijke welomschreven markeringen en dit kan problemen opleveren bij de beoordeling van menselijke longweefsel voor BMO expressie. Analyseren van BMO expressie in longweefsel kan worden moeilijker, want er veel andere celtypen zijn en de METs de neiging te worden geduwd op de alveolaire wanden. Bij het analyseren van weefselsecties, worden METs best gevisualiseerd wanneer ze plat in dwarsdoorsnede; Als de METs in een ander vlak die kan er moeilijk om te bepalen of een BMO worden is aanwezig. Dit probleem kan worden verholpen tot op zekere hoogte door z-stacks om diepere weefsels (3-D) vliegtuigen voor de behandeling van METs en het potentieel om te visualiseren de METs in verschillende aspecten.
Er is niet een goed aanvaarde methode voor het bepalen van de aanwezigheid van METs in Long monsters. De beschreven methoden berusten op die worden gebruikt voor het visualiseren van de netten. Chow et al. beschreven dat de mitogeen PMA METs geïnduceerd in een macrofaag cellijn, zoals beoordeeld door de aanwezigheid van extracellulaire chromatine15. Een latere studie aangetoond dat Mycobacterium tuberculosis METs in vitro, geïnduceerde zoals gedefinieerd door de aanwezigheid van extracellulaire chromatine en H3Cit16. Wij hebben getoond in vivo in een model van glomerulonephritis, dat METs aanwezig in de nieren zijn zoals gedefinieerd door mede gelokaliseerde chromatine, histone en myeloperoxidase7. Tot slot hebben we de aanwezigheid van METs in vitro in menselijke longen macrofaag aangetoond door de combinatie van extracellulaire chromatine en MMP126. Onze methode kan worden gebruikt door andere onderzoekers naar het onderzoek van dit belangrijke facet van de ontstekingsreactie.
Het is waarschijnlijk dat dat een belangrijke rol in chronische ontstekingsziekte METs wordt herkend. De processen die tot NETosis leiden zijn nog steeds niet duidelijk omschreven. De studie van METs kan aanzienlijke inzicht verwerven in de mechanismen van de vorming van de val. De ontwikkeling van protocollen met meer markeringen en functionele studies van METs zal de rol van METs verder te definiëren in de ziekte.
Er zijn kritische stappen die wij hebben vastgesteld in dit protocol. De menselijke BAL monsters zijn kunnen secundaire bacteriële besmetting hebben en het gebruik van antibiotica in een kweekvloeistof is belangrijk voor het beperken van verontreiniging. De primaire en secundaire antilichamen kunnen variëren in hun fluorescentie, zelfs met dezelfde fabrikant. Tot slot, de analyse van longkanker weefselsteekproeven is complexer dan BAL monsters en vergt tijd een gestandaardiseerde aanpak te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen informatieverschaffing met betrekking tot dit werk.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Monash University, the National Health en Medical Research Council en de Monash Lung en slaap Instituut. De auteurs bedank de medewerkers van klinische immunologie aan Monash gezondheid, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass en Camden Lo van Monash Micro Imaging (MMI) voor hulp met de confocal microscopie, imaging, en de auteurs erkennen de MMI-faciliteiten van de Monash University. De auteurs erkennen de faciliteiten, en de wetenschappelijke en technische bijstand van de Monash histologie Platform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
