Summary
대 식 세포 세포 외 트랩은 새로 설명된 엔터티. 이 기사는 confocal 현미경 검사 법 방법에 집중할 것 이다 그리고 그들은 어떻게 시각 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 샘플에서.
Abstract
호 중구 extracellular 함정 (그물)의 존재를 정의 하는 데 사용 하는 기본 방법 confocal 현미경 검사 법 이다. 우리는 대 식 세포 extracellular 함정 (메츠) 시각화 설립된 confocal 현미경 검사 법 방법 수정 했습니다. 이러한 extracellular 함정과 립 프로 테아 제, citrullinated 히스톤, peptidyl arginase deiminase (패드) 등 다른 부품의 공동 식 extracellular chromatin의 존재에 의해 정의 됩니다. 메츠의 식은 일반적으로 자극에 노출 후에 측정 하 고 유엔 자극 샘플에 비해. 샘플 배경 및 isotype 제어에 대 한 포함 됩니다. 셀 잘 정의 된 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. Confocal 현미경 검사 법 메츠의 존재를 정의 하는 데 사용할 수 있습니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 폐 조직에.
Introduction
호 중구 extracellular 함정 (그물), Brinkmann 외. 에 의해 처음으로 설명 했다 1 그들은 주로 (특히 박테리아)에 감염에 대 한 응답에서 생산 되 고 호스트 방어1,2에서 중요 한 역할을 했습니다. 그들은 또한 맥과 반성 루 푸 스 (SLE);를 포함 하 여 비 전염 성 질병에 응답에 설명 되었습니다. 그리고 물질 phorbol 12-myrisate 13-아세테이트 (PMA)2,3. 그것은 최근에 다른 세포 유형 대 식 세포를 포함 한 extracellular 함정 생산 또한 수 있습니다 인식 하고있다. 대 식 세포 extracellular 함정 (메츠)는 아직 문학4,5에서 잘 정의 된 엔터티. 우리는 최근 설립 메츠의 존재를 감지 방법을 생체 외에서 그리고 vivo에서6,7. 이 문서에서는, 메츠 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정을 설명 합니다.
(Apoptosis8) 같은 다른 세포질 통로에서 그것을 구별 하는 NETosis의 주요 특징은 함께에서 chromatin의 압출: 히스톤 (H3Cit)9(1) citrullination, (2)과 립 프로 테아 제10의 공동 식 , peptidyl 아르기닌의 deiminase (패드) 4의 (3) 참여11,12. 대 식 세포는 또한 H3Cit과 립 프로 테아 제, 그리고 패드, 표현 하 고 이러한 기능 메츠의 존재를 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.
메츠는 대 식 세포는 폐 포와 폐의 기도에 있는 지배적인 셀 고 감염/염증 세포 면역 반응을 지시에 초기 역할이 폐, 특히 중요 한 역할을 할 수 있습니다. 또한, 폐의 대부분은 빈 공간 (예를 들어,는 폐 포 내), 메츠 잠재적으로 단단한 장기와 달리 사용 가능한 공간으로 확장 수 있습니다.
그물의 존재를 정의 하는 가장 널리 사용 되는 방법은 confocal 현미경 검사 법입니다. 있다 아직 메츠를 측정 하는 명확 하 게 정의 된 방법. 그물의 측정에 대 한 기술이이 프로토콜에 메츠의 존재를 측정 하는 적응 하고있다. 이 메서드에 대 한 주요 요구 사항 분석 confocal 현미경 검사 법 및 적절 한 이미징 소프트웨어에 액세스할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜에 승인 하는 실험을 다음과 같이: (1) 윤리 위원회의 모나 쉬 의료 센터, 멜버른 대학교의 윤리 위원회에 의해 (2) 동물에 의해 인간.
1. Bronchoalveolar 게 (BAL) 세포
- 에 폐 세포를 사용 하 여 발: (1) 인간의 내부 tracheal 포부를 사용 하 여 상계 6, 및 (2) 마우스 과목 13 .
참고: 대 식 세포의 인수는 일반적으로 이러한 세포의 일부 활성화를 발생합니다. 대 식 세포는 잠재적인 의료 문제를 조사 하는 상계를 필요로 하는 환자에서 얻은 고 모든 과목 (이 각 개별 프로젝트에 대 한 결정을 해야 합니다) 메츠의 분석에 적합 있을 수 있습니다.- 발 솔루션 및 회전 (10 분 동안 500 x g) 감소 형태로 펠 릿, 문화 매체 (로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 5% 태아 종 아리 혈 청 및 1 %L-글루타민), 실내 온도에 두 번 세척 및 다음 셀 문화 메디의 4 mL에 희석 음.
- 필요한 경우 요청 정식 차동 수; 세포의 대부분 (일반적으로 > 80%) 대 식 세포 6 됩니다.
참고:이 일반적으로 의해 수행 됩니다 다른 세포 유형 6의 morphologic 모양을 사용 하 여 임상 조직학 서비스. - 수행 가능한 대 식 세포 세포 Trypan 블루 제외 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 발 솔루션에 셀.
참고: 발 솔루션 단계 1.1에서에서 설명 했 듯이 인간과 쥐에서 얻은입니다. - 추가 1-4 × 10 5 대 잘 두고 당 문화 매체의 500 µ L에서 coverslips에 24-잘 접시를 37 ° C에서 하룻밤; 세포는 coverslips를 준수 합니다. 인간의 샘플에 대 한 항생제를 추가 (예: 페니실린, 스, 10 4 U/mL) 세균 오염을 방지 하기 위해.
2. 발 대 식 세포의 면역 형광 검사 레이블/현미경
참고: 위에서 언급 한 세포 coverslips에 준수.
- 문화 매체를 제거 하 고 셀 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)을 한 번 씻어. 10 분에 대 한 2 %paraformaldehyde / periodate/lysine (PLP) 정착 액 셀 수정
- PBS, 짧게 셀을 세척 하 고 0.2 %permeabilize에서 다음 20 분에 대 한 PBS에 트윈 20
- 10%에서 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 30 분에 대 한 PBS에 희석 치킨 세라 블록 셀
- 품 주 및 isotype 제어 항 체 37에서 1: 100 농도 (자세한 정보는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 실 온에서 1 h에 대 한 ° C.
참고: 벨 샘플에 대 한 대 식 세포의 특정 마커 일반적으로 필요 하지 않습니다. - 기본 항 체의 추가 후 PBS, 셀을 세척 하 고 실 온에서 40 분 동안 해당 보조 항 체와 더 품 어.
- PBS에 마운트 장착 DAPI 기반 매체 레이저 업무가 647, 561, 488, 405 nm와 40 X (듯이) confocal 현미경을 사용 하는 시각화에 대 한 섹션을 세척, 1.0 나 오일 목표.
3. 폐 조직 샘플
참고: vivo에서 연구의 폐 조직, 관련 노출 후 샘플을 연구 (예를 들어, O에 의해 설명 된 대로 ' 설리반 외. 7).이 실험에 대 한 가장 관련성이 높은 노출은 감염 성 미생물, 특히 세균. 이 메서드에 사용할 수 있는 마우스 종자는 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스, 10-12 주 오래 된, 무게 25 ~ 30 g, 및 남성.
- . 흉 강 열고 폐와 심장 외과 집게와가 위를 사용 하 여 노출 합니다.
- 따뜻한 PBS 30 혈관에서 피를 우 심 실에 21-게이지 바늘을 사용 하 여 달 이다 s, 다음 30 2 %PLP 정착 액 10 mL를 주입 (우 심 실)에 s.
- 오픈 흉 게를 따뜻한 PBS (42 ° C)를 사용합니다. 21 게이지 바늘와 0.8 m m 튜브 크기, 컷의 조각 기도 넣어야 하 고 주사 (42 ° C)를 미리 데워의 800 µ L, 3 %agarose 솔루션 포인트 낮은 녹는.
- 넥타이 꼰 실크 (4.0 USP) 기관에서. 기도, 정의 삽입 지점 바로 아래 주위 스레드 놓고 간단한 overhand 매듭을 통해 그것을 보호 합니다. agarose를 공고히 폐 주위 얼음 처럼 차가운 PBS를 관리 합니다. 가 위 및 무딘 해 부를 사용 하 여 흉 강에서 블록으로 폐 및 심 혼을 제거 합니다. 개별적으로 각 폐를 제거 하 고 다음 16 h 2에 대 한 수정 %PLP 또는 말린 4 ° c.
- 조직 단면까지 4 ° C에서 PBS에는 표본을 저장합니다. 폐 조직을 얻기 위해 이러한 방법은 앞에서 설명한 13 되었습니다.
- . 75% 에탄올으로 전송 및 12 h 주기, (2.5 h 75 %EtOH, 절대 EtOH 3 h, 내용 제 3B, 그리고 파라핀에 3 h 3.5 h) 조직 프로세서에 넣어.
참고:이 단계에서 그것은 일반적으로 표준 슬라이드 폐 섹션을 잘라 편리한.
4. 폐 조직 샘플의 준비/현미경
- 드 왁 스 rehydrate, 항 원 검색 솔루션 FFPE 폐 조직 샘플을 pretreat.
- 오븐 건조는 FFPE 60 ° c.에서 60 분에 대 한 슬라이드 다음 실 온에서 5 분 동안 70% 에탄올 솔루션 30 분 및 전송 자일 렌 용액에 슬라이드를 넣어. 수돗물에 씻어.
- 장소 열 플라스틱 랩에 여기 원 검색 10에서 10 분 압력 밥 솥에 따라 m/mol/L 트리 스, 1 mmol/EDTA pH 9.0. 5 분, 로커에 다음 한 번 PBS를 가진 로커에 대 한 수도 물에 두 번 20 분 세척에 대 한 멋진.
- 블록 5%에서 10% 닭 혈 청 실 온에서 30 분 동안 BSA/PBS.
- 조직 얼룩.
- 대 식 세포에서 메츠를 정의 1%에 1 차 항 체 (MMP 9, H3Cit, 및 f 4/80)을 추가
- 1/100 희석 (항 체 금액에 대 한 특정 정보는 자료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 4 ° C에서 16 h BSA/PBS. 로커에 5 분에 대 한 PBS를 가진 두 번 세척.
- 해당 보조를 가진 외피에 의해 달성 형광 탐지 항 체 1 %BSA에서 / PBS 실 온에서 40 분. 항 체는: (1) 닭 안티 마우스 488 (녹색), 닭 (2) 항 염소 594 (빨간색), 및 (3) 당나귀 반대로 마우스 647 (빨간색까지).
- PBS에 마운트 chromatin는 얼룩이 지기에 대 한 설치 매체 DAPI 포함 된 섹션을 세척.
- Confocal 레이저 스캐닝 머리는 거꾸로 한 현미경에 부착 된를 사용 하 여 형광 이미지를 얻을.
- Excite와 405, 488, 561, 647 준비
- nm의 레이저 라인 연속 클릭 하 여 단일 면 512 x 512 픽셀 이미지를 캡처, 버튼 (2 라인 평균) 20 X 0.1을 사용 하 여 평준화 나 공기와 40 X 1.0 나 석유 목표.
- 얻을 각 결과 (즉, 10 고 전력 분야의 보기 (HFOV) 10 자극된 샘플, 등, 각 마우스 컨트롤에 대 한)에 대 한 데이터 및 분석에 대 한 섹션 당 적어도 10 시야.
참고: 전체 분야의 대표적인 샘플을 얻기 위해 매트릭스 시스템 사용할 수 있습니다 필드 분할 하는로 다른 섹션 같은 매트릭스 보기의 필드를 선택 하는 각 서로 다른 샘플에 대 한 (예를 들어, 필드 9 섹션으로 분할 될 수 있다 그리고 센터 4 모서리에서 두 HFOV 찍힌다).
5. 3 차원 (3 차원) 이미징의 메츠
참고: 메츠는 3 차원 구조, 여러 z-스택 취 함으로써 이미지를 재구성 하는 귀중 한 정보를 제공할 수 있습니다.
- 1.8 m m와 0.1-0.5의 속도 설정 진폭에는 vibratome를 사용 하 여 200 µ m에서 파라핀 블록에서 폐 표본 섹션 m m/s.
- 각각 혈 청 (10% 태아 종 아리 혈 청 및 10% 닭 혈 청)의 20%와 폐 조직 차단 하 고 보충 하는 PBS에 3.75 %permeabilize 다음 부드러운 동요에서 실 온에서 7 h에 대 한 Triton X 100.
- Microcentrifuge 튜브 (항 체 농도 재료의 테이블에에서 나열 됩니다)에서 200 µ L 볼륨에 관련 1 차 항 체 (MMP 9, H3Cit, 및 f 4/80)와 4 ° C에서 16 h에 대 한 섹션을 얼룩.
- 1 헤에 대 한 실 온에서 관련 2 차 항 체와 함께 배양 하기 전에 10 분 동안 3 번 PBS에 섹션을 씻어
- PBS에 슬라이드는 현미경 커버 전표를 추가 하기 전에 20 분 동안 솔루션에 폐 섹션 DAPI (1:5, 000)에 대 한 얼룩.
- 형광 이미지를 거꾸로 confocal 현미경 (40 x 1.3 없음) 405 장비를 사용 하 여 얻을 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm, 그리고 635 nm 레이저.
- 기록 최적의 z 40 x 1.3 나 오일 목표에 대 한 단면 0.54 µ m 두께의 3 차원 z-스택.
참고: 사용 하는 소프트웨어는 개별 현미경 따라 달라 집니다. 소프트웨어를 사용 하 여 한 현미경에는 어떻게 예를 들어 보조 파일 1에 제공 됩니다.
6. 분석 이미지
참고: 특정 이미징 분석 소프트웨어의 사용을 필요로 하는 샘플의 분석 및 예제 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. 결과의 분석은 사용 하는 특정 프로그램에 따라 달라 집니다, 하는 동안 아래 나열 된 점은 중요 하다.
- DAPI 위한 파랑 채널을 선택 하 고 셀에 대 한 최소 크기를 지정 하 여 분석의 발 샘플
- 정의 대 식 세포의 수 (예를 들어, > 18 µ m 직경에서). 관련 소프트웨어를 사용 하 여 측정 필드 당 세포의 총 수.
- 다른 마커 (예를 들어, MMP12, PAD2, 및 H3Cit)의 공동 식 DAPI에서 검색 하는 extracellular chromatin의 존재에 의해 메트로의 기능을가지고 있는 셀의 수를 세.
참고: 분석 될 수 있는 마커 수 레이저를 사용할 수의 수에 따라 달라 집니다 하지만 이상적으로 DAPI, 뿐만 아니라 다른 마커를 두 개 이상 포함 되어야 합니다. 다른 메트로 식 (예를 들면, extracellular chromatin와 진된 핵 세포의 수)에 대 한 특정 매개 변수를 덜 사용할 수 있습니다. - 발에 메트로 식 비교 (는 제어, 연기, 연기/DNase 처리 그룹 사이), 샘플 분석 샘플 당 100 발 세포의 최소. 이차 항 체 isotype 측정 하
- 형광의 수준을 제어; 그들의 형광에 대 한 각 샘플에서 100 셀의 최소 측정. 각 마커를 (예를 들어, H3Cit)에 대 한 배경 형광의 평균 수준을 측정 표준 소프트웨어를 사용 하 여.
- 메트로 식을 정의를 전형적인 형 (예를 들어, H3Cit 및 MMP9 공동 식 extracellular chromatin)와 셀 그리고 각 메트로 대 한 마커 (예를 들어, H3Cit 및 MMP9)의 형광의 수준을 측정. 셀 배경 및 isotype 컨트롤 위에 아니었다 그들의 얼룩이 메츠 생산 제외.
- 인간의 발 샘플에 대 한 최소 100 셀 하 메츠는 대 식 세포의 비율에 대 한 각 샘플에 대 한 분석. Murine 샘플에 대 한 셀은 작은 고 메츠 힘들어 하 정의 분석 (예를 들어, 200 대) 각 샘플에 대 한 셀 수.
- 폐 조직 샘플의 분석
- 폐 조직에 메츠의 존재를 확인 하려면 F4/80 등 특정 macrophage 마커.
- 섹션 6.1에에서 나와 다른 매개 변수와 함께 extracellular chromatin를 표현 하는 셀에서 F4/80의 공동 지역화를 사용 하 여 폐 조직에 메츠의 존재를 정의.
- 이차 항 체와 샘플에 배경 형광의 수준과 isotype 컨트롤을 결정합니다. 배경 위에서 하지 않은 분석에서 제외 하는 메츠.
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Representative Results
메츠는 발 샘플, 폐 조직 및 3 차원 이미지와 두꺼운 폐 섹션에서에서 구상 될 수 있습니다. 발 샘플 시각 메츠의 예는 그림 1에 표시 됩니다. 메츠의 형태는의 성숙의 단계에 따라 달라 집니다. 현미경에 첫 번째 감지 기능은 셀의 가장자리에 핵의 운동 이다. 이것은 H3Cit 및과 립 프로 테아 제와 같은 다른 공동 표현된 중재자와 extracellular chromatin 옵니다. 이전 단계에서 셀 아직도 표현 extracellular 함정으로 대략 구형을 있다. 나중 단계에서 메트로 형성 신장 세포의 본문의 특징 이다.
폐 조직 메츠는 그림 2에 표시 됩니다. 폐는 폐 아키텍처를 정의 하는 액체로 팽창로 메츠 치경 벽에 밀어 일반적으로 것입니다. 메츠의 형태 또한 달라질 수 따라 비행기는 조직에서 절단 되었다. 폐 조직 샘플에 사용 되는 표준 섹션은 4-5 µ m 두께. 두꺼운 조직 섹션을 여러 개의 이미지를 사용 하 고 메츠는 3 차원에서 다음 볼 수 있습니다. 항 체만 지금까지 폐 조직으로 침투 것 이며 25-50 µ m의 섹션 두께 최적. 3 차원 이미지의 예를 들어 비디오 1에서 그림 3 에 표시 됩니다.
그림 1: 발 메츠. 인간의 발 메츠 개발의 다른 단계에서 자극 후 형성. 메츠는 H3Cit와 MMP9 공동 식 extracellular chromatin 특징 이었다. 염색 질 (A), (B) H3Cit, (C) MMP9, 및 (D)에 대 한 병합된 이미지에 얼룩. 패널 삽입 isotype 컨트롤이 있습니다. 스케일 바 = 10 µ m (isotype 위한 15 µ m). 초기 단계 메트로 오른쪽 상단 모서리에 표시 되 고 대략 둥근 모양을. 더 성숙한 메트로 필드 중간에 표시 됩니다. 이미지는 confocal 현미경과 40 x 1.0 나 오일 목표 스캐닝 레이저를 사용 하 여 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 폐 조직 메츠. 자극 후 폐 조직에 murine 메츠입니다. 메츠 (마커로 macrophage) H3Cit, MMP9, 및 f 4/80의 공동 식 extracellular chromatin 특징 되어 있다. 패널 (A) 메츠;의 수를 측정 하는 데 사용 일반적인 전력 분야의 보기를 보여 줍니다. 패널 (B-F) 높은 확대 아래 점선된 사각형 영역을 표시합니다. 염색 질 (B), (C) H3Cit, (D) MMP9, (E) f 4/80, 그리고 (F)에 대 한 병합된 이미지에 얼룩. 삽입 패널 isotype 컨트롤입니다. 바 규모 = 20 µ m (isotype 위해 20 µ m). 메츠는 치경 벽에 일반적으로 적용 됩니다. 이미지는 confocal 현미경과 40 x 1.3 나 오일 목표 스캐닝 레이저를 사용 하 여 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 폐 섹션의 3 차원 보기. 마우스 폐 조직 고정 되었고 25-35 µ m 두꺼운 부분으로 잘라. 조직 메츠에 대 한 표식으로 표시 되었고 섹션 1 µ m 두께에서 몇 군데. 이미지는 메트로의 3 차원 그림을 생성 하려면 z 스택과 함께 결합 했다. 이미지는 confocal 현미경과 40 x 1.3 나 오일 목표 스캐닝 레이저를 사용 하 여 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: 폐 섹션의 3 차원 보기. 비디오는 그림 3에 나오는 샘플에 해당 합니다. 축 눈금 = 5 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
이 리뷰에서 설명 하는 방법을 기반으로 그물14의 존재를 정의 하는 데 사용 되는. 대 식 세포는 지금까지 발 샘플에서 지배적인 셀 형식이 고 컬렉션의이 방법은 특히 메츠 공부에 대 한 적합 한. 적혈구는 발에 존재 하는 경우이 셀 염화 암모늄을 사용 하 여 lysed 한다. 발 절차 일반적으로 대 식 세포를 활성화 하 고 따라서 메츠 취소 자극 샘플에 있을 것으로 예상 된다. 발 대 식 세포는 일반적으로 매우 부착. 발 대 식 세포 일반적으로 필요 하지 않습니다 특정 표식이 셀이 지배적인 세포 유형 그리고 또한 그들의 형태학에 의해 구별 될 수 있다. 일반적으로 큰 보다 80%는 대 식 세포 (호 중구는 5% 미만), 한 발에 그리고 여러 세척 후에, 일반적으로 (즉, 대 식 세포)만 부착 백혈구6남아 있습니다. 인간 호 중구에서 대 식 세포를 구별할 수 있는 능력에 대해 의심의 여지가, 호 중구 elastase 같이 호 중구 마커를 사용할 수 있습니다. 폐 조직에서 세포는 다른 세포 유형에서 구분 하기 어려운 특정 macrophage 마커 (예를 들어, f 4/80)이 필요 합니다. 대 식 세포는 자동 형광 배경과 isotype 컨트롤의 사용은 중요 하다; 이것은 자극된 샘플 가진 특히입니다.
메츠의 존재를 정의 하는 가장 좋은 방법은 확인할 수 있다. 특정 경로/프로세스, 중 성구 및 대 식 세포에 공통 하는: (1) 세분화 된 프로 테아 제, 히스톤, 및 (3) 패드 citrullination (2). PAD4는 호 중구, 대 한 좀 더 구체적인 PAD2 monocytes/대 식 세포에서 더 저명 하다 니. F4/80를 사용 하 여 잘 허용된 마커 murine 세포에 대 한 하지만 인간의 세포 같은 잘 정의 된 마커 없는 이며 메트로 식에 대 한 인간의 폐 조직을 평가할 때이 문제가 발생할 수 있습니다. 폐 조직에서 만난 식 분석은 다른 많은 세포 유형 그리고 메츠 치경 벽에 밀어 하는 경향이 더 어려울 수 있습니다. 그들은 평면 횡단면;에 메츠 가장 잘 시각화 조직 단면도 분석할 때 만약 메츠 메트로 결정 하는 것이 어려울 수 있습니다 다른 평면에 존재입니다. Z-스택 메츠와 다양 한 측면에서 메츠를 시각화 하기 위해 잠재력을 조사 하기 위한 깊은 조직 (3 차원) 비행기를 사용 하 여 어느 정도이 문제를 해결할 수 있습니다.
폐 샘플에서 메츠의 존재를 정의 하기 위한 잘 허용된 방법이 아니다. 설명된 방법은 기반으로 그물을 시각화 사용 되. 차 우 외. extracellular chromatin15의 존재에 의해 평가 물질 PMA는 대 식 세포 세포 라인에 메츠 유도 설명. 후속 연구는 결핵균 유도 메츠 생체 외에서, extracellular chromatin와 H3Cit16의 존재에 의해 정의 된 대로 증명. 우리가 나타났습니다 vivo에서 사 구체 신 염, 모델에 메츠는 공동 화 된 염색 질, 히스톤, 및 myeloperoxidase7에 정의 된 대로 신장에 존재. 마지막으로, 우리는 extracellular chromatin와 MMP126의 조합에 의해 메츠에서 생체 외에서 인간 폐 대 식 세포에의 존재를 증명 하고있다. 우리의 방법은 염증 반응의 중요 한 일 면이를 다른 수 사관에 의해 사용할 수 있습니다.
그것은 뉴욕 메츠를 만성 염증 성 질환에서 중요 한 역할을 인식 하 게 됩니다. NETosis에 지도 하는 프로세스는 여전히 분명 하지. 메츠의 연구는 함정 형성의 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 더 많은 마커 프로토콜의 개발 및 기능 연구 메츠의 질병에 메츠의 역할을 정의할 추가 됩니다.
우리은이 프로토콜에서 확인 하는 중요 한 단계가 있습니다. 인간의 발 샘플 2 차 세균 오염 가능성이 있으며 문화 매체에서 항생제의 사용은 제한 하는 오염에 대 한 중요 한. 1 차 및 이차 항 체 그들의 형광, 같은 제조 업체와도 달라질 수 있습니다. 마지막으로, 폐 조직 샘플의 분석 발 샘플 보다 더 복잡 하 고 표준화 된 접근 방법을 개발 하는 데 시간이 필요 합니다.
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Disclosures
저자는이 작품에 관하여 있도록 아무 공개 있다.
Acknowledgments
이 작품은 모나 쉬 대학, 국가 건강 및 의료 연구 위원회, 모나 쉬 폐 및 수 면 연구소에서 교부 금에 의해 투자 되었다. 저자 confocal 현미경 이미징, 모나 쉬, 쥬 디 캘 러 한, 알렉스 Fulcher, Kirstin Elgass, 건강과 Camden Lo의 모나 쉬 마이크로 이미징 (MMI)에 임상 면역학의 직원 도움 감사 하 고 싶습니다 그리고 저자 MMI 시설 인정 모나 쉬 대학. 저자는 시설, 모나 쉬 조직학 플랫폼의 과학 및 기술적인 도움을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
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