Summary
Макрофагов внеклеточного ловушки являются недавно описан сущности. Эта статья будет сосредоточена на confocal микроскопии методов и как они отображаются в пробирке и в естественных условиях от образцов легких.
Abstract
Основной метод, используемый для определения присутствия нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки) является confocal микроскопии. Мы изменили методы установленных confocal микроскопии визуализировать макрофагов внеклеточного ловушки (Мец). Эти внеклеточные ловушек определяются наличием внеклеточного хроматина с одним выражением других компонентов, таких как зерно протеаз, citrullinated гистонами и peptidyl arginase deiminase (PAD). Выражение Мец обычно измеряется после воздействия на раздражитель и по сравнению с ООН стимулировали образцов. Образцы также включены для фона и изотипа управления. Клетки анализируются с помощью программного обеспечения для анализа четкие изображения. Конфокальная микроскопия может использоваться для определения присутствия Мец как in vitro , так и в естественных условиях в легочной ткани.
Introduction
Нейтрофильные внеклеточного ловушки (сетки), были впервые описаны, Бринкманн et al. 1 они преимущественно производятся в ответ на инфекцию (особенно для бактерий) и имеют важную роль в принимающей обороны1,2. Они также были описаны в ответ на неинфекционных заболеваний, в том числе васкулит и системная красная волчанка (СКВ); и с Митоген phorbol 12-myrisate 13-ацетат (PMA)2,3. Недавно было признано, что другие типы клеток может также производить внеклеточные ловушки, включая макрофагов. Внеклеточные ловушки макрофагов (Мец) еще не четко определенной сущности в литературе4,5. Недавно мы создали методы для обнаружения присутствия Мец как in vitro и in vivo6,7. В этой статье будут описаны измерения с помощью конфокальной микроскопии Мец.
Основные черты NETosis, которые отличают его от других сотовых пути (например, апоптоз8) экструзии хроматина в сочетании с: (1) citrullination гистонами (H3Cit)9, (2) совместно выражение гранул протеаз10 и (3) участии peptidyl аргинин deiminase (PAD) 411,12. Макрофаги также выразить H3Cit, гранул протеаз и PAD, и эти функции могут использоваться для определения присутствия Мец.
Мец может иметь особенно важную роль в легких, как макрофагов является доминирующей в альвеолы и авиалинии легкя и первоначальный роль в управлении клеточный иммунный ответ на инфекции/воспаление. Кроме того в то время как большая часть легких является пустое пространство (например, в альвеолы), Мец потенциально способны расширить пространство, в отличие от солидных органов.
Наиболее широко используемый метод для определения наличия сетей является confocal микроскопии. Четко определенный способ измерить Мец еще не существует. Техника для измерения сеток была адаптирована для измерения присутствия Мец в настоящем Протоколе. Основные требования для данного метода являются доступ к confocal микроскопии и соответствующих изображений программное обеспечение для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
этот протокол следует эксперименты, утвержденных в: (1) люди Комитет этики Монаш медицинский центр, и (2) животных Комитетом по этике университета Мельбурна.
1. макрофаги Бронхоальвеолярный лаваж (BAL)
- использования бал для получения легких макрофагов в: (1) человека предметов, бронхоскопия 6 и (2) мышах с использованием внутри трахеи стремление 13 .
Примечание: Приобретение макрофаги обычно вызывает некоторые активации этих клеток. Макрофаги получаются от пациентов, которые требуют бронхоскопии расследовать потенциальные медицинские проблемы, и не все предметы могут быть пригодны для анализа Мец (это нужно будет определяться для каждого конкретного проекта).- Взять на бал решения и спин вниз (500 x g 10 мин) в форме гранул, мыть дважды с питательной среды (Розвелл парк Мемориальный институт среднего (RPMI) с сывороткой плода теленка 5% и 1% L-глютамин) при комнатной температуре и затем разбавить клетки в 4 мл medi культуры ум.
- В случае необходимости, запросить официальное дифференциальных игр; большинство клеток (обычно > 80%) будет макрофаги 6.
Примечание: Это будет обычно осуществляться клинические гистология службы с использованием морфологических появление клеток разных типов 6. - Выполнять жизнеспособной макрофагов ячейки рассчитывать на бал решения, с помощью исключения Трипановый синий и Горяева.
Примечание: Бал получено решение от людей и мышей как упомянуто на этапе 1.1. - Добавить 1-4 x 10 5 макрофагов в 24-ну пластины на coverslips в 500 мкл питательной среды на колодец и оставить на ночь при 37 ° C; клетки будут придерживаться coverslips. Для человека образцов, добавить антибиотики (например, пенициллина и стрептомицина, 10 4 ед/мл) для предотвращения бактериального загрязнения.
2. Маркировка/иммунофлуоресценции макрофагов бал
Примечание: клетки соблюдаются на coverslips, как упомянуто выше.
- Удалить питательной среды и вымыть клетки один раз с-фосфатный буфер (PBS). Исправить клетки в 2% параформальдегида/Периодат/Лизин (ПЛП) фиксатором для 10 мин
- Мыть клетки кратко в PBS и затем разрушения в 0,2% 20 анимации в PBS на 20 мин
- Блок клеток с 10% курица Сера в 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) разводят в PBS на 30 мин Антитела
- инкубировать с начальной и изотипа управления за 1 ч при комнатной температуре в концентрации 1: 100 (более подробные сведения приведены в Таблице материалов) при 37 ° с.
Примечание: Для образцов бал, конкретные маркер макрофагов обычно не требуется. - После добавления первичных антител, вымыть клетки в PBS, далее и инкубировать и с соответствующими вторичные антитела для 40 мин при комнатной температуре.
- Мыть в подразделах PBS и горе с среднего на основе DAPI монтажа для визуализации с помощью конфокального микроскопа (как упоминалось выше) в лазерной возбуждений 405, 488, 561 и 647 Нм и 40 X, 1.0 NA масло цель.
3. Образцы тканей легких
Примечание: в vivo исследований легочной ткани, изучение образцов после соответствующего воздействия (например, как описано в O ' Салливан и др. 7). экспозиции, которая является наиболее актуальной для этого эксперимента являются инфекционные микроорганизмы, особенно бактерии. Мышь штаммов, которые могут быть использованы для данного метода являются мышей C57BL/6 или BALB/c, 10-12 недель, вес 25-30 г и мужчины.
- Euthanize мышей, через внутрибрюшинного введения кетамин (400 мг/кг) и ксилазина (40 мг/кг). Откройте грудной полости и разоблачить легких и сердца с помощью Щипцы хирургические и ножницы.
- Влить теплую PBS с помощью 21-иглы в правый желудочек промыть крови из сосудов для 30 сек, затем влить 10 мл 2% ПЛП фиксатором для 30 s (в правый желудочек).
- Использовать теплый PBS (42 ° C) для промывания открытой грудной полости. Интубации трахеи с 21-иглы и кусок трубы 0,8 мм, нарезанные по размеру и придать 800 мкл подогретым (до 42 ° C), легкоплавких пункт 3% раствор агарозы.
- Галстук покинуть трахеи с плетеные шелковые (4.0 USP). Поместите нить вокруг трахеи, чуть ниже точки вставки канюля и закрепите его через простой зашитый узел. Чтобы укрепить агарозы, администрировать ледяной PBS вокруг легких. Удаление легких и сердца как блок из грудной полости, используя ножницы и тупым рассечение. Удаление каждого легкого индивидуально и исправить их для 16 h в 2% ПЛП или формалина в 4 ° C.
- Хранить образцы в PBS на 4 ° C до разрезания ткани. Эти методы для получения легочной ткани были ранее описанных 13.
- Подготовить легочной ткани образцы выполните следующие действия.
- Исправить ткани легких тканей (резецируется шаге 3.1) в природных амортизированное формалина 10% за 24 ч при комнатной температуре. Трансфер в 75% этанола и положить в процессоре ткани на 12 h цикла, (2,5 ч в 75% EtOH, 3 h в абсолютной EtOH, 3.5 h в жидкостной 3B и 3 h в парафин).
- Вставить Стандартный парафин для создания формалин исправлена, парафин врезанных блоков (FFPE), которые хранятся при комнатной температуре.
Примечание: На данном этапе, это обычно удобно вырезать легких разделы для стандартных слайды. - Сократить разделы легких FFPE толщиной 4-5 мкм, используя микротом и смонтировать на обвинение, покрытые слайды, как описано ранее, O ' Салливан и др. 7
- монтировать слайды, положить 3 капли среднего монтажа на coverslips 60 x 24 мм (размер 1.5), инвертировать слайд на coverslip и вытолкнуть превышение среднего. Герметично печать с лаком и хранить при комнатной температуре.
4. Подготовка/микроскопия образцов ткани легких
- де воск, увлажняет и предварительной обработки образца ткани легких FFPE антигена поиска решения.
- Печь сухой FFPE горки для 60 мин при 60 ° C. Затем положите слайды в ксилоле решение для 30 мин и передачи 70% этанола раствор для 5 мин при комнатной температуре. Промыть в воде из крана.
- Место в жаропрочной пластиковой пленкой и при условии получения HIER-антигена в скороварке 10 мин в 10 м/моль/Л трис, 1 ммоль/ЭДТА рН 9,0. Cool для 20 мин мыть дважды в проточной воде в течение 5 мин на рокер, затем один раз с PBS на качалку.
- Блок с курицей 10% сыворотки в 5% BSA/PBS на 30 минут при комнатной температуре.
- Пятно ткани.
- Определить Мец в макрофагах, добавить первичного антитела (MMP-9, H3Cit и F4/80) в 1% BSA/PBS для 16 ч при температуре 4 ° C при разбавлении 1/100 (конкретные сведения о суммах антитела, перечислены в Таблице материалов). Мыть два раза с PBS для 5 мин на рокер.
- Достичь Флюоресцентная детекция инкубации с соответствующей средней антител в 1% BSA/PBS для 40 мин при комнатной температуре. Антитела являются: (1) курица анти мышь 488 (зеленый), Коза (2) курица анти 594 (красный), (3) осла анти мышь и 647 (далеко красный).
- Мыть в подразделах PBS и горе с DAPI-содержащих монтажа средних для окрашивания хроматина.
- Получения флуоресцентных изображений с помощью Конфокальная лазерная сканирующая головка, придает инвертированным микроскопом.
- Excite подготовку с 405, 488, 561 и 647 нм лазеры. Захватить один самолет 512 x 512 пикселей изображения, нажав на линии последовательный, выравнивание кнопки (2 линии в среднем) с помощью 20 X 0.1 NA воздуха и 40 X 1.0 NA масло целей.
- Получить по крайней мере десять полей зрения на секцию для анализа и данных для каждого результата (т.е., 10 мощных поля зрения (ВОВЛ) для элемента управления, 10 для стимулировали образца, и т.д., для каждой мыши).
Примечание: Для получения репрезентативной выборки поля целиком, матричная система может использоваться в котором поле делится на различные разделы и для каждой другой образец, же матрица используется для выбора поля зрения (например, поле можно разделить на 9 разделов, и от центра и 4 углах, принимаются два ВОВЛ).
5. Трехмерной (3-D) Imaging Мец
Примечание: как 3-D структуры, Мец, принимая несколько z стек изображений, которые являются восстановленный, может дать ценную информацию.
- Раздел образцов легких от парафиновых блоков, на 200 мкм, с помощью vibratome в амплитуде в 1,8 мм, скорость 0,1-0,5 мм/s.
- Блок легочной ткани с 20% соответствующих сыворотки (10% плода телячьей сыворотки и куриные 10% сыворотки) и затем разрушения в PBS дополнены и 3,75% Тритон-X 100 для 7 ч при комнатной температуре под нежным агитации.
- Пятна в разделах 16 ч при температуре 4 ° C с соответствующих первичных антител (MMP-9, H3Cit и F4/80) в 200 мкл томах в microcentrifuge трубы (концентрации антитела, перечислены в Таблице материалах).
- Вымойте разделы в PBS, 3 раза за 10 мин до инкубации с соответствующими вторичные антитела при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Пятно легких разделы для DAPI (1:5, 000) в растворе для 20 минут, прежде чем Добавление обложки скользит в Микроскоп слайды в PBS.
- Получить флуоресценции изображения с помощью Перевернутый конфокального микроскопа (40 x 1.3 NA) оснащены 405 нм, 440 Нм, 473 Нм, 543 Нм и 635 нм лазеры.
- Запись 3-D z стеки 0,54 микрон толщины с оптимальной z секционирование для цели нефти NA 40 x 1.3.
Примечание: Программное обеспечение, используемое будет варьироваться в зависимости от индивидуальных микроскопа. Пример как программное обеспечение может использоваться для одного Микроскоп приводится в дополнительных файлов 1.
6. Анализ изображений
Примечание: анализ образцов требует использования конкретных изображений программного обеспечения анализа и примеры перечислены в Таблице материалов. Хотя анализ результатов будет зависеть от конкретной программы используется, перечисленные ниже моменты важны.
- Анализ бал образцы
- определить количество макрофагов, выбрав синий канал для DAPI и назначение минимальный размер для ячеек (например, > 18 мкм в диаметре). С помощью соответствующего программного обеспечения, измерять общее количество макрофагов в поля.
- Подсчитать количество ячеек, которые имеют функции ВСТРЕТИЛ наличием внеклеточного хроматина, обнаруженных DAPI с одним выражением других маркеров (например, MMP12, PAD2 и H3Cit).
Примечание: Количество маркеров, которые могут быть проанализированы зависит количество лазеров доступно, но в идеале помимо DAPI, по крайней мере два других маркеры должны быть включены. Другие менее конкретные параметры для ВСТРЕТИЛ выражение (например, количество ячеек с внеклеточного хроматина и расширенного ядро) может быть использован. - Сравнить ВСТРЕТИЛ выражение в BAL образцы (между управления, дыма и дыма/DNase рассматриваться группами), анализировать как минимум 100 бал макрофагов на сэмпл.
- Для измерения вторичного антитела и изотипа контролировать уровни флюоресценции; измерить минимум 100 клеток в каждом образце для их флуоресценции. Измерить средний уровень фона флуоресценции для каждого маркера (например, H3Cit) с помощью стандартного программного обеспечения.
- Для определения выражения MET, подсчитать количество ячеек с типичной фенотипу (например, внеклеточная хроматина с одним выражением, H3Cit и MMP9) и для каждого MET, измерить уровень флюоресценции маркеров (например, H3Cit и MMP9). Исключить клетки, вырабатывающие Мец, если их окрашивания не был выше управления фон и изотипа.
- Для человека бал образцов, анализировать как минимум 100 клеток для каждого образца для процент макрофаги, которые делают Мец. Для мышиных образцов, как клетки меньше и Мец труднее определить, анализировать большее количество клеток для каждой выборки (например, 200 макрофаги).
- Анализ образцов ткани легких
- для определения наличия Мец в легочной ткани, используйте маркер конкретных макрофагов например F4/80.
- Определить наличие Мец в легочной ткани с помощью совместного локализации F4/80 в клетках, которые выражают внеклеточного хроматина с другими параметрами, перечисленных в разделе 6.1.
- Определяют уровни фона флуоресценции в образцах с вторичные антитела и изотипа элементов управления. Исключить из анализа, что не выше фона Мец.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мец могут быть визуализированы бал образцов, в легочной ткани и в толще секций легких с 3-D изображения. Пример Мец, визуализируется в BAL образец показан на рисунке 1. Морфология Мец будет зависеть от стадии их созревания. Первая особенность обнаружению по микроскопии это движение ядра к краю ячейки. Это сопровождается внеклеточного хроматина с другими совместно выразили посредников, таких как H3Cit и гранул протеаз. На более ранних этапах ячейка по-прежнему имеет примерно сферическую форму с внеклеточного ловушку выразил. На более поздних этапах формирование ВСТРЕТИЛ характеризуется удлинение тела клетки.
Легочной ткани Мец показаны на рисунке 2. Как легкие завышены с жидкостью для определения архитектуры легких, Мец вообще быть толкнул стенках альвеол. Морфология Мец также будет меняться, в зависимости от которых плоскость ткани был сокращен. Стандартные разделы, используемые для образцов ткани легких являются 4-5 микрон в толщину. Толстые разделов ткани позволяют несколько изображений, которые необходимо принять, и Мец затем можно будет просмотреть в 3-D. Антитела пока только проникает в ткани легких и секции толщиной 25-50 мкм является оптимальным. На рисунке 3 и в видео 1приведен пример 3-D изображения.
Рисунок 1: Мец BAL. Человека бал Мец, образовавшихся после стимуляции на разных стадиях развития. Мец характеризовались внеклеточного хроматина с одним выражением, H3Cit и MMP9. Пятнать для chromatin (A), (B) H3Cit, MMP9 (C) и (D) объединенного изображения. Вставки панели являются изотипа элементы управления. Масштаб баров = 10 мкм (15 мкм для изотипа). Ранней стадии ВСТРЕТИЛ показан в правом верхнем углу и имеет примерно сферическую форму. Более зрелые ВСТРЕТИЛ показано в середине поля. Изображения были взяты с помощью лазерного сканирования Конфокальный микроскоп и цель нефти NA 40 x 1.0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: легочной ткани Мец. Мышиных Мец в легочной ткани после стимуляции. Мец характеризовались внеклеточного хроматина с одним выражением H3Cit, MMP9 и F4/80 (как маркер макрофагов). Панель (A) показывает типичный мощных поле зрения используется для измерения количества Мец; Панели (FB–) показывают пунктирной площади под большим увеличением. Пятнать для chromatin (B), (C) H3Cit, (D) MMP9, (E) F4/80 и (F) объединенного изображения. Панель «Вставка» является изотипа управления. Масштаб баров = 20 мкм (20 мкм для изотипа). Мец обычно толкаемых против стенках альвеол. Изображения были взяты с помощью лазерного сканирования Конфокальный микроскоп и 40 x 1.3 NA нефти цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Трёхмерный вид легких секции. Легочной ткани мыши была фиксированной и нарезать на толстые секции 25-35 мкм. Ткань была помечены маркерами для Мец и образы с разделами в 1 микрон толщины. Изображения были объединены с z стека для создания 3-мерное изображение MET. Изображения были взяты с помощью лазерного сканирования Конфокальный микроскоп и 40 x 1.3 NA нефти цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1: Трёхмерный вид легких секции. Видео соответствует образцов, представленных на рисунке 3. Делений оси = 5 мкм. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный в данном обзоре основан на который используется для определения присутствия сети14. Макрофаги являются на сегодняшний день доминирующей ячейки типа в образцах бал, и этот метод коллекции особенно подходит для изучения Мец. Если красные кровяные клетки присутствуют в BAL, эти клетки должны анализироваться с использованием хлорида аммония. BAL процедура обычно активирует макрофаги, и поэтому ожидается, что будет Мец в ООН стимулировали образцов. BAL макрофаги обычно очень верна. BAL макрофаги обычно не нужно будет конкретным маркер как эти клетки являются доминирующим ячейки типа и может быть также отличают их морфологии. Обычно в бал, больше чем 80% клеток макрофагами (и нейтрофилов менее 5%) и после нескольких стирок обычно только приверженцами лейкоциты (то есть, макрофаги) остаются6. Если есть сомнения относительно способности различать макрофаги от нейтрофилов в организме человека, может использоваться маркер нейтрофилов например нейтрофилов эластазы. В легочной ткани маркер конкретные макрофагов (например, F4/80) требуется как макрофаги трудно отличить от других типов клетки. Макрофагов у auto флуоресценции, поэтому важно использовать фон и изотипа контроля; Это особенно касается стимулировали образцов.
Лучший способ определить наличие Мец еще предстоит определить. Конкретные пути/процессы, которые являются общими для нейтрофилы и макрофаги являются: (1) гранулированный протеаз, (2) citrullination гистонами, и (3) PAD. PAD4 более специфичен для нейтрофилов, в то время как PAD2 более видное место в моноцитов/макрофагов. Использование F4/80 является широко признанным маркера для мышиных макрофагов, но человека макрофаги не имеют таких четко определенных маркеров и это может создать проблемы при оценке человека легочной ткани для ВСТРЕТИЛ выражение. Анализируя ВСТРЕТИЛ выражение в легочной ткани может быть сложнее, как есть много других типов клеток и Мец клонат быть толкнул на стенках альвеол. При анализе разделов ткани, Мец лучше визуализируются когда они плоские в поперечном сечении; Если Мец в другой плоскости, это может быть трудно определить, если встретились присутствует. Эта проблема может решаться в некоторой степени, делая z стеки для включения более глубокие ткани (3-D) плоскости для изучения Мец и потенциал, чтобы визуализировать Мец в различных аспектах.
Не существует общепринятых метода для определения присутствия Мец в легких образцов. Описаны методы основаны на тех, которые используются для визуализации сетей. Чоу и др. описал Митоген PMA индуцированной Мец в линии клетки макрофагального, как оценивается наличие внеклеточного хроматина15. Последующие исследования показали, что туберкулез микобактерии индуцированной Мец в пробирке, как определяется наличием внеклеточного хроматина и H3Cit16. Мы показали в естественных условиях в модели гломерулонефрита, что Мец присутствуют в почках как определено совместно локализованных хроматина, гистонов и миелопероксидаза7. Наконец мы продемонстрировали наличие Мец в пробирке в легкое человека макрофагов сочетание внеклеточного хроматина и MMP126. Наш метод может использоваться другими исследователями для исследования этот важный аспект воспалительной реакции.
Вполне вероятно, что будут признаны Мец иметь важную роль в хронических воспалительных заболеваний. Процессы, которые приводят к NETosis до сих пор не четко. Изучение Мец может обеспечить значительное понимание механизмов формирования ловушку. Разработка протоколов с больше маркеров и функциональных исследований Мец далее будет определить роль Мец в болезни.
Есть важные шаги, которые мы определили в настоящем Протоколе. Образцах бал, скорее всего вторичного бактериального загрязнения и использования антибиотиков в среде культуры имеет важное значение для ограничения загрязнения. Первичных и вторичных антител может варьироваться в их флуоресцирование, даже с того же производителя. Наконец анализ образцов ткани легких является более сложным, чем образцы бал и требует времени для разработки унифицированного подхода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют не раскрытия сделать в связи с этой работой.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантов от университета Монаш, национального здравоохранения и медицинский исследовательский совет, Monash легких и сна института. Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников клинической иммунологии в Монаш здравоохранения, Джуди Callaghan, Алекс Фульхерий, Кирстин Elgass и Камден Ло в Монаш микро Imaging (MMI) за помощь с confocal микроскопии изображений, и авторы признают услуги MMI университета Монаш. Авторы признают, зал и научной и технической помощи Монаш гистология платформы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human samples: Primary antibodies | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | 1:100 concentration not quantifiable |
| Mouse anti-human MMP9 | Novus Biological | AB119906 | 1:200 ascites, no concentration given |
| Rabbit anti-human PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Sheep anti-human NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse samples: Primary antibodies | |||
| Goat anti-mouse MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rat anti-mouse F4/80 | In-house (hybridoma) | In house | 20 ug/ml |
| Sheep anti-human Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Mouse anti-human PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Super-frost plus slides | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Molecular probes | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Chicken anti-rabbit AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Chicken anti-rabbit AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Chicken anti-goat AF 594 | Life technologies | a-21468 | |
| Chicken anti-mouse AF488 | Life technologies | A-21200 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11018 | |
| Chicken anti-mouse AF 647 | Life technologies | A-21463 | |
| Donkey anti-sheep AF 594 | Life technologies | A-11016 | |
| Isotype control | |||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG1 | BD Bioscience | 550878 | |
| Rabbit IgG | In house | ||
| Mouse IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| Sheep IgG | In house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| C1 Confocal scanning microscope | Nikon | ||
| FV1200 Confocal scanning microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue sources | |||
| Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre | |||
| Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Natural formalin | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvent 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Coverslips 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Coverslips 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| c57 black 6 | Monash animal research platform (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
- Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
- Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
- Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
- Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).
