Summary
Makrofaj hücre dışı tuzakları yeni açıklanan bir varlık vardır. Bu makale confocal mikroskobu yöntemleri üzerinde konsantre ve nasıl olduklarını vitro ve in vivo akciğer örneklerinden görüntülenir.
Abstract
Confocal mikroskobu, nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) varlığı tanımlamak için kullanılan bir birincil yöntemidir. Makrofaj hücre dışı tuzakları (METs) görselleştirmek için kurulan confocal mikroskobu yöntemleri değiştirdiniz. Bu hücre dışı tuzakları ekstraselüler Kromatin varlığı granül proteaz, citrullinated Histon ve peptit arginase deiminase (PAD) gibi diğer bileşenlerinin ortak ifade ile tanımlanır. METs ifade genellikle bir uyarana maruz kaldıktan sonra ölçülen ve un uyarılmış örnekleri karşılaştırıldığında. Örnekleri de arka plan ve izotip kontrol için yer almaktadır. Hücreleri iyi tanımlanmış görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Confocal mikroskobu METs varlığı tanımlamak için kullanılan vitro ve in vivo akciğer dokusunda.
Introduction
Nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), ilk olarak Brinkmann vd tarafından açıklanan 1 onlar enfeksiyon (özellikle bakteri) yanıt olarak ağırlıklı olarak üretilen ve konak savunma1,2' önemli bir role sahiptir. Onlar da yanıt olmayan bulaşıcı hastalık, vaskülit ve sistemik lupus Eritematozus (SLE); de dahil olmak üzere için gerçekleşmesi için tarif edilmistir ve mitojenle phorbol 12-myrisate 13-asetat (PMA)2,3. Bu son zamanlarda diğer hücre tipleri aynı zamanda hücre dışı tuzakları, makrofajlar da dahil olmak üzere neden olabilir kabul edilmiştir. Makrofaj hücre dışı tuzakları (METs) henüz edebiyat4,5iyi tanımlanmış bir varlık değildir. Biz son zamanlarda METs olup olmadığını belirlemek için yöntemleri kurduk vitro ve in vivo6,7. Bu makalede, METs confocal mikroskobu kullanılarak ölçüm açıklanacaktır.
Kromatin ile birlikte ekstrüzyon (gibi Apoptozis8) hücresel diğer yolları ayırmak NETosis temel özellikleri şunlardır: (1) citrullination histonlarla (H3Cit)9, (2) ortak ifade granül proteaz10 ve peptit arginin deiminase (PAD) 4 (3) katılımı11,12. Makrofajlar da ifade H3Cit, granül proteaz ve PAD ve bu özellikler METs varlığı tanımlamak için kullanılabilir.
METs makrofaj baskın hücre mevcut alveoller ve akciğerin airways ve hücresel immün yanıt enfeksiyon/iltihap için yönetmenlik ilk rolü vardır akciğerde, özellikle önemli bir rolü olabileceğini. Akciğer çok boş alanı (örneğin, içinde alveoller), Ayrıca, METs içine belgili tanımlık yer elde edilebilir, sağlam organların aksine genişletmek potansiyel olarak mümkün iken.
NETs varlığı tanımlamak için en çok kullanılan tarafından confocal mikroskobu yöntemidir. Henüz METs ölçmek için açıkça tanımlanmış bir yol değil. NETs ölçme tekniği METs huzurunda bu protokolü ölçmek için adapte edilmiştir. Bu yöntemin temel gereksinimleri confocal mikroskobu ve uygun görüntüleme yazılımı erişim analizi için vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
yılında deneyler bu iletişim kuralı izler: (1) insanlar tarafından Etik Komitesi, Monash Tıp Merkezi ve Melbourne Üniversitesi Etik Komitesi hayvanlar (2).
1. Bronchoalveolar lavaj (BAL) makrofajlar
- Kullanım akciğer makrofajlar edinmek için BAL: (1) insan denekleri Bronkoskopi 6 ve (2) fareler tarafından içi trakeal aspirasyon kullanarak 13 .
Not: Makrofajlar edinimi genellikle bazı etkinleştirme bu hücrelerinin neden olur. Makrofajlar potansiyel bir tıbbi sorunu araştırmak için Bronkoskopi gerektirir hastalardan elde edilen ve tüm konular (bunun için tek tek her proje belirlenecek gerekir) METs çözümlenmesi için uygun olabilir.- BAL çözüm ve (10 min için 500 x g) aşağı spin için bir Pelet biçiminde, iki kez kültür orta (Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) ile % 5 fetal buzağı serum ve % 1'l-glutamin) oda sıcaklığında yıkayın ve hücre kültür medi 4 ml seyreltik Um.
- Gerekirse, istek resmi bir fark sayısı; hücrelerin çoğu (genellikle > % 80) makrofajlar 6 olacak.
Not: Bu genellikle farklı hücre türleri 6 morfolojik görünümünü kullanarak bir klinik Histoloji hizmeti tarafından gerçekleştirilecek. - Gerçekleştir uygun makrofaj hücre saymak Trypan mavi dışlama ve bir hemasitometre kullanarak BAL çözüm.
Not: BAL çözüm insan ve fare 1.1 adımda belirtildiği gibi elde edilir. - Ekle 1-4 x 10 5 makrofajlar kültür orta iyi ve bırakın başına 500 µL coverslips 24-şey plakaları için 37 ° C'de gecede; hücreleri coverslips için uygun olacaktır. İnsan örnekleri için antibiyotik ekleyin (örneğin, penisilin ve streptomisin, 10 4 U/mL) bakteriyel kontaminasyonu önlemek için.
2. Ayirt etiketleme/mikroskobu BAL makrofajlar,
Not: yukarıda da belirtildiği gibi hücreleri coverslips yapıştırılır.
- Kültür orta kaldırmak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) bir kez hücrelerle yıkayın. % 2 paraformaldehyde/periodate/lizin (PIP) sabitleştirici 10 dakika süreyle hücreleri tamir
- Yıkama PBS kısaca hücrelerde ve %0,2 permeabilize ara 20 dakika sonra 20 dakika süreyle PBS
- Blok hücreleri % 10 tavuk sera içinde %5 sığır serum PBS için 30 dk içinde seyreltilmiş albumin (BSA) ile
- Incubate ilköğretim ve izotip kontrol ile antikor için konsantrasyonlarda (daha özel ayrıntıları Malzemeler tablo içinde listelenen) 1: 100 37 oda sıcaklığında 1 h ° C.
Not: BAL örnekleri için belirli bir işaretleyici makrofajlar, genellikle gerekli değildir. - Birincil antikorlar eklenmesi sonra PBS hücrelerde yıkama ve daha fazla oda sıcaklığında 40 min için ilgili ikincil antikorlar ile kuluçkaya.
- PBS ve montajı ile DAPI tabanlı montaj orta confocal mikroskop lazer uyarilmalar 405, 488, 561 ve 647 nm ve X 40 at (yukarıda belirtildiği gibi) kullanarak görselleştirme için bölümlerde yıka, 1.0 NA petrol hedefi.
3. Akciğer doku örnekleri
Not: için in vivo çalışmalar Akciğer doku örnekleri ilgili maruz kaldıktan sonra çalışma (O tarafından açıklandığı gibi örneğin, ' Sullivan vd. 7). bu deneme için en uygun pozlama bulaşıcı mikroorganizmalar, özellikle bakteri vardır. Bu yöntem için kullanılabilecek fare suşları C57BL/6 veya BALB/c fare, 10-12 hafta yaşlı, ağırlık 25-30 g ve erkek vardır.
- Ketamin (400 mg/kg) ve xylazine (40 mg/kg) mayi bir enjeksiyon yoluyla Euthanize fareler. Göğüs boşluğuna açın ve akciğer ve kalp cerrahi forseps ve makas kullanarak ortaya çıkarmak.
- Sıcak PBS 30 kapları kandan dışarı yıkamak için sağ ventrikül 21'lik iğne kullanarak demlemek s, 10 mL % 2 PIP sabitleştirici 30 demlemek s (içine sağ ventrikül).
- Sıcak PBS (42 ° C) lavaj açık göğüs boşluğu kullanın. Trakea 21'lik iğne ve boyutuna, kesme 0.8 mm boru parçası ile entübasyon ve Önceden ısıtılmış (için 42 ° C), 800 µL enjekte, düşük erime noktası % 3 özel çözüm.
- Kravat Trakea örgülü ipek (4.0 USP) ile kapalı. Hemen altında kanül, ekleme noktasını Trakea etrafında iplik yerleştirin ve basit bir yukarıdan aşağı düğüm güvenli. Özel kuvvetlendirmek için akciğer çevresinde buz gibi PBS yönetmek. Akciğer ve kalp makas ve künt diseksiyon kullanarak göğüs boşluğuna bir blok olarak kaldırın. Her akciğer tek tek kaldırmanız ve sonra onları saptamak için 2 16 h % PIP veya formalin 4 ° C.
- Örnekler doku kesit kadar 4 ° C'de PBS içinde saklayın. Akciğer dokusu elde etmek için bu yöntemleri yukarıda açıklanan 13 olmuştur.
- Akciğer doku hazırlamak için örnekler aşağıdaki adımları kullanın.
- Düzeltme akciğer dokuları (3.1 adımda rezeke) doku % 10 formalin oda sıcaklığında 24 h için doğal arabelleğe alınmış. Aktarım için % 75 etanol ve 12 h döngüsü (2.5 s %75 alkol, 3 h mutlak alkol, Çözücü 3B ve 3 h parafin için 3,5 h) doku işlemcide koymak.
- Embed içinde oda sıcaklığında saklanan formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) blok oluşturmak için standart parafin.
Not: Bu aşamada, akciğer bölümler standart slaytlar için kesmek genellikle uygun. - 4-5 µm kalınlık bir microtome kullanarak FFPE akciğer bölümleri kesme ve ücret, daha önce O tarafından açıklandığı gibi kaplanmış slaytlar üzerinde monte ' Sullivan vd. 7
- Slaytlar bağlamak, 60 x 24 mm coverslips (boyutu 1,5) Montaj orta 3 damla koymak, slayt coverslip üzerinde ters çevir ve aşırı orta itmek için. Hermetik oje ile mühür ve mağaza oda sıcaklığında.
4. Hazırlık/mikroskobu Akciğer doku örneklerinin
- de-wax, suyla temasa ve FFPE Akciğer doku örneği antijen alma çözümü ile pretreat için
- .
60 ° C'de 60 dk için FFPE
- fırın kuru slaytlar Sonra slaytlar Ksilen çözüm 30 dk ve transfer için % 70 etanol çözüm oda sıcaklığında 5 min için koymak. Musluk suyu durulama.
- Yer ısı geçirmez plastik wrap ve HIER-antijen alma bir düdüklü tencere 10 10 dk içinde tabi m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. 5 min bir rock'çı, sonra bir kez PBS ile rocker için musluk suyundaki iki kez 20 dk. yıkama için serin.
- % %5 10 tavuk serum ile blok BSA/PBS, oda sıcaklığında 30 dk için.
- Doku leke.
- METs makrofajlar tanımlamak, birincil antikorlar (MMP-9, H3Cit ve F4/80) % 1'eklemek için BSA/PBS 1/100 seyreltme (antikor tutarlarla ilgili belirli ayrıntıları Malzemeler tablo içinde listelenen) yönü 4 ° C'de 16 h için. Bir rocker üzerinde 5 min için PBS ile iki kez yıkayın. %1
- elde floresan algılama ile ilgili ikincil kuluçka tarafından antikor BSA/PBS 40 dakika oda sıcaklığında. Antikor vardır: (1) tavuk Anti-fare 488 (yeşil), (2) tavuk Anti-keçi 594 (kırmızı) ve (3) eşek Anti-fare 647 (çok kırmızı).
- PBS ve montajı ile Kromatin boyama için montaj orta DAPI içeren bölümlerde yıkayın.
- Floresan görüntü ters bir mikroskop bağlı kafa tarama confocal lazer kullanarak elde.
- Excite 405, 488, 561 ve 647 hazırlıkla nm lazerler. Çizgi-sıralı üzerinde tıklatarak tek uçak 512 x 512 piksel görüntü yakalama, 20 X 0,1 kullanarak (2 satır ortalama) düğme tesviye NA hava ve 40 X 1.0 NA petrol hedefleri.
- Elde etmek için analiz bölümüne ve veri (örneğin, 10 yüksek güçlü alanları bakış açısı (HFOV) denetimi, uyarılmış örnek, vb, her fare için 10) her sonuç için başına en az on alanları bakış.
Not: tüm alanı temsil edici bir örnek almak için bir matris sistemi hangi alanı ayrılmıştır kullanılabilir içine farklı bölümler ve aynı matris görüş alanları seçmek için kullanılan farklı her örnek için (örneğin, alan 9 bölümlere ayrılabilir ve merkezi ve 4 köşe, iki HFOV alınır).
5. Üç boyutlu (3-D) görüntüleme, METs
Not: METs 3-b yapılardır gibi birden çok z-yığın alarak yeniden, görüntüler, değerli bilgiler verebilir.
- 200 µm 1.8 mm ve hız 0.1-0,5 olarak ayarlamak bir genlik adlı bir vibratome kullanarak, parafin blok gelen akciğer numuneler bölümünde mm/s.
- Blok akciğer dokusu ile ilgili serum (% 10 fetal buzağı serum ve % 10 tavuk serum) % 20'si ve takıma PBS ve %3,75 permeabilize Triton-X 100 nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında 7 h için.
- Bölümleri ile ilgili birincil antikorlar (MMP-9, H3Cit ve F4/80) 4 ° C'de 16 h için microcentrifuge tüpler (antikor konsantrasyonları Malzemeler tablo içinde listelenen) 200 µL cilt leke.
- PBS, 1 h için oda sıcaklığında ilgili ikincil antikorlar ile kuluçka önce 10 dakika için 3 kez bölümlerde yıkama
- Kapak paket fişi için mikroskop ekleme PBS içinde slaytlar önce akciğer bölümler 20 dk, çözüm DAPI (1:5, 000) için leke.
- 405 ile donatılmış bir confocal ters mikroskop (40 x 1.3 NA) kullanarak floresan görüntü elde nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm ve 635 nm lazerler.
- 3-b z-yığınları 0,54 µm kalınlık 40 x 1.3 NA petrol amaç için en iyi z kesit ile rekor.
Not: kullanılan yazılım bireysel mikroskop bağlı olarak değişir. Nasıl belgili tanımlık bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış için bir mikroskop bir örneği ek dosya 1 ' de sağlanan.
6. Görüntü analizi
Not: analiz örnekleri belirli görüntüleme analizi yazılımı kullanımı gerektirir ve örnekler Malzemeler tablo içinde listelenir. Analiz sonuçlarının kullandığınız belirli programa bağlıdır iken, listelenen aşağıdaki önemli noktalardır.
- Mavi kanal DAPI için seçerek ve hücrelerin en az boyutu atama BAL analiz örnekleri
- tanımla makrofajlar sayısı (örneğin, > çapı 18 µm). İlgili yazılım kullanarak makrofajlar her alanı için toplam sayısını ölçmek.
- Hücre dışı Kromatin DAPI tarafından diğer işaretleri (örneğin, MMP12, PAD2 ve H3Cit) Co ifade ile tespit varlığı ile bir MET özelliklere sahip hücreleri say.
Not: Analiz edilebilir işaretleri sayısı lazerler kullanılabilir sayısına bağlıdır, ancak ideal DAPI ek olarak, en az iki başka işaretleri dahil edilmelidir. Diğer daha az belirli parametreleri MET ifade (örneğin, hücreleri ekstrasellüler Kromatin ve genişlemiş bir çekirdeğe sayısı) için kullanılabilir. - BAL MET ifadede karşılaştırmak için en az 100 BAL makrofajlar örnek başına örnekleri (Denetim arasında duman, duman/Dnaz tedavi grupları), analiz. İkincil antikor ve izotip ölçmek için
- kontrol Floresans düzeyde; en az 100 her örnek için onların Floresans hücrelerde ölçmek. Arka plan floresan (örneğin, H3Cit) her işaretçi için ortalama düzeyini ölçmek standart yazılım kullanarak.
- MET ifade, tanımlamak için tipik fenotip (örneğin, H3Cit ve MMP9 ortak ifadesi ile hücre dışı Kromatin) içeren hücreleri saymak ve her MET Floresans işaretleri (örneğin, H3Cit ve MMP9) düzeyini ölçmek. Eğer onların boyama arka plan ve izotip kontrol değildi METs üreten hücreleri dışlamak.
- İnsan BAL örnekleri için en az 100 hücre METs yapmak makrofajlar yüzdesi için her örnek için analiz. Fare örnekleri için hücreleri daha küçüktür ve METs daha sert tanımlamak için olarak, daha büyük bir sayı (örneğin, 200 makrofajlar) her örnek için hücre analiz.
- Analiz Akciğer doku örnekleri
- METs huzurunda Akciğer doku belirlemek için belirli makrofaj marker F4/80 gibi kullanın.
- 6.1 bölümünde listelenen diğer parametrelerle ekstraselüler Kromatin hızlı hücrelerdeki F4/80 co lokalizasyonu kullanarak akciğer dokusunda METs varlığı tanımlayın.
- Arka plan Floresans örneklerinde ile ikincil antikor düzeyleri ve izotip denetimlerini belirler. Arka plan üstüne olmayan analiz METs dışlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
METs BAL örneklerinden, akciğer dokusu ve 3-b görüntülerle daha kalın akciğer bölümlerde görüntülenmeyecektir. Bir BAL örnek görüntülenir METs örneği şekil 1' de gösterilen. METs morfolojisi olgunlaşma onların sahne göre değişir. Mikroskobu ilk tespit özelliğini hücrenin kenarını çekirdeğine harekettir. Bu H3Cit ve granül proteaz gibi diğer ortak ifade arabulucu ile hücre dışı Kromatin tarafından takip ediyor. Önceki aşamada hücre hala ifade ekstraselüler tuzak ile kabaca küresel bir şekli vardır. Daha sonraki aşamalarında, MET oluşumu hücre gövdesi uzama ile karakterizedir.
Akciğer dokusu METs Şekil 2' de gösterilmiştir. Akciğerleri sıvı ile akciğer mimarisi tanımlamak için şişirilmiş gibi METs genellikle alveoler duvarlara karşı itti. METs morfolojisi da bağlı olarak uçak doku kesildi değişecektir. Akciğer doku örnekleri için kullanılan standart bölümler 4-5 µm kalınlığında olan. Alınması gereken birden fazla resim daha kalın doku bölümleri etkinleştirmek ve METs daha sonra 3 boyutlu görülebilir. Antikor sadece defa akciğer dokusu içine nüfuz ve 25-50 µm bölüm kalınlığı en uygunudur. 3 boyutlu bir görüntü örneği şekil 3 ve Video 1gösterilir.
Şekil 1: BAL METs. İnsan BAL METs geliştirme farklı aşamalarında stimülasyon sonra kurdu. METs ekstraselüler Kromatin H3Cit ve MMP9 ortak ifadesi ile karakterize. (A)Kromatin, (B) H3Cit, (C) MMP9 ve (D) için Birleştirilen görüntüyü boyama. Paneli ekler izotip denetimleridir. Ölçek çubukları 10 µm (izotip için 15 µm) =. Bir İngiliz kontu sahne MET sağ üst köşede gösterilir ve kabaca küresel bir şekli vardır. Daha olgun bir MET tarlanın ortasında gösterilir. Görüntüleri tarama confocal mikroskop ve 40 x 1.0 NA petrol objektif bir lazer kullanarak alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Akciğer doku METs. Fare METs Akciğer doku stimülasyon sonra. METs ortak ifade H3Cit, MMP9 ve F4/80 ile hücre dışı Kromatin (makrofaj marker olarak) ile karakterize. Paneli(a)bir tipik yüksek güçlü Metler sayısını ölçmek için kullanılan görüş alanı gösterir; Paneller (B-F) kesik kare alanı daha yüksek büyütme altında göster. (B) Kromatin, (C) H3Cit, (D) MMP9, (E) F4/80 ve (F) için Birleştirilen görüntüyü boyama. INSERT izotip kontrol paneldir. Ölçek çubukları 20 µm (izotip için 20 µm) =. METs genellikle alveoler duvarlara karşı itilir. Görüntüleri tarama confocal mikroskop ve 40 x 1.3 NA petrol objektif bir lazer kullanarak alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: üç boyutlu görünümü akciğer bölümünün. Fare Akciğer doku sabit ve 25-35 µm kalınlığında bölümlere kesti. Doku işaretleri ile METs için etiketli ve 1 µm kalınlık bölümleri ile görüntüsü. Görüntüleri bir z-bir MET 3 boyutlu bir resmini oluşturmak için yığın ile kombine edilmiştir. Görüntüleri tarama confocal mikroskop ve 40 x 1.3 NA petrol objektif bir lazer kullanarak alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Video 1: üç boyutlu görünümü akciğer bölümünün. Video örnekleri şekil 3' te sunulan karşılık gelir. Eksen keneler 5 µm. lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu derlemede açıklanan yöntemi tabanlı ağlar14varlığı tanımlamak için kullanılan tarih. Makrofajlar tarafından çok BAL örneklerinde baskın hücre tipi vardır ve bu yöntem koleksiyon METs eğitimi için özellikle uygundur. Kırmızı kan hücreleri içinde BAL varsa, bu hücreleri amonyum klorür kullanarak lysed. BAL yordam genellikle makrofajlar devreye giriyor ve bu nedenle bu METs un uyarılmış örnekleri mevcut olacak bekleniyor. BAL makrofajlar genellikle çok yapışık. Bu hücreler baskın hücre tipi vardır ve aynı zamanda onların morfolojisi tarafından ayırt edilebilir gibi BAL makrofajlar genellikle belirli bir işaretleyici gerek kalmaz. Genellikle bir BAL, hücrelerin % 80'i makrofajlar (ve nötrofil % 5'den az), büyük ve sonra birden çok yıkar, genellikle sadece yapisan lökosit (Yani, makrofajlar)6kalır. İnsanlarda nötrofiller makrofajlar ayırmak için yetenek hakkında şüphe varsa, nötrofil bir işaretleyici nötrofil elastase gibi kullanılabilir. Akciğer dokusunda makrofaj diğer hücre türlerinden ayırt etmek zor olduğu gibi bir belirli makrofaj işaretleyici (örneğin, F4/80) gereklidir. Arka plan ve izotip denetimlerini önemlidir bu yüzden makrofajlar otomatik Floresans var; Bu özellikle teşvik örnekleri ile durumdur.
METs varlığı tanımlamak için en iyi yolu belirlenecek kalır. Belirli yolları/süreçler, nötrofiller ve makrofajlar için ortak olan vardır: (1) taneli proteaz, Histon ve PAD (3) citrullination (2). PAD2 monosit/makrofajlar içinde daha belirgin iken PAD4 nötrofiller için daha belirlidir. Fare makrofajlar, iyi kabul edilen avans F4/80 kullanılır ama insan makrofajlar gibi iyi tanımlanmış işaretleri var mı ve bu insan Akciğer doku MET ifade değerlendirirken sorunları oluşturabilecek. MET ifade akciğer dokusunda analiz birçok hücre türleri ve METs alveoler duvarlar basılması eğilimi olarak daha zor olabilir. Ne zaman onlar are düz kesit doku bölümleri analiz ederken, METs en iyi görüntülenir; METs bir MET olup olmadığını belirlemek zor olabilir farklı bir düzlemde ise mevcuttur. Bu sorunu bir ölçüde METs ve farklı yönleriyle METs görselleştirmek için potansiyel incelenmesi için daha derin doku (3-b) uçaklar etkinleştirmek için z-yığınlar yaparak ele alınması.
METs varlığı akciğer örneklerinde tanımlamak için iyi kabul edilen bir yöntem değil. Açıklanan yöntemleri ağlar görüntülenmesi için kullanılan temel alır. Chow vd. mitojenle PMA makrofaj hücre kültürünü METs indüklenen hücre dışı Kromatin15varlığı ile değerlendirildi olarak nitelendirdi. Bir sonraki çalışma Mycobacterium tüberküloz METs in vitro hücre dışı Kromatin ve H3Cit16varlığı tarafından tanımlandığı gibi indüklenen gösterdi. Biz manken glomerülonefrit, METs mevcut ortak yerelleştirilmiş Kromatin, Histon ve myeloperoxidase7tarafından tanımlandığı şekilde böbrek vivo göstermiştir. Son olarak, hücre dışı Kromatin ve MMP126birleşimiyle METs vitro insan akciğer makrofaj olarak varlığını göstermiştir. Bizim yöntem diğer müfettişler tarafından inflamatuar yanıt bu önemli faset araştırma için kullanılabilir.
METs önemli bir rol kronik enflamatuar hastalığı olduğu kabul edilecektir muhtemeldir. Hala iyi tanımlanmış NETosis için yol işlemlerdir. METs çalışmanın önemli anlayışlar içine tuzak oluşum mekanizmaları sağlayabilir. Daha fazla geliştirme daha fazla işaretçileri olan iletişim kurallarının ve METs fonksiyonel çalışmaları METs rolü hastalığında tanımlayabilirsiniz.
Biz bu protokol için belirledik kritik adımlar vardır. İnsan BAL örnekleri ikincil bakteriyel kontaminasyon olması muhtemeldir ve kültür orta antibiyotik kullanımı kirlenme sınırlandırmak için önemlidir. Birincil ve ikincil antikor bile ile aynı üreticinin kendi Floresans değişebilir. Son olarak, akciğer doku örnekleri analiz daha BAL örnekleri daha karmaşıktır ve standartlaştırılmış bir yaklaşım geliştirmek için zaman gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ile ilgili olarak bu işi yapmak için hiçbir açıklamalar var.
Acknowledgments
Bu eser hibe Monash Üniversitesi, Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi ve Monash akciğer ve uyku Enstitüsü tarafından finanse edildi. Yazarlar Imaging confocal mikroskobu ile Klinik İmmünoloji Monash sağlık, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass ve Camden Lo, Monash mikro Imaging (MMI) personel yardım için teşekkür etmek istiyorum ve yazarlar MMI İmkanları kabul Monash Üniversitesi. Yazarlar imkanları ve Monash Histoloji platformu bilimsel ve teknik yardım kabul edersiniz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
